高分辨率荧光显微成像系统和相关定量应用的性能,尤其是在活细胞和组织研究中的应用,需要精确优化荧光激发和检测策略。如果没有当前技术各个方面的重大发展,包括光学显微镜、荧光团的生物学和化学,也许最重要的是过滤技术,荧光显微技术不可能在最近几年取得如此显着的进步。采用高度专业化和先进的薄膜干涉滤光片增强了荧光技术的多功能性和范围,远远超出了早期使用依赖于嵌入染料的吸收特性的明胶和玻璃滤光片所提供的能力。
当前的生物研究显微镜技术越来越倾向于高度特异性、灵敏和通用的少量荧光分子探针定位,最终目标是确定它们在细胞和分子过程中的作用。在现在典型的宽场落射荧光照明配置中,滤光片组合在最大化信噪比方面起着至关重要的作用,从而帮助显微镜师平衡增强荧光染料激发的冲突要求,同时限制光漂白和细胞光毒性。经典落射荧光显微镜的特点是激发和检测光路部分重合,需要使用滤光片补充来减少强烈的激发光,在样本相互作用之后,通过一到一千万之间的系数,以便从通常有限数量的发射荧光光子形成实际图像。高效荧光滤光片组是必要的,以便在检测路径中提供最大的激发光衰减,同时成功捕获尽可能多的发射光子。非常高的荧光发射检测效率能够相应降低整体照明水平,从而最大限度地减少荧光染料的光漂白和对样品的光毒性。高效荧光滤光片组是必要的,以便在检测路径中提供最大的激发光衰减,同时成功捕获尽可能多的发射光子。非常高的荧光发射检测效率可以相应降低整体照明水平,从而最大限度地减少荧光染料的光漂白和对样品的光毒性。高效荧光滤光片组是必要的,以便在检测路径中提供最大的激发光衰减,同时成功捕获尽可能多的发射光子。非常高的荧光发射检测效率能够相应降低整体照明水平,从而最大限度地减少荧光染料的光漂白和对样品的光毒性。
基于光学干涉现象的高性能滤光片有助于彻底改变荧光技术在宽视场和共聚焦显微镜中的应用。目前提高荧光标记特异性的大部分进展是由于技术的发展,使抗体与各种合成荧光探针结合。结合精心调整的荧光染料化学特性和由于干涉滤光片光学进步提供更好的信噪比而提高的灵敏度,当前荧光技术的分辨率限制扩展到单个分子的可视化。
干涉滤光片是通过将特殊材料的薄层沉积在平坦的基板上来构建的。他们的设计依赖于薄膜沉积和薄膜光学干涉技术,这两种技术在现代光学元件设计以及半导体和光通信领域都至关重要。干涉滤光片的基本结构具有交替的高和低折射率材料层,每一层的厚度通常是四分之一波长的整数倍。通过仔细选择通常沉积在玻璃或熔融石英/石英基板上的各层的厚度和折射率值,可以利用在各层界面反射的光波的受控干涉,使滤光片能够反射特定波长,同时传送他人。
使用宽场落射照明的经典荧光显微镜以及许多激光扫描共聚焦技术所需的基本滤光片补充包括三个单独的元件,这些元件通常组合成一个光学安装座,通常称为滤光片立方体或滤光块。滤光片组件包括激发滤光片、二色镜(或分光镜)和发射(或屏障)) 滤波器,如图 1 所示。每个组件执行不同的特定功能,但都通过精确利用干扰效应得到增强。三个滤光片元件的特性以及每个滤光片元件的必要性能规格将在以下各节中进行更详细的讨论。一般来说,为特定调查选择最佳过滤器集需要彻底考虑过滤器和荧光染料、显微镜照明源和用于捕获信号的检测器之间的光谱相互作用。
图 1 显示了一个典型的现代荧光滤光片组以及组件干涉滤光片的可见区光谱轮廓。二色镜安装在与滤光片块的光轴成 45 度角的位置,并固定到位水泥或微型夹具。激励和屏障滤波器放置在块的前表面和顶面的底座上,并用圆形挡圈锁定到位(图 1(a))。来自显微镜照明器的光通过激发过滤器进入模块,二次荧光发射通过屏障过滤器离开模块。该滤波器组的光谱分布如图 1(b) 所示。设计用于响应紫外线和绿色激发波长的荧光团的同时成像,该组合包含一个具有两个带通区域(380-420 和 510-560 纳米)的激发滤波器。请注意,紫外线激发剖面的透射值低于绿色剖面的透射值,这是由于滤光涂层材料在波长低于约 400 纳米处有更大的吸收。二色镜具有两个高透射区域,以适应发射滤光片中的相应透射区域。此外,类似于激发滤光片,屏障滤光片有两个带通区域,设计用于同时观察蓝色和红色荧光发射。由于滤光涂层材料在波长低于约 400 纳米处有更大的吸收。二色镜具有两个高透射区域,以适应发射滤光片中的相应透射区域。此外,类似于激发滤光片,屏障滤光片有两个带通区域,设计用于同时观察蓝色和红色荧光发射。由于滤光涂层材料在波长低于约 400 纳米处有更大的吸收。二色镜具有两个高透射区域,以适应发射滤光片中的相应透射区域。此外,类似于激发滤光片,屏障滤光片有两个带通区域,设计用于同时观察蓝色和红色荧光发射。
图 2 中说明了三个最常用于衡量滤光片光学质量和性能的基本参数。的表面平坦性(图2(a))为完全平坦的或平面的表面的偏差的测量,并在级分或平均波长(通常为550个纳米)的倍数来计算。不规则表面反射产生的波前失真是表面平整度值的两倍。该参数对于确定二色镜的质量至关重要,二色镜反射荧光显微镜前表面的激发照明。通过滤波器的平面波前的失真称为透射失真(图 2(b)),并且也以波长的分数或倍数进行测量。造成透射失真伪影的原因是外表面的平整度以及内部缺陷产生的折射率波动。外过滤器表面之间平行度的角度偏差称为楔形(图 2(c)),以偏差角的弧秒或弧分测量。由于光束偏差导致的图像偏移是荧光显微镜中过大的滤光楔角引起的最有问题的伪影。对于典型的滤波器,偏差幅度大约等于楔角的二分之一。除了图像偏移之外,楔形缺陷还会因离轴内部反射产生重影。
