现代生物光学显微镜是一个苛刻的学科,越来越复杂的研究应用需要能够跟上步伐的仪器。多年来,生物学成像一直在朝着利用越来越多的生理相关系统进行实验的方向发展,而新技术使这种实验方法变得越来越可行。这样的系统,包括整个模型生物,组织外植体和三维(3D细胞培养物,还必须以小化干扰的方式成像,以保持其作为实验模型的生理完整性。在生物成像领域,光诱导的光损伤和光毒性长期以来一直是个问题,并且在组织的所有生物学水平上都可能对健康和功能产生大影响。因此,对此类大而敏感的标本进行成像需要一种有效的3D成像方法,以大程度地减少样品在光线下的曝光。
图1-照明和检测几何
LSFM的照明和检测几何形状与落射荧光相比的比较。(a)具有低数值孔径(NA)照明物镜的LSFM几何结构将光片投射到样品中。荧光由较高的NA检测物镜检测,该物镜垂直于照明物镜和投射的光片定向。(b)典型的镜射照明和检测几何形状,其中激发和检测均使用相同的物镜和光路进行。
光片荧光显微镜(LSFM)是平面照明技术家族不断增长的总称,该技术彻底改变了生物标本的光学成像方法。从根本上讲,通过将照明和检测光路解耦,可以实现LSFM技术,从而允许采用新颖的照明策略来优化仪器的光子收集效率,图1阐明了这一一般概念。以上。类似于传统的激光扫描显微技术,光片是通过将激光成形为双曲线的“照明片”或通过在横向方向上扫描弱聚焦的低数值孔径光束来近似形成的。重要的是,沿着与照明不同的轴执行检测,通常是在正交方向上执行,以通过小化来自散焦特征的荧光来大化检测效率。
使用标准的落射方法(即共焦和宽视场),照明和检测锥在轴向(z)方向上拉伸,从而不必要地激发了离焦荧光并降低了对焦信号的质量,如下图所示下面的图2。借助LSFM,可以将较低的照明强度与平面(或其他结构化)照明结合使用,以小的样本曝光量提供改进的信噪比(SNR),从而实现长时间高帧率成像。沿轴向扫描光片或样本可进行快速且微创的3D成像。
图2 -LSFM和落射荧光中的曝光
光片与传统镜面照明的比较。(a)由一对照明物镜提供的平面光片照明的示意图。(b)典型的广角照明,在物镜焦点深度以外有照明。(c)仅照射样品的一小部分,然后使用平面照明将其漂白。(d)落射照明导致照射的样本量大得多,其中大部分失焦并且使聚焦信号降级。LSFM可通过轴向限制照明来显着减少光致漂白和其他光毒影响。
轴向限制照明可显着减少光漂白和光毒性,从而可以在数天甚至数周内进行长期成像。然而,众所周知,LSFM难以实施,通常需要两个或多个物镜,非标准样品制备方案,困难的比对程序以及精心设计的工作流,以处理通过此类技术生成的大量数据(通常为TB级)政权)。LSFM大大受益的领域包括发育生物学/胚胎学,神经生物学,药物发现,植物生物学等。本文将回顾LSFM的基础知识(包括简要的历史),探讨其各种实现和应用,并深入研究样品制备的基本方面。
历史的角度
LSFM起源于1902年由化学家和实验物理学家Richard Adolf Zsigmondy和光学物理学家Henry Siedentopf率先发明的“超显微技术”。原始的超显微镜将太阳光聚焦在胶体金溶液的侧面照明中,并在与照明平面正交的方向上检测到由此产生的散射。与现有技术相比,该方法显着提高了SNR,从而使观察单个金分子成为可能。法国科学家让·佩林(Jean Perrin)将通过应用超显微技术绘制颗粒运动图来进一步推动西格蒙第的工作,从而为布朗运动提供了宝贵的证据。Zsigmondy因其在超显微技术和胶体溶液方面的工作而被授予诺贝尔化学奖。图3。多年以来,这种方法在很大程度上被遗忘了,平面照明在1960年代的显微显微技术中很少使用,正如“ Dynaphot”显微镜所普及的那样。
图3-理查德·西格蒙迪(Richard Zsigmondy)的超显微镜
理查德·西格蒙第(Richard Zsigmondy)的超显微镜的艺术家渲染图。照明器在右侧,显微镜在左侧,正交放置的照明物镜清晰可见。
平面照明与荧光显微镜的结合出现在1993年,当时华盛顿大学弗朗西斯·斯佩尔曼(Francis Spelman)实验室的Arne Voie和David Burns率先开发了正交平面荧光光学切片(OPFOS)显微镜,他们将LSFM用于豚鼠的成像和制图内耳耳蜗。Voie面临的挑战之一是富含钙的骨头的不透明性。钙原子强烈散射光,几乎不可能通过骨骼进行光学成像,但是可以使用10%(w / v)的EDTA水溶液将其除去。接下来,他们的小组应用了一种光学透明溶液,这种溶液已有100年的历史,被称为Spalteholz溶液,由多种油混合物组成,用于近似蛋白质的折射率。
Voie及其同事获得的图像与使用高灵敏度层析成像方法(例如X射线微计算机层析成像(μCT))获得的图像相当,但具有分辨软组织结构的出色能力。这很重要,因为Voie和同事正在尝试将毛细胞形态与听力损失相关联,因此需要能够以高保真度对组织成像。相关的μCT和OPFOS稍后将实现。请注意,Spelman小组的这项工作和以后的工作会将OPFOS视为一种层析技术,而不一定是一种用于解决亚细胞细节的技术,因为他们展示了10μm的横向分辨率和26μm的轴向分辨率以及非常宽的视野(FOV)。 1.5毫米(mm)x 1.5毫米。然而,尽管OPFOS取得了成功,但LSFM仍将是一种相对模糊的技术长达数年之久。
1994年,欧洲分子生物学实验室(EMBL)的Ernst HK Stelzer和Steffen Lindek发表了一篇论文,描述了一种新技术:共聚焦θ显微镜。该技术使用类似于现代LSFM系统的正交照明和检测光学器件,但作为点扫描共聚焦显微镜的一部分。照明和检测点扩展功能(PSF)仅在它们的共同焦点处重叠,因此与传统的共焦成像方法相比,轴向分辨率提高了3-4倍。
2002年,当Eran Fuchs及其同事应用“薄光片显微镜”(TLSM)来成像不受干扰的水生微环境(尤其是海水样本)时,LSFM引起了人们的新兴趣。尽管使用“薄”来描述光片,但尺寸与原始用于OPFOS的尺寸相似,光束腰围厚度为23μm,FOV为1 mm x 1 mm。他们的团队选择TSLM的主要原因之一是因为它允许他们用SYBR Green I对细菌进行复染,而无需随后从海水样品中滤出细菌以去除游离染料。TLSM被证明足够灵敏,可以使溶液中染料中的背景少的标记细菌成像。尽管共聚焦显微镜可以提供光学切片并减少背景,但TLSM可以提供卓越的采集速度和更高的SNR,
