关于光学显微镜性能的一个重要标准是放大倍数。该报告将为数字显微镜用户提供有用的指导,以确定放大率值的有效范围。
150多年来,使用玻璃透镜聚焦光并产生放大现象的光学显微镜可以观察肉眼看不到的微观实体。如今,光学显微镜的类型很多,但这里将重点介绍两种最常见的光学显微镜:具有电子图像传感器但没有目镜的数字显微镜和用于视觉观察的显微镜,有目镜。另外,用于视觉观察的显微镜可以配备数字照相机,因此可以与数字显微镜类似的方式使用。
放大率是显微镜以大于或什至小于实际尺寸的比例生成物体图像的能力。放大率只有在可以看到图像中物体的更多细节时比用肉眼观察物体时才有用。目前,当通过显微镜的目镜观察样品的图像时,放大倍数已经很好地确定了。对于这种情况,已记录了严格的国际标准。这些标准中的许多标准也适用于数字显微镜,但是数字显微镜所实现的严格的放大倍率定义和标准,是最常通过在电子监视器上显示的图像来查看的,只是最近才发表。
数字显微镜以及配备有数字照相机的用于视觉观察的显微镜可以快速获取高质量图像。通常,它们可用于许多不同领域和行业的各种技术应用。
数字显微镜放大
放大倍数到底是什么?放大率的基本定义是在光学系统产生的图像中看到的物体或样品特定特征尺寸与物体自身特征尺寸实际尺寸之比。因此,横向放大倍率MDIS可以定义为:
公式1
应该注意的是,视觉放大倍数的有效范围在很大程度上取决于显微镜系统的最大分辨能力。当放大倍率超出可用范围时,则看不到有关样品的其他详细信息。这种情况称为空放大倍数。基于最大分辨能力,出于实际原因,还可以定义有用的观看距离范围,即数字显示器和观察者眼睛之间的距离。
通过显微镜的目镜观察图像以进行视觉观察时,总(横向)放大倍率定义为:
公式2
哪里
MTOT VIS是通过目镜观察到的总横向放大倍率,
MO是物镜的放大倍率,
q是总镜筒系数(变焦镜头和其他镜筒镜头),并且
ME=目镜放大倍率。
对于检测投影到电子传感器(如数码相机)上的显微镜图像,在传感器上形成的图像的放大倍数为:
公式3a
公式3b
哪里
MTOT PROJ是显微镜的(横向)放大倍率(图像投影到传感器上),
p是从目镜到相机的投影因子,并且
MPHOT是从管到相机的摄影投影镜头的放大倍率。
总镜筒系数q通常在0.5:1到25:1之间。摄影投影镜头的放大倍率MPHOT通常在0.32:1到1.6:1之间。
对于数码显微镜,没有目镜,因此图像投影到数码相机的电子传感器上并由其检测,然后显示在电子监视器上进行观察。当通过监视器观察图像时,对于配备有数码相机的视觉观察显微镜也是如此。因此,数字显微镜的最终总放大倍率MDIS,将始终取决于显示屏上显示的图像尺寸。对于此报告,假设从相机传感器到监视器的图像显示是在最简单的情况下以1到1像素对应模式进行的。来自摄像机一个像素的信号显示在监视器的一个像素上。因此,监视器与摄像机传感器图像尺寸之比与监视器和传感器的实际像素尺寸成正比(有关更多详细信息,请参阅下面的附录)。可以定义为:
公式4
其中,MDIS是在监视器上显示的图像的总横向显示倍率,而像素比率是由于图像从相机到电子监视器的信号传输而导致的图像“放大”。
像素大小比率由监视器的像素大小与摄像机传感器的像素大小之比确定:
公式 5
如上所述,对于从照相机传感器到监视器的图像显示,假定为1比1的像素对应模式。在此显示模式下,取决于监视器的像素数,在监视器上可能只看到一部分图像。
数字显微镜的例子如图1所示:数字显微镜和带数码相机的体视显微镜。
图1:a)装有Leica Microsystems的DFC450 C数码相机的M205 C体视显微镜。可以通过目镜或电子显示屏监控器观察蚂蚁样本,以通过相机进行图像检测。b + c)Leica Microsystems的DMS1000数字显微镜使用不同的监视器尺寸进行图像显示。
通常,对于光学仪器而言,分辨率是指在图像中看到精细细节的能力。更具体地,分辨能力是在图像中区分紧密间隔在一起的物体的相邻点或线的能力。通常这两个术语是同义词,但是分辨率是更实际的术语。在显微镜下,分辨率以每mm线对表示。换句话说,可以在给定的分辨率下区分具有相等的线宽和间距的黑白线对。
如上面已经提到的,没有足够分辨率的高放大倍率值会导致空放大倍率。因此,了解分辨率的限制因素至关重要,不仅限于数字显微镜,而且还包括所有形式的光学显微镜。
Leica Microsystems生产的所有显微镜数码相机中使用的传感器的像素数量通常在1,600×1,200至4,080×3,072之间,像素大小在2至6.5μm之间(表1中的示例)。高清晰度(HD)计算机监视器或电视的像素为1,920×1,200或1,080,像素大小在0.1到0.9 mm之间(表2中的示例)。因此,监视器像素通常比摄像机像素大25到450倍。
相机 | 感应器类型 | 宽度(mm) | 高度(mm) | 像素尺寸 | 像素 | 百万像素 |