激发滤光片的主要功能是阻挡来自照明源的所有光,除了与用于标记样品的荧光染料的吸收特性相对应的选定波长带。绝对要求根据所使用的光源而有所不同。如果使用汞或氙弧放电灯等宽范围光源,则必须将其大部分输出(从紫外到近红外波长)排除在到达样品之外。在许多情况下,合适的激发滤波器的带通传输范围有限,约为 40 纳米(半高全宽;FWHM),以荧光团的最大吸收为中心。这种类型的干涉滤光片由沉积在浮法玻璃上的多个介电层构成,并用环氧树脂层压板密封,以保护吸湿薄膜层免受湿气的影响。尽管通常设计为垂直于光束路径(以零度入射)放置,但许多最近的滤光片光学块设计在安装座中将激发滤光片倾斜几度,以最大限度地减少内部反射的干扰。当采用激光照明时,限制反射的预防措施尤为重要,因为高强度反射可能会损坏激光腔。
由于激发滤光片元件不位于荧光发射成像路径中,因此不需要最高程度的光学精度。激励滤波器的设计公差通常小于大约 6 弧分的楔形,但不需要更精确的研磨和抛光。然而,重要的是涂层以及用作保护层的任何环氧树脂层压板没有缺陷,例如夹杂异物或气泡。还必须消除涂层中的针孔,因为它们允许不需要的波长通过滤光片并降低成像系统的信噪比。
双色分束器位于激发和发射(屏障)过滤器之间,与光束路径成 45 度角(见图 1)。传统上,这种光学元件被称为分色镜,并在落射照明配置中提供两个主要功能。双色分束器设计为专用的长通滤光片,利用干涉层反射某些波长并透射其他波长,因此可以在有限波长范围的窄边界的相对两侧分离波长。与光轴成 45 度角放置的二色分束器以 90 度角反射较短的激发波长,并将它们沿照明轴传递到样品。同时,这个关键元素传输荧光团发出的较长荧光波长,然后用物镜收集并由检测器成像。
二色镜的设计要求必须考虑到它在激发和发射光路中都起作用的事实。选择涂层以产生最小的自发荧光,作为基材的材料,通常由熔融石英或石英组成。通过利用复杂的干涉滤光片设计技术,可以在非常短的波长范围内实现从接近全反射到最大透射率的转变,从而能够精确区分激发光和发射光。除了显示明确定义的光谱特性外,该光学组件的物理公差也非常严格。已发布的规范通常要求楔形小于 1 弧分,表面平整度偏差小于每英寸 10 个波长(影响反射光束),以及每英寸 1 个波长或更小的透射波前畸变(影响透射发射信号)。需要注意的是,双色镜的反射和透射范围都有限制,并且不能在特定波长处精确地进行过渡,而是在很窄的波长范围内进行。双色分束器不会以 100% 的效率反射过渡区域以下的所有波长,并且会再次开始以较低波长传输。类似地,传输特性在跃迁的长波长一侧也不是完全均匀的。在许多情况下,传输通常会在比设计范围长的波长处下降,或者在深红色和近红外区域表现出其他不规则性。
标准荧光显微镜滤光片组的第三个组件是发射滤光片或屏障滤光片。该光学元件主要用于阻挡来自激发波长的光,其次是仅将所需的荧光发射光谱部分传递到检测器。发射滤光片的光学特性必须与激发滤光片的光学特性仔细匹配,以达到允许记录相对较弱的荧光发射信号所需的激发波长抑制水平。普通荧光技术中的激发光可能比荧光染料的发射光亮一百万倍以上,即使是相对少量的未阻挡的激发光也能完全淹没信号。通常,发射滤光片被设计成将来自特定相应激发滤光片的波长阻挡到 5.5 或更高的光密度水平。
实际上,发射滤光片作为第二级去除被二色分束器不完全阻挡的激发光,并且还用于调节样品发出的二次荧光的噪声水平。在最精确的荧光滤光片组中,发射滤光片是与荧光染料的发射光谱相匹配的带通型,尽管在某些应用中使用长通滤光片来收集更大的信号。长通发射滤光片的缺点是通过来自其他荧光染料和/或自发荧光的更多干扰,因此,大多数高分辨率技术使用带通滤光片。在信号分量的光谱鉴别比整体强度更重要的应用中,这种滤波器设计可最大限度地提高信噪比。干涉发射滤光片必须高精度研磨和抛光,其规格与二色镜相似:楔形小于 1 弧分,透射波前畸变低于每英寸 1 个波长。为了最大限度地减少内部反射,通常将此光学元件相对于显微镜光轴倾斜几度,就像通常使用激发滤光片所做的那样。
图 3 中显示的是典型的长通(图 3(a))和带通(图 3(b))滤光片组合,设计用于荧光显微镜的日常工作。长通滤波器组包含一个 20 纳米带通激发滤波器,中心波长为 480 纳米,这被认为是窄通带范围。二色镜和屏障滤光片的截止波长分别为 500 和 520 纳米。与使用带通滤波器相比,使用长通屏障滤波器增加了信号电平。带通荧光组中的 30 纳米宽带激发滤光片(图 3(b))比长通荧光组中的窄对应物(图 3(a))提供了更多的激发能量。然而,带通屏障滤波器(在这种情况下为 40 纳米)对信号检测施加的限制区域会降低到达检测器的整体荧光强度。
干扰滤波器原理
用于滤光片生产的薄膜技术的发展极大地提高了光学显微镜中光谱控制的多功能性。早期的滤光片设计由放置在比色皿中的有色染料溶液组成,然后依次是含染料的明胶片、明胶-玻璃组合和纯色玻璃滤光片。这种依靠吸收来衰减光的滤光片经久耐用且价格低廉,但它们的用途受到峰值透射率低、波长辨别力差以及自发荧光水平高的限制。用于全反射镜和中性密度滤光片的金属材料薄膜涂层,以及用于波长选择的透明干涉涂层,现在是最广泛使用的光控制设备。目前,可以按照非常精确的规格生产干涉滤光片,从而可以针对大多数应用优化其光学性能。利用薄膜镀膜技术,可以制造各种各样的滤光片设计,包括长通或短通边缘滤光片、窄带或宽带滤光片、多带通滤光片和二色分光镜。
