为了使用显微镜以高倍率检查样品,需要考虑许多因素。这些包括分辨率,数值孔径(NA),物镜的工作距离以及物镜的前透镜通过其收集图像的介质的折射率。在本文中,我们将简要介绍在盖玻片和物镜前透镜之间使用浸没介质如何帮助提高NA和分辨率。另外,我们将考虑空气和由玻片和盖玻片组成的玻璃的折射率,以及当光从一种介质传播到另一种介质时,如何使用浸没介质部分减少失配。还有一些使用油浸系统的实用技巧,以及使用水浸物镜的好处,活细胞成像。
光学显微镜的主要问题之一是克服光学分辨率的某些限制并增加系统的数值孔径。简而言之,物镜的NA是从标本收集光的能力,而分辨率是物镜区分标本中细节的能力。
分辨率和不适用性将在其他文章中讨论,但我们现在将研究显微镜技术人员可用的浸没技术,该技术可以在不超出分辨率限制的情况下以高放大倍率对标本进行成像。
具有在适当位置的前面之间的空气间隙的浸没液体透镜的的目的和试样的玻璃盖片增加物镜的分辨率。当光从一种介质传播到另一种介质(例如,通过玻璃到空气)时,它会折射-换句话说,它会弯曲并散射。折射到空气中,被防护玻璃罩反射或实际上被物镜前透镜的金属外壳阻挡的任何光线均不会影响成像。浸没液体的目的是减少来自样品的光的折射和反射量,并提高物镜捕获否则会偏离的光的能力(图1)。
图1:左图:当光通过两种具有不同折射率(RI)的介质(例如,从玻璃到空气)时,它会折射。折射到空气中,被防护玻璃罩反射或实际上被物镜前透镜的金属外壳阻挡的任何光线均不会影响成像。右图:浸液的折射率与保护玻璃和样品所安装的介质的折射率相匹配,从而减少了样品的光的折射和反射量
光线穿过的介质的物理特性决定了光线的折射程度。“折射率”是数值(无单位),它是光在穿过材料时的折射程度的决定因素。空气的折射率为1.0,而显微镜载玻片和盖玻片的折射率通常为1.5。考虑到这种差异,浸没液体的目的是(尽可能接近地)匹配装有样品的玻璃的折射率,因此增加了形成图像的光线量。随后,大多数浸油的折射率为1.51。有关常见的折射率,请参阅表1。
浸入介质 | RI |
空气 | 1.00 |
水 | 1.33 |
甘油(100%) | 1.47 |
雪松油 | 1.51 |
徕卡浸油(标准和“ F”型) | 1.51 |
玻璃 | RI |
玻璃(硼硅酸盐或“ Parex”) | 1.47 |
玻璃(冠或钠钙) | 1.51 |
安装介质 | RI |
细胞培养基 | 1.31至1.33 |
Fluoromount-GTM | 1.4 |
ProLong®/ProLong® Gold | 1.46 |
VECTASHIELD® | 1.44 |
VECTASHIELD® Hard+SetTM | 1.46 |
Mowiol® | 1.41 – 1.49 |
理想的方案是创建所谓的“均质浸入系统”。使用该系统,可以获得大的分辨率和NA。均质浸没系统的目的是(尽可能接近地)匹配物镜前透镜,浸没介质,盖玻片/载玻片,安装介质和(原则上)透镜的折射率和NA。聚光镜(参见图2和表1)。
通常不需要将浸没液体放在聚光镜的透镜上。如果正确设置并对准显微镜以在整个样品上获得良好对比度和照明(请参阅有关科勒照明的文章),则将优化聚光镜的位置和设置,从而有助于显微镜系统的整体NA 。
图2:样品和物镜前透镜之间所有光学元件的折射率对图像质量有重要影响。理想情况下,它们应尽可能紧密地匹配,就像在此示例中一样,该样品安装在甘油基安装介质中。
显微镜物镜需要考虑的另一个因素是“工作距离”。这只是样品清晰聚焦时物镜前透镜与盖玻片表面之间的实际距离(图3)。当物镜移动到更靠近载玻片时,焦平面会进一步移动到样本中。但是,这在物理上受到以下限制:物镜只能移动,直到它与防护玻璃接触为止。工作距离与每个物镜的放大率之间存在反比关系。例如,一个10倍物镜的工作距离可能为4毫米,而100倍物镜的物镜的工作距离通常会在130毫米的范围内。相比之下,某些水浸式/水浸式物镜的工作距离约为3毫米。
图3:工作距离是物镜前透镜与保护玻璃表面之间的距离。
图4:油浸物镜非常适合安装在与玻璃折射率匹配的介质中的样品。
使用油镜时要记住的一个关键因素是使用正确匹配的浸油。仅使用物镜制造商推荐的机油。多年来,雪松木油通常用于浸泡(并且仍可商购)。尽管该油的折射率为1.516,但它有变硬的趋势,如果使用后不清除,可能会造成镜片损坏。此外,这种油会吸收蓝色波长和紫外线,并且随着年龄的增长也会变黄。
大多数现代机油是合成制造的,并经过标准化处理,以确保它们不会损坏镜片或不会随年龄而变色。需要牢记的一点是,浸油具有良好的工作温度。大多数商业合成油设计为在23°C下工作,仅1°C的变化将导致0.0004的折射率变化。还可以使用其他油在不同温度下良好工作,但是对于大多数目的,显微镜设备应保持在23°C的稳定状态(这对于容纳共聚焦显微镜等仪器也很重要)。