DFC450 | 2/3” | 8.7 | 6.5 | 3.4 | 2,560 x 1,920 | 4.92 |
MC120 HD / DMS300 | 1 / 2.3” | 6.1 | 4.6 | 3.34 | 1,824 x 1,368 | 2.5 |
MC170 HD / DMS1000 | 1 / 2.3” | 6.1 | 4.6 | 2.35 | 2,592 x 1,944 | 5.04 |
MC190 HD / IC90 E | 1 / 2.3” | 6.1 / 6.44 | 4.6 | 1.67 | 3,648 x 2,736 | 9.98 |
DMC5400 | 1” | 13.2 | 8.8 | 2.4 | 5,472 x 3,648 | 19.96 |
表1:Leica Microsystems提供的DFC450和MC120 / 170/190 HD,IC90 E和DMC5400数码相机以及DMS300 / 1000数码显微镜中使用的图像传感器规格。
高清平板显示器 | 宽度(mm) | 高度(mm) | 像素尺寸 | 像素 | 百万像素 |
---|---|---|---|---|---|
电脑显示器21.5'' | 476 | 267 | 0.25 | 1,920×1,080 | 2.07 |
电脑显示器24英寸 | 521 | 324 | 0.27 | 1,920×1,200 | 2.3 |
PC显示器27'' | 597 | 337 | 0.31 | 1,920×1,080 | 2.07 |
电视32英寸 | 699 | 394 | 0.36 | ||
电视40英寸 | 880 | 495 | 0.46 | ||
电视48英寸 | 1,054 | 593 | 0.55 | ||
电视55英寸 | 1,211 | 681 | 0.63 | ||
电视65英寸 | 1,429 | 804 | 0.74 | ||
电视75英寸 | 1,648 | 927 | 0.86 | ||
电视79英寸 | 1,734 | 976 | 0.45 | 3,840×2,160 | 8.29 |
电视84英寸 | 1,860 | 1,046 | 0.48 | ||
电视85英寸 | 1,882 | 1,058 | 0.49 |
表2:高清电子监视器显示示例:计算机监视器或电视。
通过了解摄像机传感器(表1)和纯平高清监视器(表2)的典型像素大小,可以使用公式5(表3)轻松计算出大小比率的值。
相机类型 | 显示器尺寸(英寸) | ||||||||
85” | 79” | 75” | 65” | 48” | 32” | 27” | 24” | 21.5英寸 | |
像素尺寸比 | |||||||||
DFC450 | 144:1 | 132:1 | 253:1 | 218:1 | 162:1 | 106:1 | 91:1 | 79:1 | 74:1 |
MC120 HD / DMS300 | 147:1 | 135:1 | 258:1 | 222:1 | 165:1 | 108:1 | 93:1 | 81:1 | 75:1 |
MC170 HD / DMS1000 | 209:1 | 192:1 | 366:1 | 315:1 | 234:1 | 153:1 | 132:1 | 115:1 | 106:1 |
MC190 HD / IC90 E | 293:1 | 270:1 | 515:1 | 443:1 | 329:1 | 216:1 | 186:1 | 162:1 | 150:1 |
DMC5400 | 204:1 | 188:1 | 358:1 | 308:1 | 229:1 | 150:1 | 129:1 | 113:1 | 104:1 |
表3:Leica Microsystems提供的DMS1000 / 300数码显微镜和MC190 / 170/120 HD,DFC450,IC90 E和DMC5400数码相机中使用的HD监视器(表2)和传感器的像素大小比率(公式5)(表1) )。
为简单起见,本报告仅讨论数字显微镜的两个示例,实际上是数字显微镜和配备有数码相机的体视显微镜。假定使用1对1摄像机监视像素对应,将图像显示在尺寸为21.5英寸(对角线尺寸21.5英寸[54.6厘米])至75英寸(对角线尺寸)的高清监视器上74.5英寸[189厘米])。这两个示例是DMS1000数字显微镜和具有MC170 HD的M205 A体视显微镜装有C型底座的数码相机。表4列出了配备有MC170 HD摄像机的DMS1000或M205 A显微镜可获得的总放大倍率(参见公式2和4)的示例。对于DMS1000显微镜,物镜的放大倍率范围为0.32倍至2倍,并且包括照相投影镜头在内的显像管系数(q)的范围为8.4:1。对于配备MC170 HD摄像机的M205 A显微镜,物镜的放大倍率范围为0.5倍至2倍,变焦范围为0.78倍至16倍,目镜为10倍至25倍,C型安装镜头为0.4倍至1倍。