干涉滤光片是多层薄膜器件。它们的光学特性源于控制两种不同介质之间界面处光的反射和传输的原理。这些原理可以很容易地外推到光与沉积在不同成分的基板上的单个薄膜相互作用的行为,类似于沉积在基板上的结构堆叠中的多个不同成分和厚度的薄膜层。干涉滤光片通常是通过在光学玻璃基板上真空沉积金属盐薄膜来制造的。如果使用几种不同的薄膜材料重复该过程,就会产生多层滤光片,提供多个反射或折射光的界面。
入射光在空气玻璃界面的反射是一个重要的概念,它调节显微镜中透镜、滤光片、镜子和其他光学组件的作用。当光线遇到透明玻璃表面时,大约 4% 的总入射辐射被反射。因此,一叠八个玻璃元件可以透射大约 50% 的入射光,其余的在 16 个玻璃表面(每个元件的前部和后部)反射。类似的效果是通过将多个薄膜涂层施加到玻璃基板上而产生的。幸运的是,可以仔细选择每一层的厚度和折射率,以控制界面处特定波长的反射和透射特性。
调节干涉滤光片结构的关键物理现象是光入射到两种透明介质之间的光滑界面时发生的反射。这种界面处的反射特性取决于两种材料的折射率、入射角和入射光的偏振方向(如果有的话)。当光入射到界面上时,一部分光进入第二介质并被折射,而另一部分在界面上反射(见图 4)。对于折射率为n(1)和n(2) 的两种介质,入射角 (i) 和折射角 (r)之间的关系,如图 4 所示,由斯涅尔定律给出:
参考入射角和折射角(i和r),界面处两个偏振光分量的反射率由以下表达式决定:
其中R(p)是平行于入射平面的偏振光的反射率,称为p偏振光,R(s)是垂直于入射平面的偏振光或s偏振光的反射率. 在垂直入射时,不会出现偏振差异,并且总反射率 (R) 等于s和p分量的反射率,如公式所示:
考虑到这种关系,对于穿过空气(其折射率为 1.0)并进入折射率为 1.5 的玻璃光学元件的光波,每个空气-玻璃表面的反射率 (R) 为 0.04,或者两个表面垂直入射时的反射率 ( R ) 为 0.08 .在前面的八个堆叠玻璃元件的示例中,通过 16 个表面的透射率为 0.96 的 16 次方,即大约 52%(相当于 48% 的反射损失)。反射率方程表明,对于空气中的玻璃元素(n(1)等于 1.0),反射率随着n(2)值的增加而增加.未镀膜玻璃元件的高反射损失强调了在光学元件上加入有效的抗反射涂层可能带来的潜在好处。另一个对光学涂层功能至关重要的因素,特别是对于干涉滤光片,是当光穿过界面传播时,如图 4(a) 所示,如果n(2)大于n(1),反射波经历 180 度的相位变化。
由两种相邻介质之间的折射率不匹配产生的反射率变化,结合反射时发生的相变,提供了一种机制,通过该机制可以利用光学干涉来调制光学元件对所需波长区域的透射和反射. 通过将透明介电材料薄层沉积到玻璃基板上,可以控制特定波长范围的反射和透射,而不会显着损失光强度。通过适当选择介电折射率、层厚度和层数,可以在非常宽的范围内定制干涉光学的光谱特性。
无论设计用作边缘滤波器还是带通滤波器,多层薄膜器件都通过相长干涉和相消干涉现象进行波长选择。它们基于相同的原理,并且在大多数情况下可以归类为Fabry-Perot干涉仪(图 5(a))。这些简单的干涉仪依靠多重反射波前之间的干涉来传输选定的波长范围,同时阻挡所有其他波长。首先考虑单色光入射在玻璃基板上的单个薄膜介电涂层上的简单例子,最好地描述这种类型的滤光片的操作机制,薄膜的折射率介于空气和玻璃。具有折射率n(1)、n(2)和n(3)的三种介电材料如图 4(b) 所示。薄膜的厚度为t,分离半无限厚的材料。
在图 4(b) 描述的配置中,每个界面都会发生一些反射,通常称为菲涅耳损耗(或菲涅耳反射,以奥古斯丁菲涅耳命名)。反射的入射光比例可以从总反射率 (R)方程确定,分析表明,随着界面上的折射率差异 (n(2)-n(1)),菲涅耳损耗变得更大) 增加。当光通过薄膜传播并进入第三种介质时,一个合乎逻辑的假设是透射强度会因两个界面处发生的菲涅耳损耗之和而降低。然而,如果薄膜厚度很小(在光波长的数量级),从两个表面反射的波之间会发生干涉,这可能会增加或减少总的组合强度。干涉的性质取决于在每个表面反射后波前的相位关系,而这又取决于波长、材料的折射率和入射角。
如果薄膜折射率n(2)介于空气和基板的折射率之间,则入射光反射发生在空气-薄膜界面和薄膜-基板界面,如图 4 中的红波所示( b)(注意入射角被大大夸大了)。从界面反射的光线之间的相位关系由相对于光波长的薄膜厚度和折射率的比较值决定。因为n(2)大于n(1),所以从第一表面(薄膜表面)反射的光波表现出 180 度的相变。如果选择薄膜厚度使得光学厚度(厚度的乘积,t,并且折射率n(2)) 等于光波长的四分之一 (λ/4 ),通过薄膜传播并从薄膜-玻璃界面反射的光线经历了 180 度 (λ/2) 反射时的相变。此外,在波通过薄膜返回时会发生第二个 180 度相位变化。与第一条反射光线的半波长相位变化相比,该光线的净全波长相位变化导致两条反射光线之间的相位差为 180 度,并产生相消干涉。随着反射光线被有效抵消,四分之一波长厚度的薄膜起到抗反射光学涂层的作用。在其结构中采用多层薄膜的长通和短通滤波器,如果设计得当,将显示出抗反射特性。