在2004年,Stelzer小组介绍了一种共焦theta技术的变体,该技术使用了平面光片和宽视场(而不是共焦)检测,并发表了他们的具有里程碑意义的论文,介绍了选择性平面照明显微镜(SPIM)。尽管SPIM与以前的产品相比在技术上差别不大,但真正的突破是将其应用于表达转基因GFP的模型生物的体内成像,包括自然透明的Medaka鱼Oryzias latipes中的GFP标记的肌肉,以及SPIM的胚胎发生。常见的果蝇果蝇使用GFP-moesin(质膜标记物)。迄今为止,LSFM受欢迎的应用之一是用于胚胎发生的荧光成像。SPIM的推出标志着LSFM的成熟迈出了非常重要的一步,因为LSFM发行后的几年将见证新技术和改进的爆炸式增长,我们将对此进行详细探讨。
光片
灯光表属性
也许在任何LSFM中重要的组件是光片本身,它可以采用原始SPIM技术使用的静态平面片的形式,也可以采用随时间推移近似光片的扫描光束的形式。每种方法都有其各自的优点和缺点,但是首先重要的是要了解轻薄板的一些基本属性。图4示出了本文讨论的不同类型的光片和重要参数。
首先,不可能创建一个完美的平面光片,因为只能近似地且只能在给定的范围内。轴向分辨率终受光片的厚度和检测物镜的NA限制。静态平面光片和扫描光片在xz平面(图4)中都具有双曲线轮廓,光束腰围(w0)指定照明轮廓中紧密聚焦的中点的厚度,并使用以下公式计算:
其中w0是束腰厚度,f是照明光学器件的焦距,λ是照明光的波长,Dlens是照明光学器件的光阑。特别需要关注的是光片的共焦参数(b),该参数定义了可以说光片提供近乎均匀的平面照明的距离,光束光束的厚度在光束腰部并扩展到共焦参数的任一边缘。 。从中心到束腰变厚的距离为2个–√2个 在一个方向上是瑞利范围(X R),根据定义,它是共焦参数的一半。因此,共焦参数定义了光片在传播方向上的大可用横向范围。通过创建较大的光片来增加共焦参数会直接导致束腰变粗(限制轴向分辨率),如以下将共焦参数和束腰厚度相关的等式所述:
其中b是共焦参数,XR是罗利范围,w0是束腰厚度,λ是照明波长。例如,如果选择的光片厚度约为2微米,并且使用561 nm绿光进行成像,则共焦参数将约为22.4微米(μm),这对于单细胞成像是足够的,但对于较大样本的成像则不足够。为了进行比较,光束腰围为w0的轻薄板= 10μm的共焦参数b的值超过1毫米(mm)。应当注意,这些方程式是用于表征在空气中传播的光片(折射率n = 1.0),在折射率n的介质中,共焦参数变为:
其中,n是介质的折射率,bn表示折射率为n的介质中的共焦参数。因此,可以通过允许光片在较高折射率的材料(例如水)中传播来扩展光片(n = 1.33)。目前正在研究专门的方法,这些方法将使用专门的技术来扩展光片的共焦参数而不使光束腰部变厚,这将在下文中进行详细讨论。请记住,提供的方程式不仅可以用于表征静态平面光片,而且可以用于表征由扫描光束产生的“虚拟”光片。
图4-光片品种和重要参数
不同类型的光片的插图。(a)从左到右分别是平面光片(SPIM),带有箭头的数字扫描光片(DSLM),范围略有减小的双光子激发DSLM(2PE-DSLM)和2PE-Bessel Beam光片,范围扩大且旁瓣的影响减小(灰色轮廓表示Bessel Beam旁瓣的范围)。(b)重要的光片参数,包括共焦参数“ b”,瑞利范围“ X r ”和光束腰围厚度“ w 0 ”。该图经Weber M,Huisken J(2011)的用于实时发育生物学的光片显微镜的许可而改编。Curr Opin Genet Dev 21(5)。 dx.doi.org/10.1016/j.gde.2011.09.009
平面光片
较早的LSFM技术(例如OPFOS)包括单个圆柱透镜,以将光片制作和投射到样品中。像球面透镜一样,柱面透镜也可用于扩展或会聚光,但只能沿单个轴进行。该技术的更复杂的迭代将圆柱透镜与照明物镜结合使用,以改善光片的光学特性。
扫描光片
解耦共焦参数和束腰厚度的相互依赖性的一种解决方案包括在横向方向上扫描薄光片,然后将图像部分缝合在一起,以产生比仅由共焦参数所规定的更大的合成图像。高分辨率OPFOS(HR-OPFOS)和扫描薄板激光成像显微镜(sTSLIM)已采用这种方法,并应用于对小鼠小脑和内耳耳蜗进行成像。这种方法的缺点是需要对平面光片进行横向和轴向扫描,从而导致更长的采集时间和更大的曝光量-部分抵消了LSFM的优势之一,即仅对要成像的那些特征进行选择性照明。此外,图像配准和拼接可能会出现问题,
尽管可以相对于固定样本平移物镜,但通常是通过光片轴向扫描样本以生成z系列。许多研究小组选择使用标准高斯激光束而不是光片,从侧面扫描光束以模仿平面光片。随后,使用f-theta透镜和适当的扫描镜对光束进行轴向平移,从而无需移动物镜或样品即可获取完整的z系列。这种方法被称为数字扫描激光薄板显微术(DSLM),由Philipp Keller及其同事于2008年开发。
多光子光片
平面和数字扫描的光片都可以与多光子激发一起使用。当一个荧光团在单个量子事件中吸收两个光子时,就会发生双光子激发(2PE),其中组合能量类似于使用单个光子将荧光团激发到激发态所需的能量。2PE是自然界中极为罕见的过程,仅在极高的飞秒脉冲激光器的焦点处实现时,才在极高的光子密度下发生。2PE的激发波长应该是典型的单光子情况下的激发波长的大约两倍,尽管这比一般的指导原则要重要得多,应参考已公布的两光子吸收光谱。
与传统的单光子方法相比,由于减小了聚焦面积,因此在多光子激发下成像场的尺寸有所减小,但是用于2PE的长波长红外光对于样品在散射介质中的穿透性而言更为优越。的确,生物学的光学窗口存在于约650纳米(nm)至1200 nm之间,其中自发荧光极小,血红蛋白,水和蛋白质的吸收低。这对于LSFM实验特别有用,因为样品通常比薄样品厚几毫米,并且散射和/或吸收度更高。总之,多光子激发提供的主要优点是减少了散射/吸收,从而使样品穿透更深。此技术使用的较长波长红外光的产品。