当使用油浸物镜(参见图4)进行荧光显微镜检查时,建议使用特殊的低自发荧光油。许多普通的油会在某些条件下发出荧光。大多数荧光显微镜用油是通过在油名称/代码之前或之后带有字母“F”来识别的。
首先以低倍物镜观察样品,以找到载玻片上感兴趣的区域。
达到40倍物镜并为Koehler照明设置显微镜。
在40倍和100倍物镜之间摆动物镜架(容纳物镜的转盘),但不要完全接合大倍率物镜。
从显微镜侧面看时,小心地将一滴浸油直接放在盖玻片上。将高倍物镜摆到适当的位置(并继续从侧面看镜台),先进行粗调,然后再进行细调焦,使物镜前透镜与油接触。某些油镜的前透镜是凹形的,这意味着您还应该在物镜上滴一滴油,以防止气泡陷入凹透镜中。
然后,您可以再次向下看目镜。仅使用精细对焦来调整视野。尽管大倍率物镜的前端带有弹簧,但在此阶段粗略聚焦很容易导致玻璃盖破裂或滑动,并且还会损坏物镜前透镜。
即使打算检查其他载玻片,在此阶段也应从物镜上清除油,以防止可能污染显微镜的其他部分。浸入的油会(并且会)渗透并损坏不适合浸入的显微镜组件和物镜。使用镜头清洁棉纸清除镜头上的油脂,清除一下。每次擦拭前,请用一块干净的纸巾擦拭物镜前透镜,直到没有油迹为止。可以使用市售的除油溶液,也可以使用少量的二甲苯最终清洁镜片。同样,在将任何解决方案应用于镜头之前,请务必检查物镜制造商的建议,这一点很重要。
图5:水浸物镜是一种特殊的水浸物镜,具有惰性尖端和长工作距离。
在研究级显微镜(通常是共聚焦显微镜)上发现的较不常见的浸入物镜是“水浸”物镜,通常在物镜镜筒上缩写为“ WI”或“ W”。当对细胞培养基中的活细胞成像时,强烈建议使用水浸物镜。有两种类型的水浸物镜(见图5)-“水浸”和“水浸”(通常在物镜镜筒上缩写为“ WD”,不要与“工作距离”相混淆)。
水浸物镜通常与直立显微镜配置一起使用,并用于直接浸入水或水基介质/缓冲液中。制造浸渍镜的目的是为了提供非常长的工作距离。它们还用陡峭的物镜转盘制造,该物镜转盘由惰性材料(例如陶瓷)制成。水浸物镜的使用方式与油浸物镜相似,但用水代替油滴。
使用水浸物镜的优点之一就是简单地将水用作水浸介质。这显然很容易涂抹和清除。此外,您不必根据要进行的成像使用特定的浸油,也不需要使用显微镜和物镜制造商指定的浸入介质。但是,使用水浸物镜时有一些缺点。与水性物镜相比,油浸物镜可实现更高的分辨率。此外,由于水的粘度(与油相比),使用水浸物镜可能会受到振动和空气运动的影响。可以通过确保将显微镜放置在防震台上来克服此类伪影。或者,一个更简单的解决方案是在幻灯片上放一个特殊的环,以形成一个小水池。水浸物镜的最终缺点是其成本。某些水浸物镜的成本可能与完整的研究级显微镜相同。
徕卡提供了一种水浸式微型分配器,它克服了长期活细胞成像或筛选实验中水蒸发的潜在问题(图6)。
图6:水浸式微型分配器在运行实验期间自动添加水浸。
总体而言,水浸物镜的主要优势在于对活细胞和组织成像时。这主要是由于油浸物镜不适用于通过用于活细胞显微镜检查的细胞或组织腔室进行成像的事实。
活细胞通常包含在室内,并被细胞培养基(或缓冲液)覆盖。腔室(和培养基)有助于确保细胞或组织在成像时保持在稳定的环境中。结果,焦距将与腔室的盖相距相对较大的距离。这使得油浸物镜的短工作距离不适合通过盖玻片/腔室,培养基/缓冲液以及实际细胞/组织成像。
此外,由于油和水具有不同的折射率,因此使用油浸物镜观察水性介质中的细胞会增加其他折射问题。
当观察室内的活细胞时,光路将遇到不同的折射率。腔室/盖玻片的材料以及覆盖细胞或组织的水性介质将各自具有不同的折射率。形成标本图像的光在每个阶段都会折射,这会导致球差。
尽管可能在水,玻璃或塑料界面处发生折射,但通常会为此校正水浸物镜。此外,某些水浸物镜还带有校正环。可以调节物镜镜筒周围的这些环,以适合不同厚度的保护玻璃。
徕卡还提供电动校正环物镜,可对物镜进行精确和远程调整,从而确保以小的样品破坏和成像设置恢复良好分辨率(图7)。
图7:校正环可将物镜调整为不同厚度的防护玻璃。电动校正环可在小干扰的情况下恢复良好设置。
水浸物镜适合的应用之一是活细胞的共聚焦成像,因此,它们通常是许多共聚焦系统的标准特征之一。由于水对油的粘度低,使用这些物镜会导致盖玻片上的表面张力较小,这意味着样品移位的机会较小,尤其是在获取Z形堆栈的过程中。
图8:甘油物镜是固定在折射率接近甘油/水混合物(例如VECTASHIELD® Hard + SetTM)的介质中的样品的理想选择。
甘油是一种附加的浸没介质。将许多固定样品固定在Mowiol,Vectashield或基于甘油的类似混合物中(见表1)。这些介质的折射率接近80/20甘油/水混合物的折射率(RI = 1.45)。甘油物镜(参见图8)是固定在此类介质中的样品的选择。