通过使用不同折射率的薄膜材料,可以简单地改变两条反射光线之间的相位关系。应用与上述相同的配置,但薄膜折射率大于基板的折射率(以及空气的折射率),第一次反射将产生相同的 180 度相变。然而,通过薄膜传播的光线在反射时不会改变相位,因为n(2)现在大于n(3),并且只获得与双程相关的正常 180 度相位滞后 (λ/2)通过四分之一波厚 (λ/4) 电影。两个反射波前(每个波前具有 180 度的相变)之间发生相长干涉,因此与较低折射率薄膜涂层的反射率相比增加了反射率,并使光学元件起到部分反射器的作用。
通过利用薄膜干涉技术,可以制造各种有用的器件。从前面的讨论中可以明显看出,可以微调薄膜涂层特性以利用多重反射波前的叠加。波之间的干涉现象的性质可以是纯粹的建设性、破坏性或许多中间相位关系中的一种。以抗反射涂层结构为例,如果薄膜的光学厚度不是四分之一波长的整数倍,则两次反射的相位相差不完全是 180 度。因此,干扰并不是完全破坏性的,会导致反射率超过理论最小值。可以利用其他相位关系来操纵薄膜的透射和反射特性。二分之一波长厚度的介电薄膜层产生 360 度(全波)的相变,并且可以用作对特定设计波长的反射率或透射率没有影响的缺席层。对于仅由介电材料组成的结构,组合的透射和反射光线能量等于入射光能量。
干扰滤波器设计
沉积在滤光器基板上的薄膜层的组成和排列决定了器件的透射和反射特性。当具有相同波长的光波占据相同的物理空间时,它们会以由它们的相对相位和幅度决定的方式相互干扰。如果波完全异相(180 度),并且它们的振幅相等,则它们相互抵消以产生零振幅的波,则干扰是破坏性的。当两个波彼此完全同相时,它们会相长干涉以产生更大振幅的波。由多层组成的薄膜光学涂层被设计成使层边界之间的光学距离(通常是整数倍波长的整数倍)控制多次反射和透射光波的相位差。光学涂层中连续施加的层有效地构成了边界的堆叠,每个边界产生反射和透射分量,随后从其他边界反射和透射。通过这种多层结构传播的多色光将受到特定波长的相消干涉和衰减,以及与其他波长的增强传输的相长干涉。每个都产生反射和透射分量,这些分量随后从其他边界反射和透射。通过这种多层结构传播的多色光将受到特定波长的相消干涉和衰减,以及与其他波长的增强传输的相长干涉。每个都产生反射和透射分量,这些分量随后从其他边界反射和透射。通过这种多层结构传播的多色光将受到特定波长的相消干涉和衰减,以及与其他波长的增强传输的相长干涉。
涂层性能特征受层状结构中边界的数量、每个边界上的折射率差以及涂层内边界之间的距离的影响。干涉滤光片制造商在专业设计软件的帮助下应用光学薄膜理论来优化特定应用的特性。通过改变薄膜结构,可以非常精确地控制滤波器性能规格。通过薄膜设计控制的特性包括透射和反射的程度、发生透射和反射(和中间跃迁)的光谱范围的范围以及偏离垂直入射角的偏振效应。图 6 中显示了通常用于描述干涉滤光片的关键光谱特性和命名法。包括峰值和平均透射率值的位置,以及中心波长(CWL)为带通滤波器和所述切口上和截止值短通(黄色曲线)和长通(蓝色曲线)滤波器,分别。还指出了图 6 中带通光谱曲线(绿色曲线)的阻塞范围。
如前所述,四分之一波长介电层可以设计为用作玻璃基板上的抗反射涂层,或者,建设性地加强反射。该四分之一波长叠层反射器(见图5(b))的是由两个或更多的电介质材料的交替层,并且被用作基本构建块用于光学薄膜装置。每一层的设计光学厚度只满足一个特定的波长值,称为主波长的设备。图 5(b) 中所示的四分之一波堆叠反射器光谱分布是从一个装置中获得的,该装置由 23 层交替组成,在玻璃基板上交替出现硫化锌(折射率为 2.35)和冰晶石(折射率为 1.35),其中主波长为 550 纳米。可以采用轻微的设计修改来消除下降(通常称为振铃) 在传输区域,优化用作长通或短通截止滤波器的元件。这种组合物的涂层在主波长处表现出最高的反射,并且透射高于和低于主值的波长。涂层性能是主波长反射波相长干涉的结果,以及由于透射波之间的相消干涉而使总透射率最小化的结果。四分之一波堆叠反射器适合用作阻带滤波器、阻断器和截止滤波器。
窄带干涉(带通)滤波器的工作原理与法布里-珀罗干涉仪相同,依赖于多个反射光束之间的干涉。在典型的法布里-珀罗干涉仪(为光谱应用而构建;见图 5(a))中,入射光在位于两个反射面之间的中央透明(空气)介质中经历多次反射。每个透射波前在定义干涉仪腔的表面之间经历偶数次反射。出现的波前之间的相位差决定了传输最大值是否发生,或者大部分光被反射回源。对于给定的入射角,特定条件占优势的波长区域,n等于 1.0) 等于物理厚度。