扫描贝塞尔光束和光学格子光片
亚历山大·罗尔巴赫(Alexander Rohrbach)的实验室首先演示了使用自重构贝塞尔光束创建数字扫描光片的方法。贝塞尔光束是通过在照明物镜的后瞳孔周围围绕环形图案的投影或通过用轴锥对照明光进行整形而产生的。在理想情况下,可以将这些光束视为非衍射光束:如果被遮挡,则贝塞尔光束将在遮挡物体的下游重新形成,从而形成常用的“自愈”和“自重构”描述符。
贝塞尔光束核心的厚度可以比标准高斯光束的厚度薄得多,从而可以扫描更薄的光片。与贝塞尔光束照明有关的重要的问题是,光束能量的很大一部分驻留在旁瓣中,与典型的艾里衍射图样所见相似。这些旁瓣实际上对光束的自愈特性至关重要,但实际上会使光束腰部变厚。解决此问题的一种方法是将贝塞尔光束照明与双光子激发(2PE)结合使用,这已被证明可用于成型非常薄的光片(小于半微米)。贝塞尔光束的核心中的照明强度仅足够高以实现2PE,从而有效地消除了旁瓣引起的散焦激发。通过这种方法,埃里克·贝齐格(Eric Betzig)的实验室已经证明了活细胞中300 nm的各向同性分辨率,速度约为每秒200个图像平面。贝塞尔光束也已与非相干结构照明显微镜(SIM)方法结合使用,从而使人们能够在计算上区别和拒绝由散焦荧光结构引起的低空间频率信息。SIM和2PE与贝塞尔光束照明相结合的好处是相似的。允许人们以计算方式区别和拒绝由散焦荧光结构引起的低空间频率信息。SIM和2PE与贝塞尔光束照明相结合的好处是相似的。允许人们以计算方式区别和拒绝由散焦荧光结构引起的低空间频率信息。SIM和2PE与贝塞尔光束照明相结合的好处是相似的。
Betzig实验室扩展了将贝塞尔光束应用于LSFM的想法,并引入了功能强大的新型LSFM:点阵光片显微镜。代替使用扫描的贝塞尔光束,该方法使用类似的技术将新颖的光学晶格图案投影到样品平面中。光学晶格是由两个或多个平面波的叠加产生的周期性干涉图案,具有2D或3D结构。但是,与贝塞尔光束不同,贝塞尔光束是通过将照明限制在照明物镜的后瞳孔平面周围的整个环中的非常薄的区域中而产生的,而光栅是通过围绕环面的离散点进行照明而创建的。晶格照明允许用户选择针对轴向分辨率或照明限制而优化的图案。
格子光片显微镜已经在几种不同的“模式”中得到了证明。“标准”模式涉及使用检流计快速抖动光学晶格图案,以在时间上对每个侧面提供均匀的照明,从而产生截然不同的时间平均照明图案。结构化照明(SI)模式提供的空间分辨率比抖动大约高1.3-1.5倍,但时间分辨率却低7.5倍。
晶格光片成像的实用性已进一步证明可用于单分子跟踪和超分辨率成像实验。小型且紧密聚焦的光片通常具有约4-5μm的束腰,比高NA物镜的典型景深(DOF)厚几倍。相反,抖动光学晶格的有效束腰接近1μm,与高NA物镜的自由度更加匹配,并且对单分子超分辨率成像更胜一筹。在物镜焦点内对单个发射器的局限激发可以检测到更大比例的单分子发射事件。
扫描通风光束
与贝塞尔光束类似,艾里光束具有传播不变性和“自愈性”。艾里光束是通过使用空间光调制器在物镜的后孔处调制典型的高斯光束而形成的,从而导致艾里光束具有独特的不对称横向结构(图4)。有趣的是,Airy光束似乎比Bessel光束通过厚且散射的介质延伸得更远。形成类似于其他DSLM的Airy光片,光束沿y轴抖动以创建虚拟照明片。
LSFM成像方式
多视点和多方向成像
LSFM常见的问题之一是存在条带伪影。这些伪像是单向照明的结果。散射,吸收或干扰上游入射光束的样本特征会导致较弱的下游照明,可见为暗“条纹”。这些条纹伪像由图5(b,d)所示,其中对包含光学不透明结构元素(橙色圆圈)的假设样本进行了单侧照明,在图中清晰可见可见的阴影/条纹。
图5-条纹伪影及其使用多视图成像的校正
条纹伪影的插图及其使用多视图成像的校正。(a)SPIM类型设置中的标准方向,用于多视图成像。请注意,样本沿所示方向旋转,以提供多个视图用于后续图像融合和解卷积。(b)在四个不同角度的假设样本的多视图图像,显示了由于照明路径中的光学密集物体而导致的下游条纹,上方是融合图像,表明条纹/阴影伪影减少了。(c)多向光片显微镜的光路,其中所示的扫描镜提供了从多个方向照亮每个平面的信息。在没有多方向照明(d)和有多方向照明(e)的情况下表达维纳斯荧光蛋白的小鼠大脑的LSFM图像。面板(ce)是根据知识共享署名许可的条款从以下位置重新创建的:Schwarz MK,Scherbarth A,Sprengel R,Engelhardt J,Theer P,Giese G(2015)已清除的完整小鼠大脑的荧光蛋白稳定化和高分辨率成像。PLoS ONE 10(5):e0124650。doi:10.1371 / journal.pone.0124650
条纹问题的早期解决方案是应用样品的多视图(multiview)成像,方法是通过串行xy旋转和在每个z平面上对样本进行成像,然后融合来自每个视图的图像以创建高质量综合。通常,顺序获取几个z堆栈,每个堆栈都来自一个视图。例如,获取第一个z系列,将样本旋转一个预定义值,获取第二个z系列,依此类推,直到获得令人满意的视图数(通常为4-6)。一旦在每个视图上获取了z堆栈,就可以使用专门的融合和解卷积算法来创建复合光学部分,以合并图像,从而生成高分辨率图像,并且整个样本量的图像质量均具有较低的偏差。图5。
多视图成像允许模拟每个z平面的均匀照明。尽管标本的所有部分都不能完全均匀地照明,尤其是在低视角数且接近厚样品中心的情况下,但与单视角方法相比,图像质量得到了极大的提高。或者,可以在称为多方向SPIM(mSPIM)的技术中使用枢转的光片。从照明物镜传播的光片在检测焦平面中绕大约10 o的角度旋转使用在高频下工作的谐振镜。在相机曝光期间,几乎可以同时从每个照明物镜实现多角度照明,从而减少照明伪影,而不会像多视图成像那样影响采集速度。但是,这种方法在减少伪像方面不如多视图SPIM有效,因为照明角度的范围仍然相对有限。可以将多视图和多方向成像结合使用,以提高灵敏度。
