试样的照明是在显微镜和显微摄影的关键或数字成像实现高品质影像的最重要的变量。 柯勒照明是由卡尔蔡司公司的奥古斯特·柯勒在1893年首次推出为提供最佳的标本照明的方法。 制造商已经设计现代显微镜使内置在显微镜的基座集电极透镜和任何其它光学元件将投射灯丝的放大和聚焦的图像投影到一个适当定位台下聚光的孔径光阑的平面。 关闭或打开所述聚光镜膜片控制所述光线从聚光镜新兴并到达从所有方位角试样的角度。 因为光源不聚焦在样品的水平,在检体水平的光基本上是颗粒少和均匀的,和聚光镜的玻璃表面上不会受到灰尘和瑕疵的恶化。 这种互动式的教程将探讨如何建立一个透射光显微镜柯勒照明。
本教程的出现在显微镜视随机选择的样本进行初始化。 所有的隔膜和聚焦设置也随机化。 为了操作教程,先点击对齐灯丝单选按钮来调整灯丝位置和灯光强度。 移动的灯丝旋转 , 灯丝聚焦 ,和长丝强度滑块直到长丝垂直于聚焦在9至10伏的灯强度的位置。 使用调整灯丝横向滑块在显微镜口的正中心灯丝位置(也是在调整窗口的中心标志是一个红色的靶心)。 一旦灯丝排列,点击对齐聚光镜单选按钮,然后使用调节聚光镜横向滑块在该窗口的正中心的十字线位置(注意,游标可以通过点击白色圆圈作此调整)。 然后,调整聚光镜光圈滑块,直到开口尺寸等于75%到80%。 使用样品细焦点滑块来聚焦样本,并确保光圈大小滑块大约居中使膈肌虹膜可见。 使用聚光镜高度滑块聚焦视场光阑光圈和光圈大小滑块放大光圈,直到它不再是可见的。 柯勒照明现已成立。 另一种标本可以通过选择一个标本下拉菜单中选择。
要准备科勒照明显微镜的第一个步骤涉及必要明的条件下,观察样品的基本程序。 首先,如果所述聚光镜包含相位环形环,微分干涉对比棱镜,或其他光圈和过滤器,旋转转台到明孔径,这应该是开放的,而不是容纳一个过滤器或棱镜。 二,选择合适的标本。 最好的标本由良好染色明的样品,如非常薄的(8微米或更小)的动物或植物的组织。 如果一个准备好的滑动不可用,35毫米胶卷的一小部分(如透明性或负)大小约为10×10毫米值可以被录音或胶合到一个干净的玻璃显微镜载玻片,并用盖玻片平坦化。
在建立柯勒照明步骤
切换光源上并保持的纸的小片直接在显微镜底座发光场光阑聚光透镜上述(图1(a))。 这个练习的物镜是检查光源是否能正常工作,将光线投射到显微镜。 在没有光观察和纸张仍然黑暗的情况下,请检查电源线,照明,或许在动力单元保险丝,以确保电气元件都完好无损。 如果不是,改变照明灯。 当在显微镜正常运行时,光的一小点(图1(a))将在纸张上可见。
接着,通过转动控制杆或旋钮打开场光阑到其最宽的位置(完全打开)。 光投射到纸张(图1(b))当场将实现其最大直径。
下一步骤是移动的纸的片材,并将其放置在试样和物镜之间(图2(a))和完全打开聚光镜孔径光阑(通常由控制杆或位于聚光镜壳体上滚花旋钮控制。作为聚光镜膜片缓缓打开,光投射到所述纸张的强度会增加,在全开实现其最大亮度设置,当使用装备有一个低数值孔径聚光镜的摆动式前透镜元件,除去摆动透镜从光路之前尝试此过程。
聚光镜高度可以使用向上和沿着显微镜光轴向下平移此组件的驱动旋钮来调节(图2(b))。 设置聚光镜高度,使前透镜是样品载玻片的下表面之下约1至3毫米。 使某些聚光前透镜不接触的滑动(或从阶段向上推远)。 在极端的情况下,驾驶聚光镜入试样会导致在样品从舞台喷出时滑倒从保持导自由。 现代显微镜通常配备有一个可调节的止动螺钉,使聚光镜的顶部位置被固定在预先确定的高度。
光现在应该在显微镜目镜可辨别(如图3(a))。 如果光线太亮(常亮足以引起不适),直到找到一个级别是舒适的工作强度降低。 接着,通过双目镜筒的折叠桥设置的瞳距。 这可以通过将管挤压在一起以减小距离或拉动管分开,以增加它们之间的间隔来完成。 当光线(而不是两个)的单一大圈可以通过目镜方便地可视化达到正确的距离。 下一个步骤是检查,看是否在显微镜配备有聚焦目镜。 如果是这样,转动目镜零设置。 戴眼镜可以留下自己的眼镜上。