最简单的基于干涉原理的带通滤波器是薄膜固体法布里-珀罗干涉仪,通常称为腔或单腔涂层.通常,这些滤光器是通过用薄膜隔板分隔两个薄膜反射器来构建的(如图 7 所示)。在全介电腔中,传统的气隙被一薄层介电材料取代,该介电材料的光学厚度等于主要设计波长(所需的传输峰值)的整数半波长。薄膜高反射器是普通的四分之一波长堆叠反射器,其宽带反射率在主要设计波长处达到峰值。由于其半波长厚度,分隔反射器的隔离物在主波长处引起透射而不是反射,因此支持腔内的多次反射。波长长于或短于主波长的光会获得相位差,使反射最大化而透射最小化。这种干扰现象的组合产生了有效的带通滤波器。滤波器的特性,例如通带区域的宽度、通带内的传输水平以及该光谱区域外的阻塞范围,由层数及其排列决定。窄通带通常是此类滤波器的设计目标,它是通过增加构成腔体的四分之一波长堆栈的反射率和增加薄膜间隔物的厚度来实现的。例如通带区域的宽度、通带内的传输水平以及该光谱区域外的阻塞范围等,都由层数及其排列决定。窄通带通常是此类滤波器的设计目标,它是通过增加构成腔体的四分之一波长堆栈的反射率和增加薄膜间隔物的厚度来实现的。例如通带区域的宽度、通带内的传输水平以及该光谱区域外的阻塞范围等,都由层数及其排列决定。窄通带通常是此类滤波器的设计目标,它是通过增加构成腔体的四分之一波长堆栈的反射率和增加薄膜间隔物的厚度来实现的。
干涉滤光片的详细结构可能有很大的变化范围。尽管许多完全由介电材料构成,但宽带干涉滤光片设计通常在垫片中包含金属层。即使在全介电滤波器中,金属薄膜层通常也包含在辅助结构中,作为某些光谱区域的阻塞滤波器(图 7)。金属-介电-金属 ( MDM ) 腔可用于涉及紫外线过滤的应用,紫外线将被全介电结构完全吸收。在这种类型的固体法布里-珀罗干涉仪中,反射器是金属薄膜,由具有整体半波长厚度的介电材料间隔层隔开。
如上所述,典型的四分之一波长堆叠反射器由高折射率和低折射率介电材料的交替层构成(见图 7 和图 8)。一对高低指数层构成最简单的周期,通常在构建具有所需性能特征的堆栈时重复多次。两个叠层与适当的间隔层的组合构成了单腔过滤器。两个或多个这样的腔可以与匹配(无)层耦合以形成多腔通带滤波器。图 7 说明了典型的双腔通带干涉滤波器的详细结构。由多腔结构产生的总传输通带大约等于各个腔的值的乘积。因此,随着腔数的增加,通带斜率的截止边缘变得更陡,通带外的反射率增加(见图 9),从而改善了对通带区域附近波长的抑制。
在光学薄膜技术的术语中,通常用字母H来表示高折射率材料的四分之一波长光学厚度层,而将低折射率材料的四分之一波长光学厚度层表示为L(图 7 和 8)。各种指数和分数名称与字母组合用于表示周期数和堆叠层的光学厚度。通常,指定干扰滤波器结构的术语是每个制造商所特有的。硫化锌是一种常用的高指数材料,而冰晶石是一种天然存在的氟化铝钠矿物,通常用于低指数层。间隔层是高折射率材料的半波长厚膜,缺席(耦合)层由具有半波长厚度的低折射率材料组成。
如前所述,带通干涉滤光片设计中采用的腔数会影响滤光片区分带内和带外波长的能力。图 9(a) 显示了典型的透射曲线作为波长的函数,用于构建具有不同腔数的几种理论滤波器。在等效的带通和中心波长处,随着腔数的增加,在远离主波长的波长处,通带外的光衰减程度更大。对于大量腔,滤波器的传输通带接近所需的方波轮廓,表明传输和衰减波长区域之间的急剧转变。在实践中,这种滤光片特性体现在改进的波长辨别力和更高的能量传输效率。具有急剧截止和截止跃迁的带通滤光片可有效分离具有小斯托克位移的荧光染料的激发波长和发射波长。
通过考虑渗漏的潜在影响,可以最好地说明采用大量腔的滤波器设计改进波长区分的重要性进入相邻的过滤器或腔体堆叠。在实践中,当激发能量通过发射滤光片传输时,这种伪影发生在荧光显微镜中。渗漏的结果是将不希望的激发光能量添加到作为样品荧光检测的信号中,从而增加了背景水平并提高了荧光检测的下限。图 9(b) 显示了典型的干涉滤光片透射曲线,使用三腔和五腔设计,分别以 435 和 460 纳米的激发和发射波长为中心。激发和发射波长的差异很小,五腔滤波器设计表现出的通带轮廓更陡峭的过渡显着减少了潜在的渗透,因为光谱重叠区域出现在低得多的透射值下。为了使用三腔滤光片获得可接受的渗透水平,必须选择两个滤光片的中心波长并附加波长分离。对于具有小斯托克位移的荧光染料,这种方法会显着降低荧光激发和检测的效率。
除了上述基本设计特征之外,将干涉滤波器与特定应用相匹配还需要考虑通过滤波器构造中的先进技术优化的性能特征。光学系统中滤光片所达到的功能水平取决于该设计与系统中其他组件的集成程度。尽管干涉滤光片在被视为隔离组件时可能满足所有主要性能要求,但特定的光学系统标准通常需要将其他结构合并到滤光片组件中。例如,与在宽光谱范围内工作的光源或检测器一起使用的滤波器需要一种机制来扩展衰减范围超越了多层涂层单一基材表面所提供的效果。此外,如果采用非常强的照明源或高度灵敏的检测器,则可能需要增加衰减水平。尽管一些光学系统提供了足够的物理空间用于结合单独的吸收或反射元件,但这些阻挡或衰减元件通常与初级干涉涂层组合成单个组件。
向滤波器添加专门的组件以增加衰减总是会导致所需波长的一些传输损耗,并降低系统的总光通量。因此,设计用于阻塞的策略旨在为特定应用提供传输和衰减之间的最佳平衡。例如,阻挡可能被设计为仅在符合检测器灵敏度的波长范围内提供衰减,同时允许光能传输到检测范围之外。
在带通干涉滤光片中,例如图 7 中所示的双腔示例,可以通过添加多层薄膜阻挡结构来提供与通带(在长波长侧)相邻的阻挡。对于图 7 所示的理论滤波器,金属-电介质混合阻塞滤波器执行此功能。在具有类似设计的典型商业产品中,多层阻塞滤波器将通带长波长侧的透射率限制为大约 0.01%。通常,必须根据过滤器目标性能要求和生产更复杂组件的更高成本来权衡更大的阻塞水平和随之而来的整体传输损失之间的折衷。