多视图方法令人担忧,主要是因为它使采集时间增加了几倍。由于通常需要数十毫秒的旋转时间,因此旋转样品可能会产生问题。较长的旋转时间对于防止样品的机械应变和运动是必要的,这可能会损害实验或导致“加速”伪影,从而使样品在图像帧之间急剧移动。此外,与可比的单视图LSFM实验相比,每个平面暴露于照明光的时间要长几倍。这是由于需要在每个平面中对特征进行4-6次成像。这样增加的采集时间通常排除了活体标本的多视图成像。因此,该技术更有利于固定样本的高质量结构成像。
多视图成像的一种流行替代方法和/或附加方法是双面光片照明:一对相对的照明物镜提供交替(或同时)的光片照明,该光片照明从样品的相对侧穿透,而检测物镜仍然正交于两个照明物镜放置,并提供更均匀的样本特征照明。这是一种快速而优雅的方法,用于减少单面照明导致的条纹伪影。同样,如果正确对齐,则可以使用双面照明有效地使共焦参数加倍,从而允许使用薄的光片以更高的分辨率对较大的样本成像,而无需使用sTSLIM,HROPFOS等进行的横向扫描和拼接过程LSFM平铺技术。
如前所述,DSLM和类似技术通过对横向和轴向穿过样品的典型衍射极限高斯分布准直激光束进行线扫描来模拟光片。该技术的主要优点之一是,与静态平面光片相比,它提供了更均匀的光剂量,这对于更定量的成像应用而言是首选。此外,DSLM不需要光束整形孔径,从而减少了光学像差,并且照明效率约为90-95%,而平面光片的照明效率约为5%。这使得人们可以使用便宜得多且功率较低的激光光源。DSLM和相关方法通过使用声光可调滤波器(AOTF)调节照明强度来实现新颖的照明模式。
用于高灵敏度LSFM的许多新标准化方法涉及使用四个总物镜:两个用于照明,两个用于检测。该技术的一个很大好处是,它使每个平面上收集的光量增加了一倍。标准化的SiMView和MuVi-SPIM成像平台推广了这种模式。引入了IsoView变体,其中依次通过四个定制的物镜执行光片激发和荧光检测,并且每个物镜都具有自己的sCMOS摄像机进行检测,从而无需物理旋转样本就可以收集四个视图。称为多成像轴显微镜(MIAM)的早期技术也使用了4个物镜,但放置在四面体结构中,并提供了各向同性的分辨率,而且无需旋转样品。
组装高质量LSFM仪器的指南(包括SiMView,MuVi-SPIM,IsoView和开源OpenSPIM项目)有助于标准化仪器。此外,可以从这些来源获得SPIM软件和算法。随着时间的流逝,LSFM有可能达到其他显微镜所能达到的商业可用性和标准化程度。
iSPIM,diSPIM和三视图SPIM
Hari Shroff实验室引入的反向SPIM(iSPIM)技术代表了一种使LSFM适应广泛使用的强大新方法。iSPIM由一个“头”组成,照明和检测物镜均附在其上。照明和检测物镜的“开销”方向允许使用更常规的样品制备技术,包括在盖玻片上生长的粘附细胞。这与大多数LSFM相反,在大多数LSFM中,样品必须以非传统方式嵌入凝胶中并悬浮在物镜之间。头部还包含检流计扫描仪,用于将光片平移通过样品;物镜z压电体用于平移检测物镜,以将光片保持在聚焦平面中。
更为先进的双倒置SPIM(diSPIM)变种是对原始iSPIM设计的巧妙改编,但是照明和检测在两个物镜之间交替出现,随后应用了图像配准和反卷积融合了互补的视点,并提供了330 x 330 x 330 nm的各向同性解析度。由于样品保持静止状态,因此报道的采集速度为200张图像/秒,这使研究人员能够在不到一秒钟的时间内获得完整的z堆栈,非常适合捕获生命系统中的3D动态。diSPIM(和大多数LSFM)的物镜选择受到空间位阻的限制–照明物镜和检测物镜的近距离限制了笨重,高NA物镜的应用,且工作距离较短。对于diSPIM,这是有问题的,因为使用了两个相同的物镜,与其他LSFM相比,使用较低的放大倍率和NA照明物镜以及更长的工作距离以及更大,更高的NA检测物镜。目前,常见的是使用一对Nikon Apo 40x 0.8 NA水浸物镜(工作距离= 3.5 mm)执行diSPIM和相关技术,如图6所示。
图6-安装在倒置显微镜上的diSPIM头的图示
diSPIM头安装在倒置显微镜上的图示。diSPIM灯头取代了透射式照明。使用了一对浸水物镜和专门的样品池支架以进行浸水
diSPIM技术适用于利用一个物镜,该物镜安装在倒置显微镜支架的常规物镜转盘位置,在该显微镜镜架上,直接在盖玻片下方安装了diSPIM头。以前,此位置的低放大倍率和NA物镜用于协助样品放置,但不用于数据收集。但是,iSPIM方法的新迭代–三视图SPIM –利用高NA物镜提供第三视图,捕获了更多的荧光发射立体角。三重视角SPIM已被证明是在物镜接口位置使用1.2 NA的水浸物镜,可将该装置的光学分辨率提高到235 x 235 x 324 nm,并具有更高的信号水平。但是,由于物镜转镜处于45 o角度(从diSPIM头上的任一物镜)到光片,必须沿z轴平移以捕获光片在整个角度上生成的对焦荧光。通过在物镜接口物镜成像路径中将z扫描与sCMOS相机的卷帘快门同步来优化此效果。
单物镜LSFM
除了iSPIM和相关方法之外,还有几种模块化的单物镜LSFM设计,旨在使非专业人员可以更轻松地使用该技术,并且/或者可以将其集成到现有的显微镜平台上。一种称为物镜耦合平面照明(OCPI)的设计是一种模块化单元,其中照明和检测物镜被牢固地耦合,安装在单个臂上并永久对准。
许多LSFM方法都采用替代照明策略,以便于使用高NA油浸物镜。有几种使用倾斜照明,类似于使用具有亚临界照明的典型全内反射荧光(TIRF)显微镜时所实现的照明。这些技术(可变地称为高度倾斜和层压光学片显微镜(HILO)和斜面显微镜(OPM))具有许多与更标准的光片方法相同的优点,但视野较小。倾斜照明提供了一个小的固定光片,可以使用典型的压电Z载物台通过其扫描样品,以进行体积成像。但是,这需要在沿着光学系统的某个点上校正倾斜的像场(由于倾斜照明)。下面的图7。这可能很难正确对齐;为了模拟平场,物镜的布置必须接近完美。
OCPI方法已使用60倍NA = 1.35的物镜进行了演示。但是,这种方法的缺点之一是场大小有限,从而无法将其用于大样本(例如模型胚胎)。同样,由于在重新成像样本平面时使用了较低的NA物镜,因此无法使用成像物镜的完整NA,因此在实践中将此技术限制为NA<1.0。这些策略的前提是简化LSFM仪器,而不是提高分辨率,这有助于减轻研究人员的设计要求,这些研究人员寻求构建自己的仪器来对较小的生物样品(如单细胞)进行光片分析。