窥视镜,直到你看到的图像细节,大大地仔细移动舞台,包括标本,上下(如图3(b))。 在这一点上,可能有亮点和暗点或膜片遮蔽视场的一部分,作为照明配置还是不完整的。
现在,该显微镜的基本部件被设置,仪器准备就绪,可以配置为柯勒照明。 第一步是缩小视场光阑的尺寸,并通过调整旋钮,直至从场光阑叶片看到边缘的鲜明的图像上下平移的聚光镜(图4的(a))。 如果这个策略不工作,改变视场光阑的大小,然后再试一次。 在许多情况下,聚光镜尚未居中所以只有一个视场的边缘将包含视场光阑离开的元素。
在此阶段,视场光阑处于锐聚焦,但聚光镜尚未居中。 在显微镜聚光器安装框架上定心旋钮用于居中聚光镜(如图4(b))。 关闭视场光阑其最小的开立,使用定心螺丝搬迁明亮开放的视场的中心(十字标线是非常有用的确定视场的中心)。 一旦聚光镜为中心,打开视场光阑,直到叶子完全移出视场的。
在该过程这一点上,你应该几乎都要在视场一个合适的图像。 剩下的唯一任务是优化对比度。 请记住,你第一次打开聚光镜的孔径光阑才能看到更多的光线(如上所述)。 孔径尺寸现在必须以提高对比度,并寻求对比度和分辨率之间的适当平衡来校正。 请记住,关闭聚光镜光圈太远会严重降低分辨率和显著图像变暗。
您可以直接可视化叠加在物镜后方的焦平面( 物镜学生 )的孔径光阑如果从双目镜筒取下目镜安装,直接窥视管(图5(a)条)。 你的眼睛应该从管为最佳观测厘米10和20之间的路程。 而看不起管,打开和关闭聚光镜孔径光阑,直到你可以清楚地认识到在物镜瞳孔的形象。 最后,设置在隔膜的直径以这样的方式,它照亮瞳孔直径(见图5的(b))的百分数65和80之间,提供近全分辨率和最佳对比度。这样的折衷,通常在选择的分辨率,因为它主要是对比呈现图像上可接受的眼睛进行。 聚光孔径光阑调整后,将目镜回双目观察管安装。
显微镜现在应正确配置在柯勒照明标本观察,但只为用于设置在仪器的物镜。 当另一个物镜是旋转到眼镜直通车,你应该总是调整最佳照明聚光镜光圈和视场光阑(实际上,对比度与分辨率)的条件。 但是,通常没有必要使用一个新的物镜,每次取下目镜。 一旦孔径光圈尺寸已被设置为10倍的物镜,它往往是足够通过可视化图像,以适应其他物镜的大小。 首先打开光圈直到停止,然后直到图像开始变得稍深,对比度同时提高其关闭慢。 通常情况下,最重要的参数是达到适当的对比度。
从上面的讨论很明显,聚光镜的孔径光阑应设置的位置,将提供依赖,在相当大的程度,对试样的吸收,衍射,以及折射特性直接和偏离的光的折衷混合物。 这必须没有与文物,晦涩的细节和对比度当前错误增强铺天盖地的图像来完成。 图像细节和必要,以产生最佳显微照片对比度的量还取决于折射率,光学特性,与其他样品相关的参数。
当孔径光阑被错误太多闭合,偏离光开始模糊直接照射光线,产生衍射伪像导致可见条纹,带,和/或在显微照片图案形成。 其他的问题,比如折射现象,也可以产生的图像中的明显的结构,这是不实际。 或者,打开聚光镜光圈太宽导致从内镜下标本和光学表面多余的眩光和光散射。 这导致对比度和清洗的显著损失出的图像的细节。 正确的设置将试样而异标本,并且经历显微镜将很快学会通过观察图像精确调节聚光镜孔径光阑(和系统的数值孔径),而无需在物镜的后焦平面,以查看振动板。 事实上,许多显微镜认为显微镜系统,以优化图像质量的数值孔径的临界还原是在显微摄影的一个最重要的步骤。
显微镜的照明系统中,当调整适当的柯勒照明,必须满足几个要求。 样品平面的照射区域必须至少为视图对于任何给定物镜的字段一样大。 另外,光必须是均匀的强度的和数值孔径必须从最大值(等于物镜的)来表示将取决于试样的光学特性的最小值而变化。