还可以通过使用吸收组件来进一步减少或消除不需要的波长,这些组件通过在特定波长区域中衰减同时继续传输所需波长来实现。吸收性有色玻璃通常用于抑制干涉滤光片通带短波长侧的透射。这种玻璃元件既可以用作干涉涂层的基材,也可以在制造后层压到滤光片组件上(见图 7)。薄膜涂层材料,包括电介质和金属,也可用于通过吸收提供衰减。除了吸收性玻璃组件外,还可以在滤光片组装过程中将染料添加到光学胶中,以为滤光片系统的主要带通特性提供补充吸收值。
尽管吸收材料对于某些阻塞和衰减功能是理想的,例如与通带相邻的短波长阻塞,但它们的规格不一定适用于所有应用。在许多情况下,吸收介质不能提供必要的透射度、吸收水平或截止过渡曲线。此外,这些材料由于过度吸收能量,通常容易受到温度升高的影响,这可能导致显着的波长偏移或对光学系统的物理损坏。
为了提供更高水平的性能(尽管成本更高),通常采用介电薄膜涂层来扩展整个设计光谱区域的衰减。为主要干涉结构提供补充过滤,这些额外的介电涂层可以应用于基板并层压到过滤器组件上。几个阻塞组件,可以是长通、短通或非常宽的带通,可以组合起来在所需的光谱区域提供高透射率,同时在初级涂层“泄漏”不需要的波长的区域产生高反射率。图 10 说明了主要带通滤波器的频谱特性,其中添加了几个阻塞组件以扩展衰减范围。
许多选项可用于自定义干涉滤波器性能。使用全介电涂层的一种流行替代方法是包括金属薄膜带通涂层。这种策略更简单,因为单个涂层元件通常会将衰减扩展到远红外光谱区域。金属涂层的主要缺点是它们具有吸收性,并且可能会将所需通带中的透射率降低到 10% 到 60% 之间的水平。相比之下,类似的全介电滤波器通常允许通带区域中的传输值为 45% 到 85%。
扩展单涂层滤波器衰减区域的两种常用策略称为阻塞优化和阻塞完全。为优化阻塞而设计的滤波器通常与光谱灵敏度有限的检测器一起使用,而完全阻塞则应用于与表现出全范围光谱灵敏度的检测器一起使用的滤波器。设计用于优化阻塞特性的滤波器将通带短波长侧的有色吸收玻璃元件与通带长波长侧的介电反射器结合在一起。完全阻塞的滤波器设计利用金属薄膜带通涂层,通常辅以有色玻璃组件以增强短波长的衰减。
大多数干涉镀膜设计为过滤垂直入射角的准直光(镀膜垂直于光路)。光以与滤光片表面法线不同的角度入射会产生多种影响:中心波长移至较低值,这对于两个正交偏振分量不同,总透射率降低,带宽增加。光学设计人员必须考虑这些因素,以便在相对于法线的显着角度使用的组件(例如分束器)以及当滤光片未按预期方向对齐时用户。对于采用干涉涂层的边缘和带通滤波器,都观察到倾斜角的影响。对于距法线小于约 25 度的入射角,对透射率和带宽的影响可以认为是最小的。然而,波长漂移很重要,有时会被用来精确调谐窄带滤波器的中心波长。这当入射角偏离法线时发生的偏振分裂非常重要,虽然它可以在某些应用中发挥优势,但通常被认为是干涉涂层的不良特性。与角度相关的偏振是主要限制因素,可防止 45 度双色分束器的切入跃迁与在法向入射时使用的边缘或带通滤光器的切入跃迁一样陡峭。干涉滤光片引起的偏振效应根据入射到滤光片上的光在透射之前是已经偏振还是未偏振而采取一些不同的形式(参考图 11 进一步讨论)。
考虑到干涉滤光片由一系列具有精确控制的光学厚度的介电层(可能还有金属)组成,可以理解滤光片角度相对于光路的特性变化。增加入射角会增加层的(表观)光学厚度,并且还会减少干涉光波之间的相位差。对于单层和多层介电涂层以及结构更复杂的干涉滤光片,随着入射角的增加,透射和反射光谱向较短的主波长移动。配合一些滤光片(如二色分光镜和带通滤光片),在倾斜入射角下向更短波长的转变被有意用作微调主波长的机制。以相对较大的倾斜角为例,a665LP(长通)滤光片(665 纳米处峰值透射率的 50%)在 45 度入射角时与605LP滤光片相同。
当滤光片倾斜时观察到的中心波长减少是薄膜折射率和入射角的函数。通过对干涉涂层的有效折射率使用单一值,主波长偏移与入射角之间的关系简化为角度为θ的准直光的以下表达式(适用于小于25度的角度):
其中λ(θ)是在发病率,的角度的主波长θ,和λ(0)是在法向入射(0度)的主波长。外部介质的折射率(指定为n(0);空气为 1.0)和过滤器的有效折射率 (n) 是等式中的其余变量。
干涉滤光片的有效折射率由涂层材料及其沉积顺序决定,这些因素可以在设计过程中控制。当常见的介电材料(如硫化锌和冰晶石)用于构建标准可见光和近红外带通滤波器时,有效折射率的实验值通常为 1.45 或 2.0,具体取决于间隔层是由低或高折射率材料。为隔离层选择的材料是过滤器设计者可用于将过滤器性能与特定应用相匹配的重要变量。包括高指数间隔物(例如硫化锌)有助于最大程度地减少波长随入射角的偏移,而低指数间隔材料(通常是冰晶石)可实现更高的透射率和更窄的通带宽度。在实践中,由于实际折射率的变化等因素,观察到的波长偏移可能与计算值略有不同。如果入射角很大(大于大约 30 度),透射率变得明显取决于偏振,并且通带特性偏离到可以观察到不止一个透射峰的程度。