图7 -HILO和倾斜平面照明和检测
斜面显微镜(OPM)的光路。说明了实现TIRF,HILO(倾斜)和典型的镜射照明所需的角度。倾斜照明可以选择性激发样品中的薄平面,但是该平面是倾斜的。OPM通过以匹配角度投影要由第二物镜检测的图像并随后由照相机系统进行检测来校正照明角度。
第二种策略涉及使用与物镜耦合的倾斜镜或专用棱镜,以将光片直接投射到样品介质中。一种方法是在原子力显微镜型悬臂梁上使用一次性反射镜,该反射镜紧邻检测物镜放置,以将光片反射到样品中。Z成像是通过样品的垂直平移来实现的,同时照明保持稳定,以免干扰系统对准。与倾斜照明策略一样,与其他LSFM相比,此方法的场大小有限,通常约为1 um厚的束腰和10 um的共焦参数。而且,存在着实施困难以及这种装置的整体光学稳定性的问题。该技术的新变体试图通过用直接放置样品的佩林-布罗卡棱镜代替镜子来解决这些问题。光被引导通过成角度的棱镜,并在样品中作为光片出射。尽管该技术仅在贴壁细胞的顶膜上得到证实,但该方法是有前途的,它提供了足够高的信噪比和分辨率,可以执行单个粒子跟踪实验。
LSFM超高分辨率
有多种替代成像方式可用于通过LSFM实现超出衍射极限的超分辨率成像。单分子跟踪和定位正成为与LSFM结合使用的相当普遍的技术。一种称为个体分子定位SPIM(IML-SPIM)的方法将光片照明与单分子定位显微镜(SMLM)结合在一起。高功率的光片用于诱导合适探针的光开关,各个发射事件在时空上得到很好的分离,从而可以对单个荧光团进行鉴定和亚衍射有限的定位。给定合适的采集时间,可以通过在单个平面上映射所有定位来创建超分辨率重建。
通过将LSFM与SMLM结合使用,可以从厚度比使用非LSFM仪器(例如TIRF)通常实现的厚度大几个数量级的样品中获得超分辨率光学切片。具体而言,IML-SPIM已被核标记的细胞球体(厚度超过100微米)证实,该球体定位在被光激活荧光蛋白PAmCherry1标记的组蛋白上。在光片内,单个荧光团的亚衍射轴向定位是通过通过弱圆柱透镜将像散引入发射点扩展函数来实现的。取决于精细的轴向位置,定位出现在x或y方向上拉伸。已经实现了横向上35 nm的定位精度和轴向上65 nm的定位精度。
一种更常用的分辨率增强方法涉及将LSFM与非相干结构照明显微镜(SIM)结合使用,称为SPIM-SI。SIM依赖于投影到图像空间中的对称,周期性的照明图案,以便从焦点外的荧光中识别出焦点在外。散焦特征不受图案的空间调制的影响,从而可以通过计算识别和拒绝它们的贡献。为了创建SIM卡图像,通常在样品中创建一个正弦变化的大和小交替变化的条纹图案,通常是通过使用AOTF调制照明强度来创建虚拟结构化照明。条纹图案在相同方向的三个不同相位成像。
也可以使用一种称为HiLo显微镜的相关技术(不要与HILO混淆:高度倾斜和层压的光学片显微镜),以有效地区分离焦信息。HiLo与SIM类似,但只需要两张图像:一张结构化照明图像和一张常规宽视场图像。结构化的照明图像用于识别低频失焦信息,而常规的宽视场图像则包含高空间频率细节,这些细节可能已因应用照明模式而丢失。
还可以将LSFM与超分辨率激发发射耗尽(STED)显微镜相结合。STED是一种共聚焦型点扫描技术,它依赖于高功率“耗尽激光器”,通过利用受激发射过程将激发的荧光团驱动至基态而无荧光发射。耗尽激光器被“包裹”在传统的激发光束周围,以非线性方式激发离开激发光束中心的激发荧光团发出的光。因此,通过在空间上将允许探针发出荧光的区域限制在亚衍射限制区域中来实现超分辨率,该区域的大小与耗尽激光器的功率成反比。应用于LSFM时,耗尽型激光器被成形为双层,将激光片夹在中间,有效地缩小了束腰。结果表明,与标准LSFM成像方式相比,轴向和横向分辨率均提高了约30%。请注意,相关的RESOLFT技术已类似地应用于LSFM,以提高轴向分辨率。
其他LSFM实施
LSFM的一些高级功能包括自适应光学(AO)的实现。AO通过将波前传感器与补偿畸变的组件(通常是可变形反射镜(DM))结合使用,减少了光学显微镜中正常样品引起的像差引起的波前畸变。这允许响应样品像差进行波前校正,提高分辨率并解决成像介质中的不均匀性,这是LSFM的常见问题,尤其是在较深的视场中,更容易发生散射和吸收伪影。AO可以使用多种方法来实现,但是对于LSFM尤其有趣,因为AO在技术上可以独立地应用于照明和检测路径。LSFM中已使用AO,以允许通过玻璃毛细管成像,补偿由玻璃和水性样品介质之间的折射率变化引起的变形。一种类似的方法是使用微分干涉显微镜(DIC)估算通过样品的折射率的变化,从而实现空间变量解卷积。
已经开发了几种使用多模光纤代替典型的照明物镜来传递光片的LSFM实现。这种方法的占地面积非常小,非常适合空间有限的实验室或对内窥镜LSFM的潜在应用感兴趣的实验室。
LSFM硬件
建立LSFM可能很困难,这在很大程度上是因为它与传统的显微镜设计有很大的不同。图8提供了典型的开源双照明SPIM型仪器的光路图。
图8-双重照明LSFM的光学照明
典型的双照明SPIM类型系统的光学系统。“ M”表示反射镜,“ DC”二向色镜,“ X”表示扩束望远镜光学元件,“ VS”表示用于控制光片厚度(数值孔径)的垂直狭缝孔径,“ FM”表示可翻转的反射镜。旋转以将光导引到IO1或IO2下游(照明物镜),“ C”是用于将光束成形为双曲平面的圆柱透镜,“ T”是第二套可伸缩光学器件,包括用于控制的水平狭缝孔径“ HS”光片的扩散。将光引导到两个“ IO”照明物镜之一,以照明样品“ S”。检测物镜“ DO”将发射光导向二向色镜,该二向色镜将发射分为两个检测路径之一。每个检测路径都包括一个发射滤镜“ F”和一个用于将光导引到摄像机“ CCD1 / 2”的管镜“ TL”。请注意,如何使用适当的二向色分束滤波器将发射分为两个通道,以便同时进行多色检测。