由于非法向入射角引起的偏振变化是大多数光学配置中的次要因素,但在某些干涉滤光片应用中是一个重要的考虑因素。虽然可以设计干涉涂层来最小化偏振效应,但不能完全消除;如前所述,可以在一些仪器技术中有利地利用两个正交偏振光分量之间的特性差异。在大于法线的角度下,平行于包含入射和反射光线的平面振动的光波(p偏振)表现出与垂直于入射和反射平面振动的波(s偏振)不同的透射分布)。图 11 显示了长通和带通滤光片的透射曲线,其中光以 0 度入射,非偏振光以 45 度入射,以及两个正交偏振分量以 45 度入射。s 偏振光和 p 偏振光过滤的显着差异是显而易见的。曲线还表明,非偏振光在大 45 度入射角处表现出向较短波长的显着偏移,并且在主峰的短波长侧有一个额外的透射峰。一个重要的实际考虑是,如果设计 45 度二色镜以反射在 s 平面偏振的特定激光线,则对于相同的 p 偏振光或随机偏振光,其性能将有所不同。波长。
干涉现象的性质,如应用于薄膜干涉滤光片结构,无论哪一侧面向光源,都会产生相同的光谱性能,至少在通带内和附近的透射率方面如此。然而,因为大多数带通干涉滤光片是用吸收性辅助阻塞元件构成的,所以滤光片的每一侧通常会有明显不同的外观。一侧通常会出现镜面反射或高度反射,并且几乎无色,而另一侧可能会出现深色或不透明。在大多数应用中,过滤器的方向应该是高反射性的金属状表面面向辐射源。在这个配置中,过滤器拒绝的大部分辐射会从过滤器组件的内部组件反射出去,从而最大限度地减少吸收玻璃元件的热量并减少组件上的热应力。制造商通常会在滤光片边缘放置箭头或类似标记,以指示光路中的正确方向。
干涉涂层生产方法
干涉滤光片的构造依赖于在具有合适光学特性的支撑基板上精确沉积极薄的材料层。薄膜生产技术是一个复杂而广阔的领域,是电子和光学行业的重要组成部分。这里只提供了用于生产干涉滤光片的方法的一般总结。用于薄膜干涉涂层的材料选自具有适合目标应用的光学特性的有限组。感兴趣波长的透射、折射和吸收特性必须适当。此外,蒸发和冷凝特性是涂层过程中需要考虑的重要变量。
薄膜光学涂层通常通过真空沉积工艺制造,例如真空蒸发或溅射。物理气相沉积 ( PVD ) 工艺非常适合生产精密过滤器涂层,因为这种工艺的几何形状与厚度监测和自动控制技术兼容。物理气相沉积是一种原子过程,其中从固体源蒸发的材料以气相传输通过真空或低压气体或等离子体环境,然后冷凝到基材上。通过热阻或电弧蒸发、溅射和离子镀技术进行真空沉积是 PVD 工艺。
无论沉积薄膜涂层的蒸汽生产方法如何,制造过程的某些方面都是相似的。许多未涂层的基板被放置在一个能够实现高真空的大腔室中(如图 12 所示)。在单个生产运行中要蒸发和沉积的每种材料的源在抽真空之前放置在腔室中。多层涂层通常在不打开真空室的情况下连续沉积。在大多数情况下,基板安装在允许它们以行星运动旋转的设备上,从而使每个基板最均匀地暴露在蒸汽中。仔细控制源材料的蒸发速率和沉积条件,例如温度、压力和源-基板几何形状,会导致蒸汽云均匀地凝结在旋转的基板上,从而形成连续的薄膜涂层。
随着沉积的进行,增加的薄膜厚度被光学监测,当达到精确的所需光学厚度时,基板被屏蔽或停止蒸发。多层涂层通常由多达一百层组成,通过用两种或多种按所需顺序沉积的材料重复涂层循环来生产。用于控制薄膜沉积的光学监控过程利用了与生产滤光片涂层相同的干涉特性。在镀膜周期中,特定波长的监控光束穿过真空室并入射到空白参考基板上。从基板反射的光由相位敏感的光电倍增管装置检测。随着空白基板上沉积层的厚度增加,反射光的强度根据反射光束之间发生的干涉性质而变化。当相长干涉和相消干涉的条件交替获得时,反射强度以近似正弦波模式振荡。交替强度曲线的转折点代表监测波长处的四分之一波和半波光学厚度,这些点由中间厚度值分隔。每层的沉积由监测电路在适当的反射率值处终止。当相长干涉和相消干涉的条件交替获得时,反射强度以近似正弦波模式振荡。交替强度曲线的转折点代表监测波长处的四分之一波和半波光学厚度,这些点由中间厚度值分隔。每层的沉积由监测电路在适当的反射率值处终止。当相长干涉和相消干涉的条件交替获得时,反射强度以近似正弦波模式振荡。交替强度曲线的转折点代表监测波长处的四分之一波和半波光学厚度,这些点由中间厚度值分隔。每层的沉积由监测电路在适当的反射率值处终止。
尽管在真空沉积应用中已经开发了许多用于蒸发涂层材料的技术,但其中只有两种通常用于制造薄膜干涉滤光片。原来的方法,可以追溯到真空镀膜技术的初始开发和仍然被广泛使用,依赖于电阻性热蒸发通过小的折叠的条状物直接加热(或船) 含有涂层材料的钨、钼或钽。通过在舟皿中通入高电流,涂层材料被热蒸发并迁移通过真空室,重新凝结成基材上的薄膜。热蒸发存在许多问题。主要的困难是熔化有用的涂层材料所需的高温,这会产生副反应,导致沉积膜受到污染。此外,许多具有理想光学特性以及高耐用性和透明度的材料都是历史上用于制造玻璃和陶瓷的相同耐火氧化物。这些耐火材料的高熔点,特别是金属氧化物,防止它们从金属舟中蒸发,它们本身在较低的温度下熔化。如果仅限于这种蒸发技术,薄膜涂层只能由挥发性相对较高(中等熔点)的材料生产,不幸的是,这些材料的耐久性和环境耐受性较差。这些薄膜的低回弹性也使得生产需要许多涂层的复杂过滤器变得不切实际。
用于熔化或升华源材料的电子束枪的发展已经缓解了电阻加热技术中固有的许多问题。 电子轰击已成为光学薄膜生产的首选方法,使难熔金属氧化物(如二氧化硅、铝和镁的氧化物)以及过渡金属氧化物(包括氧化钛和氧化锆)的挥发成为可能。该方法包括将高通量电子束(在 10 千伏电势下约 1 安培)聚焦到包含在大型冷却坩埚中的涂层材料上。源材料的强烈局部加热和蒸发避免了与相对较冷的坩埚发生任何反应。此外,电子枪可以根据需要进行聚焦以产生足够的强度以蒸发甚至具有极低挥发性的物质。反应蒸发)以提高工艺产量。