相机是任何成像系统中重要的组成部分。电荷耦合器件(CCD)的使用被认为是大多数生物成像应用的行业标准。此外,在许多需要单分子水平灵敏度的高级成像应用中,普遍使用高灵敏度(且价格昂贵)的电子倍增CCD(EMCCD)。但是,大多数现代LSFM的首选相机是科学的互补金属氧化物超导体(sCMOS)。与CCD和EMCCD相比,sCMOS相机的主要优点是成像速度快(全视场速度高达100 Hz),成本适中且芯片尺寸大得多,非常适合宽视场成像。快速的图像采集速率对于实现LSFM的全部潜力至关重要,特别是对于体内而言体积成像,其中重要事件在三个维度上发生的速度非常快。对于非常大的样本,芯片尺寸可能会在能够对整个样本成像的情况和必须诉诸替代策略(例如图像拼接)之间产生差异。越来越普遍的方法是使用sCMOS相机的卷帘快门作为线扫描DSLM的共焦狭缝光圈,从而提供类似于现有线扫描共焦系统的轴向分辨率提高。注意,也可以简单地包括共焦狭缝孔以拒绝散焦光,而不是使用滚动快门。
物镜
为LSFM选择物镜时,必须考虑许多不同的因素。其中重要的是样品的特性和光片显微镜的类型。样品量决定了良好的视野,工作距离和景深。此外,LSFM的光学设计对物镜选择提出了许多固有的空间限制,用户在设计实验时必须意识到这一点。
在大多数情况下,较短的工作距离物镜由于必须非常靠近第二个垂直物镜放置而容易产生空间位阻。大多数高NA浸没物镜(NA>〜1.1)都属于此类。此外,油浸对于LSFM通常没有太大的用处,因为大多数标本很大且/或安装在诸如琼脂糖凝胶或培养基之类的水性介质中,因此可以使用水物镜对图像进行良好成像。尽管物镜和样品介质之间的折射率失配通常对于非常薄的样品(例如盖玻片上的粘附细胞)来说没有问题,但样品显示出不可忽略的3D结构时,球差迅速成为一个主要问题。
通常,LSFM的检测物镜是中低NA(〜0.2-1.1)干或水浸入/浸入式物镜,工作距离长且接近角接近(电生理物镜通常是一个不错的起点)。理想的规格取决于物镜样品。高分辨率共焦和相关技术通常使用具有高NA(〜1.3-1.49)的油浸物镜,从而固有地具有更大的横向分辨率。但是,与使用相同NA物镜的共聚焦显微镜相比,LSNA可以提供高达NA = 0.8的轴向轴向光学分辨率。LSFM旨在优先考虑采集速度并大程度地减少样品曝光,而不是大化光学分辨率,因此不能仅根据物镜NA来判断。
照明光学器件通常包括低NA和低倍率的照明物镜,通常放大倍数为2-10倍,NA = 0.1-0.3。常常包括用于将光片成形为适当尺寸的其他光束成形光学器件,其随系统设计而变化。这样的光学器件包括柱面透镜,狭缝孔和光束扩展光学器件,如图8所示。尼康用于LSFM的常见物镜包括CFI Apo 40XW近红外(NA = 0.8),CFI75 LWD 16XW(NA = 0.8),CFI75 Apo LWD 25XW(NA = 1.1)和CFI Plan Fluor 10XW(NA = 0.3)。
光源
LSFM的光源几乎始终是激光,要么成形为平面光片,要么扫描成高斯,贝塞尔或艾里光束。对于平面光片,由于光束整形光学器件,仅保留了约5%的激光强度,而在行扫描配置中,只有约95%的强度得以保留。对于先进技术的特殊考虑,例如将LSFM与双光子激发(2PE)结合使用,需要更复杂的仪器。与共聚焦显微镜一样,必须使用高质量的激光光源。
尽管原则上可以将广谱汞灯和卤化物弧光灯成形为平面光片,但所产生的强度通常不足。发光二极管(LED)同样提供不足的照明强度,尽管LSFM通常包括用于透射光照明的红色LED,从而提供了一种简单且相对非侵入性的方法来在成像前定位标本。我们预计,随着越来越强大和具有成本效益的LED继续可用,这种情况将会改变。
数据分析与存储
要考虑的至关重要的方面是数据分析。LSFM能够产生大量数据,通常一次实验即可产生数TB的数据。为此,有必要在使LSFM联机之前建立数据管理管道。通往分析计算机或群集的管道以及随后的归档工作流至关重要,并且必须进行诸如图像压缩之类的实践。许多机构都可以使用超级计算资源,从而加快了分析速度。云计算服务的持续发展也可能证明对数据存储有利。计算有效且经过充分验证的开源图像配准和分析算法可用于实时图像分析/处理。
LSFM的样品制备
如上所述,LSFM的主要优点是可以对比通常认为更可行的更大的生物标本进行成像,例如使用共聚焦显微镜等更传统的荧光技术。LSFM对于以显着减少的光剂量进行贴壁细胞培养物的快速3D成像也是有利的。共聚焦点扫描技术(沿光轴方向)不能穿透样品超过约700微米。这是一个很大的限制;通常,在小于100微米的深度处很容易观察到图像质量下降。LSFM终能够在数十毫米的深度成像,在这方面只能与多光子显微镜相媲美。尽管多光子仍是较大样本(例如成熟啮齿动物)的活体成像的首选,LSFM在可视化大多数模型生物的胚胎发生和早期发育方面具有优势。LSFM的流行模型生物包括果蝇,斑马鱼,线虫等。
用于LSFM评估的一些引人入胜的模型系统是细胞球体/囊肿。与典型的二维细胞培养相比,这些直径约100微米的空心球在更大程度上模拟了实际组织的结构和功能。此外,与相同细胞系的2D平面培养相比,3D培养的球体的蛋白质组,呼吸方式和通信网络存在显着差异。球体中上调的许多基因在体内肿瘤生长中也上调。球形培养物特别适合于上皮发育的研究,以Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和乳腺上皮细胞(MEC)作为主要模型。与2D培养的上皮细胞不同,3D椭球体是极化的,类似于体内上皮组织。3D培养物也趋于稳态,调节细胞迁移,凋亡,增殖和分化。还可能产生异型球体,其包含在实际组织中发现的几种细胞类型,例如既包含上皮层又包含间充质/内皮层。
反复证明适用于LSFM的标本的类型是切除的骨器官结构,如针对OPFOS技术所述。具体而言,已经进行了大量研究,以使用LSFM表征内耳成分,有时还与更传统的层析成像技术(如μCT)配合使用。这种方法也已被用来绘制成年小鼠和斑马鱼大脑中的神经元图。
样品制备