近年来,已经开发了几种新的制造技术,可以显着改善通过物理气相沉积方法生产的薄膜涂层的性能。被称为高能 PVD 工艺,最常见的例子是离子辅助沉积、离子束溅射和反应磁控溅射。在许多情况下,高能 PVD 方法可以制造出具有改进特性的薄膜,包括更高的密度、更高的折射率、降低的光谱性能对温度和湿度的敏感性以及优异的机械特性(例如耐用性)。
离子辅助沉积是蒸发方法的一种改进,它利用源材料的直接热蒸发或电子束蒸发。添加在涂布过程中用离子轰击基材的高能离子源导致膜层中的堆积密度增加,并且伴随着折射率的增加和涂布基材的机械特性的改善。更密堆积的薄膜中空隙的减少降低了吸水的可能性,吸水是机械故障和光学性能变化的常见原因。根据沉积的薄膜,可以采用各种离子种类,包括氧气或惰性气体,例如氩气。
在离子束溅射技术中,高能离子源用于用高速离子轰击金属或电介质氧化物靶。靶材的原子从靶材表面发生物理位移或溅射,其中一部分在涂层基材上凝结成薄膜。该工艺的一种变体,有时称为双离子束溅射,在生长过程中添加第二个离子束,以类似于有时与蒸发技术一起使用的离子辅助轰击的方式,用氧气、氩气或其他气体轰击薄膜。
第三个高能 PVD 工艺,即反应磁控溅射,已应用于干涉涂层的生产。这种技术的优点是可以制作出具有与离子束溅射薄膜相当的理想特性的薄膜,但沉积速率要高得多。反应磁控溅射采用金属或半导体靶的直流磁控溅射来产生薄膜,该薄膜与基材反应形成所需的氧化物层。已经发现了改进工艺的变化,包括在薄膜生长过程中对衬底的氧离子轰击。
多种基材材料可用于制造薄膜干涉滤光片,选择它们以满足其预期应用的光学和机械要求,以及它们的物理特性与所需涂层材料的兼容性。对于各种应用中的光学基板材料而言,重要的特性包括感兴趣的波长范围内的透射率、热膨胀系数、密度和抗激光损伤。材料还应耐化学腐蚀,以及机械和热冲击。一些较常见的光学基板材料有氟化镁、氟化钙、Suprasil 1(各种熔融石英的商品名)、紫外线级熔融石英、Infrasil 301(低羟基含量的天然熔融石英产品的商品名)、 水晶石英、BK7(一种硼硅酸盐皇冠光学玻璃)和蓝宝石。
激光扫描共聚焦系统的其他注意事项
扫描共聚焦技术的实施对荧光成像中使用的光学元件提出了许多额外要求,包括作为荧光组一部分的干涉滤光片。使用激光照明时的一个常见误解是特定的激光只产生一种波长的光。实际上,几乎每个激光器都会从多个波长的散射中产生额外的谐波和光。尽管这些次要谱线的强度相对于主要谱线(或多条谱线)而言通常较低,但它们仍会严重影响系统信噪比特性。如果所需的发射线与噪声位于相同的波长区域,则通常较弱的荧光信号可以被谐波或散射光完全掩盖。为了缓解这个潜在的问题,在照明路径中加入了一个激光净化滤光片作为第一个光学元件。该滤光片实际上是激发滤光片的改进变体,对于激光照明,需要研磨和抛光以达到高光学质量。尽管宽场技术不需要在照明路径中具有相同的精度,但对于共聚焦应用,应抛光净化滤光片以显示每英寸小于一个波长的透射波前畸变。
同样,清洁滤光片的楔形规格应最小化(小于 1 弧分),以允许在同一光束路径(多条激光线)中使用不同的滤光片,而无需重新调整光学元件。这种类型的滤光片通常采用层状结构制造,最大限度地提高反射特性,以避免强烈激光辐射对滤光片造成热损坏。然后将净化过滤器安装在与垂直线(相对于光轴)成几度角的位置,以防止过多的反射光重新进入激光腔并造成损坏,从而缩短激光器寿命。典型的激光净化滤光片旨在阻挡来自激光源的所有光,但通带大约为 10 纳米的光除外。
在共聚焦荧光应用中,二色镜或分束器还必须满足比宽视场显微镜更严格的规范。透射波前畸变和楔形规格均不应超过每英寸一个波长。由于以一定角度放置在光束路径中的任何光学元件都会引入偏振变化,因此对于二色镜也必须考虑这个因素,特别是因为大多数激光源都是偏振的。两个正交偏振光束分量的不同分束器透射或反射分布可能导致极端情况,其中在一个方向偏振的光被反射,而在垂直方向偏振的相同波长的光被透射。
共聚焦荧光系统中发射滤光片的功能与传统宽视场显微镜中的功能相同,尽管必须阻止的激发辐射发生在较窄的光谱区域。与宽带照明源(例如汞弧光放电灯)相比,激光激发线的功率增加可能需要针对主要激发波长设计具有更严格阻挡规格的激光源滤光器。发射滤光片通常被研磨和抛光到用于宽场显微镜的精确光学规格,这通常也被认为适用于共聚焦成像。对于共聚焦扫描系统中发射滤光片的严格要求的重要性存在一些分歧,它从光电倍增管检测器信号中以串行方式逐个像素地形成图像。由于保持共焦性和排除平面外信号所需的高精度,额外的精度可能有益于限制信号失真的程度。
结论
许多专门的显微镜技术显着受益于这样一个事实,即控制干涉滤光片操作的基本原理能够在大而实用的范围内相对简单和精确地操纵滤光片光学特性。干涉滤光片技术成功的关键之一是制造方法的多功能性,这使得能够为许多应用生产种类繁多的滤光片。一旦通过计算机建模和模拟测试确定了设计细节,在某些情况下,可以通过制造变化来生产完全不同的过滤器,就像将不同的源材料加载到真空镀膜系统中并重新编程镀膜参数一样简单。