LSFM的样品制备通常很困难。一方面,对于诸如iSPIM和Lattice Light Sheet之类的技术而言,样品制备可能相对简单,在这些技术中,样品通常是在盖玻片上生长的粘附细胞。由于其普遍存在,将不讨论2D贴壁细胞培养物的制备。另一方面,更大,更复杂的模型系统的SPIM类型成像需要非标准的样品制备技术。这些标本包括培养的三维细胞球体/囊肿,较小的模型生物(例如,果蝇,斑马鱼,medaka和非洲爪蟾)胚胎)和外植的组织/器官。LSFM的样品制备有两种主要方法。第一种使用专门的光学清除剂和钙螯合剂使通常不透明的结构具有光学渗透性,从而使人们可以成像无骨结构,例如内耳耳蜗。第二种方法是使用未清除的标本,通常将体积不超过约一立方毫米的模型胚胎或球体安装在低熔点琼脂糖圆柱体中,以插入专门的成像室。
当Arne Voie及其同事于1993年引入OPFOS时,他们利用Spalteholz溶液进行清洁,该溶液由5份水杨酸甲酯与3份苯甲酸苄酯组成,折射率约为1.47,与大多数蛋白质相似。因此,整个成像体积是折射率匹配的,通过显着减少散射伪影使其光学透明。但是,Spalteholz清除不能解决骨骼或其他钙化组织的问题。请记住,钙会强烈散射光。因此初步应用了钙螯合剂,如dH 2中的10%(w / v)脱水乙二胺四乙酸(EDTA)浸入Spalteholz溶液之前需要O。请记住,此类苛刻的样品制备方案适用于固定样品成像。在Voie及其同事的情况下,将经切除,脱钙和光学清除的耳蜗进行X线断层扫描成像,然后进行有限元分析,以描绘出较大的特征。现在可以探索Spalteholz解决方案的几种替代方法,例如CLARITY,DISCO和相关方法。此外,由于许多显微镜制造商生产具有折射率调节环的物镜,专门用于使物镜的折射率与经清洁的标本的折射率相匹配,因此使用透明的标本为使用更高的NA物镜提供了独特的机会。在其他地方对特定的清除协议进行了很好的审查。
如上所述,LSFM样品制备的常用方法是将样品包埋在琼脂糖圆筒中,充当机械稳定的水。或者,样品可以类似地包埋在凝胶,半乳聚糖,明胶,琼脂,藻酸盐或角叉菜胶中。通常地,选择在水或PBS中的0.8-1.0%(w / v)的低熔点琼脂糖。重要的是,这种方法与活体标本兼容,许多自然透明的模型生物的体内成像现在很普遍。首先,应准备胶凝剂并使其冷却直至刚好高于胶凝温度。这可以在电热板或热水浴上进行,通常确保试剂在37 °C附近。刚使用前的温度(哺乳动物系统的生理温度)。此时,样品已准备好安装,应迅速进行操作,以免将气泡引入凝胶中,并避免凝胶过早聚合。一旦安装,样品应立即成像。
包埋常见的方法是将琼脂糖成型为圆柱状的腔室,样品可以从该腔室中悬浮。简单地,将熔化的琼脂糖拉入注射器中,在注射器中取下顶部。然后可以将样品放置在凝胶中,然后使其聚合,以便可以使用柱塞将圆柱体推出。图9说明了该方法,该方法可以使用玻璃毛细管(带柱塞)代替注射器,适用于较小的样品。通常,样品宽度应在琼脂糖圆柱直径的1 / 3-2 / 3之间,并应尽可能靠近DO的表面放置,以使像差小。同样,由于折射率的变化,嵌入的样品也不应在毛细管/注射器内部成像(如果可能的话)。
图9 -LSFM样品制备
用于光片成像的琼脂糖包埋。(a)典型的塑料注射器。(b)注射器的尖端被切除,以便更大的进入。(c)将熔化的琼脂糖吸入注射器体内。现在应该插入样本。(d)使琼脂糖与包埋的样品聚合。(e)挤出琼脂糖圆筒以进行成像。
存在两种主要的琼脂糖包埋方法。直接的方法是直接将样品与琼脂糖混合,然后泵入注射器/毛细管进行聚合。该方法适用于较小的样品,例如荧光珠,细胞球体/囊肿,酵母菌甚至小胚胎。但是,对于较大的样品(例如发育中的模型生物),首先用琼脂糖填充包埋模具,然后在聚合之前将样品小心地放置在其中。与第一种方法相比,这可以更好地控制样品对齐。同样,对于特别困难的样品,可以单独形成琼脂糖圆柱体,在其上切一个孔或凹口,将样品放入其中,然后倒入新鲜的熔融琼脂糖以覆盖样品。对于不应嵌入的示例,可以在圆柱体内构造一个用于容纳PBS,生长培养基等的腔室,然后使用更多的琼脂糖将其密封。可以通过将实心圆柱体连接到柱塞的尖端,使琼脂糖在其周围聚合来模制此内部腔室。请注意,对于这种方法,应使用较高浓度的琼脂糖(〜1.5%),以确保薄腔室壁的机械稳定性。
可选的样品安装方法非常普遍。样品可以挂在弯曲的玻璃毛细管上,可以根据需要旋转和/或平移成像。另一种常见的做法是将样品胶粘到杆/毛细管上,或将其从注射器中部分挤出。用于LSFM的专用成像腔室受到越来越多的关注。一种有前途的方法是使用三维打印机从各种材料中创建定制设计的支架。
LSFM应用
如前所述,LSFM有助于对长达数十毫米的大型样本进行成像。常见的样本包括解剖结构和外植组织,例如小鼠的大脑,小鼠/豚鼠的耳蜗和中/内耳成分,等等。LSFM的模型生物包括常见的果蝇果蝇(Drosophila melanogaster),斑马鱼Danio rerio,蓝aka(Medaka fish Oryzias latipes),线虫Caenorhabditis elegans,the(Chironomus tentans),非洲爪t Xenopus laevis和小开花植物拟南芥(Arabidopsis thal)。这些生物通常在胚胎阶段成像,但是已经对许多所列物种进行了整个成年生物成像。
LSFM的早期实现,特别是OPFOS,致力于通过对中耳和内耳组件的结构进行成像来进行听力研究。早期的研究使用了厚约20至30微米的厚薄光片,从而可以实现几毫米长的超大视野。切除的,光学清除的豚鼠耳蜗和斯卡拉鼓膜是使用OPFOS成像的首批标本之一。这些图像允许对这些结构进行革命性的3D重建和映射。之后,将使用类似的方法对豚鼠鼓膜大鼓进行成像和建模,分辨率约为16微米。使用横向扫描的薄光片(HR-OPFOS),可以在直径30毫米或更大的视场上获得更大的光学分辨率(〜2.0微米),
LSFM流行的应用也许是用于跟踪胚胎发生。第一个这样的例子是使果蝇的胚胎发生可视化,该果蝇使用融合在肌动蛋白上的EGFP标记的果蝇胚胎发生,从而可视化质膜。从那时起,胚胎发生已成为通过LSFM进行可视化的主要物镜,大多数研究人员选择使用核标记,既可以像EGFP-组蛋白一样进行基因表达,也可以像Hoescht 33342一样通过外源诱导。这使得细胞谱系得以全面发展。追踪和追踪发育中的胚胎。图10包含小鼠胚胎发生的DSLM图像,随着时间的推移并以3D方式跟踪发育中的胚胎的不同部分。后来,使用果蝇实施了两个光子DSLM进行相似的实验反而。已经进行了更加集中的研究,例如仅对斑马鱼侧线发育中涉及的细胞进行谱系鉴定。使用现代计算方法,已经证明了全自动细胞跟踪。
图10-使用DSLM进行小鼠胚胎发生的延时3D成像
使用数字扫描光片显微镜(DSLM)进行小鼠胚胎发生的延时3D成像。(a)组蛋白H2B-GFP小鼠胚胎的Z系列,每张图像是13 μm厚z堆栈的大强度投影,并且距胚胎的远端有标记的距离。(b)H2B-GFP小鼠胚胎的光学切片,距胚胎远端78 μm,标注内脏内胚层(蓝色),表皮细胞(绿色),中胚层(黄色)和原始条纹(红色)。前(A)在左边,后(P)在右边。比例尺= 20 μm。(c)表皮细胞中感兴趣区域的时间分辨序列。分开的原子核用蓝色箭头表示,突出显示的原子核(黄色)在根尖方向显示出运动间核迁移。(d)在顶部面板中用Alexa Fluor 546鬼笔环肽(F-肌动蛋白,用作膜标记)染色并在底部面板中覆盖DRAQ5(核,红色)的切片图像。此图是根据知识共享署名许可的条款从Ichikawa T,Nakazato K,Keller PJ,Kajiura-Kobayashi H,Stelzer EHK,Mochizuki A等重新创建的。(2013)整个小鼠胚胎在成胎过程中的实时成像:表皮细胞和中胚层细胞的迁移分析。PLoS ONE 8(7):e64506。doi:10.1371 / journal.pone.006450
事实证明,LSFM所提供的速度和广阔的视野对于活体标本中的钙成像很有用。钙敏感的FRET探针Cameleon(YC3.6)由青色和黄色荧光蛋白组成,并由钙敏感的钙调蛋白结构域束缚,用于探测拟南芥根中钙的动力学,以响应外部刺激,例如添加ATP(图11)。在一项研究中,使用钙指示剂GCaMP5G可视化了约80%的斑马鱼神经网络的时变活动,发现了大脑不同部位活动中未知的相关性。通过观察暴露于各种刺激的小鼠犁鼻神经元中的钙动力学来证明OCPI。原始的2PE LSFM已证明使用Cameleon对线虫进行钙成像。
图11-拟南芥根中使用Cameleon的钙FRET
用拟南芥根尖中的LSFM观察到的钙动力学,其中的细胞表达核定位的Cameleon(YC3.6)。 (a)青色荧光蛋白(CFP)供体成像通道。(b)金星荧光蛋白受体成像通道。(c)FRET图像显示金星与CFP的比例,显示出对根尖的大活性。比例尺= 50微米。此图是根据知识共享署名许可从(Costa A,Candeo A,Fieramonti L,Valentini G,Bassi A(2013)用选择性平面照明显微镜可视化的拟南芥根细胞中钙动态)重新创建的。公共科学学报8(10):e75646。doi:10.1371 / journal.pone.0075646
LSFM的早扩展之一是向荧光相关光谱法(FCS)的应用,该技术将荧光强度的波动与荧光团浓度的变化以及其他物理参数相关联。FCS通常用于确定浓度,单重态-三重态动力学,扩散系数等。尽管与共焦或多光子显微镜结合使用,但SPIM和FCS(称为SPIM-FCS)的组合已被验证可在一分钟内记录4000多个光谱,并且样品的干扰小。共聚焦系统通常需要大约一分钟才能收集单个光谱。
LSFM的另一个令人兴奋的应用是对生物功能的光遗传学控制。光遗传学是一个新兴的领域,它依赖于光敏蛋白来控制细胞功能,从而控制生物体的行为。通过结合Channelrhodopsin-2,halohodopsinin和LSFM,Arrenberg及其同事能够对斑马鱼心脏起搏器细胞(心肌细胞)中的离子通道进行非常精确的时间控制。使用数字镜设备(DMD)通过检测光学器件在三个维度上创建任意照明结构,而与光片照明无关,从而允许单细胞激活。许多新兴方法都依赖于独立于光片生成的检测光学器件的新颖照明策略。这种光遗传学方法可以模拟心脏骤停,心动过速,
LSFM的另一个扩展是基于激光的显微外科手术。激光消融显微外科手术是生物学研究中相对普遍的技术,其应用包括细胞骨架外科手术(例如切割微管细丝),细胞膜破裂以及其他形态发生研究。如同所讨论的光遗传学方法一样,光片的照明是不间断的,其中手术激光是使用检测光学器件投射的。使用该技术证明了部分MDCK囊肿的细胞膜破裂,斑马鱼鳍切割,微管切割和血细胞迁移。
事实证明,LSFM成像的非侵入性特性有利于在困难介质中以及大多数显微检查存在问题的深度进行单颗粒跟踪实验。单分子跟踪已被证明在样品深数百微米处,其中光学散射和吸收通常排除了这种精确方法,尤其是使用诸如点扫描共聚焦等较慢的方法时。
结论
光片荧光显微镜(LSFM)正在经历一场真正的复兴,在过去几年中发明并优化了许多令人兴奋的方法。LSFM虽然是一个古老的概念,但它包含一组创新的技术,这些技术以打破照明和检测路径的相互依赖为前提,从而可以大幅减少体积成像时间,光毒性/光漂白以及大尺寸荧光灯的图像质量的整体改善。标记样品。成像效率高;平面照明可确保选择性地激发和检测焦平面中的结构,而不是不必要地照射整个样本量,以便从较小的子量中检测荧光。随着实验需求向定量转变,这一点尤其重要在TOTO大生物相关样本的成像(例如整个模型体,组织和三维培养物)以不可忽略的3D结构。同样,较薄的样品(如贴壁细胞)也可以从大大减少的光线照射中受益匪浅。
LSFM在快速有效地成像方面已经打开了许多大门。大(直径超过100 μm)的细胞囊肿和椭球是伟大的三维稳态模型系统,它们的功能模仿了肿瘤,因此可用于癌症治疗和药物发现。LSFM提供了一种对此类培养系统进行长期高性能成像的方法。当对模型生物(如斑马鱼和果蝇)进行成像时,这一点尤其明显,从而可以在整个发育中的胚胎中进行先进的应用,例如全面的细胞谱系重建和FRET。LSFM还适用于非常大的器官结构(著名的是内耳耳蜗)的结构和断层成像,并已用于通过成熟的断层成像技术(如μCT)进行的相关成像。LSFM方法代表了范式转变,这是对更好的3D成像技术不断增长的需求的答案。仍然存在许多挑战,尤其是在数据管理领域,但是LSFM的日益普及和实用性预示着该技术的未来。