DMS1000 | M205 A / MC170HD | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
显示器尺寸(英寸) | 目镜 | 显示器尺寸(英寸) | |||||
21.5英寸 | 75英寸 | 10倍 | 25倍 | 21.5“ | 75“ | ||
MDIS | MTOT VIS | MDIS | |||||
8.4:1 | 29:1 | 最小 | 3.9 | 9.75 | 16.5:1 | 57:1 | 分钟 |
420:1 | 1,450:1 | 最大 | 320倍 | 800倍 | 3,400:1 | 11,700:1 | 最高 |
表4:配备了MC170 HD数码相机的DMS1000数码显微镜和M205 A体视显微镜的总放大倍率数据,MTOT VIS和MDIS(公式2和4)。对于讨论的高清监视器尺寸(表2)和像素比率(表3),放大倍率的可能范围(最小到最大)。
要获得30,000:1的横向总放大倍率,需要哪种监视器像素大小?可以使用带有MC170 HD数码相机的M205 A显微镜以及公式3b,4和5来显示示例。对于投影到相机传感器上的样品图像,M205 A的最大放大倍数为:
最高传感器放大倍数= 2x(物镜)x 16x(变焦)x 1x(C型接口)= 32x
像素比值对应于传感器上的上述放大倍数32x的总放大倍率30,000:1:
Leica MC170 HD摄像机传感器的像素大小为2.35μm。使用上面的938:1像素比率值和1对1摄像机监视像素对应关系,监视器像素大小必须为:
显示器像素大小= 938(像素比率)x 0.00235 mm(像素大小传感器)= 2.2 mm
因此,要使用M205 A和MC170 HD摄像机实现30,000:1的总放大倍率,监视器像素大小必须为2.2 mm。该像素大小将对应于4.9 m的高清监视器对角线!
现在必须问一个问题,这个放大倍数30,000:1是否仅超出了可用范围,即它是空放大倍数。我们如何确定从显微镜观察到图像的数字显微镜的有效放大倍率范围?首先,重要的是更好地了解显微镜系统的分辨率和观察距离。
数码显微镜(或带数码相机的立体)的系统分辨率受以下三个主要因素影响:
公式 6
其中NA是数值孔径,λ是光的波长,单位为nm;
公式 7
其中MTOT PROJ是从样本到传感器的放大倍数(公式3),“传感器合并模式”是指合并模式,对于全帧为1,对于2×2像素合并为2,依此类推。图2),“像素尺寸”是指传感器像素尺寸,单位为μm;和
公式 8
其中MDIS是总横向放大倍率(公式4),监视器像素大小以mm为单位。
摄像机传感器和显示监视器分辨率极限的基础是来自用于数字信号处理的采样定理的奈奎斯特速率或频率(请参见图2)。该定理假设至少需要2个像素才能解析1条线对。如上所述,对于此报告,假定传感器和监视器的像素之间存在1对1对应的最佳情况。因此,使用公式4并将监视器像素大小转换为μm单位,很明显传感器和监视器的分辨率极限是相同的。
数码显微镜系统分辨率的分辨率极限由上述三个分辨率值中的最小值确定。
图2:a)检测图像时相机传感器的像素合并模式示例:无合并(全帧,1×1),双合并(2×2),三合并(3×3),四合并(4× 4)和b)用于测量显微镜分辨率极限的黑/白线对的相机传感器检测,每条线对至少需要2个像素(红色方块)(奈奎斯特速率)。但是,如果每行对使用3个或更多像素,则可以获得更好的图像结果。
观看距离是观察者的眼睛与显示的图像之间的距离。视距的有效范围受显微镜的系统分辨率和观察者的视觉分辨率角度的影响。对于典型的人眼,后者通常是2.3至4.6分钟的弧度。换句话说,人眼能够区分监视器上的细节,这些细节的间隔距离对应于特定观看距离的大于2.3至4.6分钟弧度的角度差。可视距离的有效范围可以表示为:
公式 9
其中,MDIS是横向总放大倍率(公式4),“系统分辨率”是指如上所述的显微镜分辨率极限。
对于此处的讨论,假定观看距离始终在有效范围内。
为了理解如何确定用于数字显微镜的放大率的有效范围,即在显示器上观察放大的图像,首先必须简要提及从视觉观察图像或物体而得到的放大率。使用几何光学,可以得出以下结论:
公式 10
其中MDIS是总放大倍率(公式1),而250是指基于人眼的平均近点的以mm为单位的观看距离的标准参考。
现在,最后可以通过组合公式9和10来定义有效的放大倍率范围:
公式 11
因此,放大率的有效范围是显微镜系统分辨率的1/6至1/3。
现代相机传感器的像素大小在1-6 μm范围内,远低于10 μm。当使用较高的样本到传感器放大倍数(例如150:1)并且没有像素合并和用于监视像素对应关系的一对一传感器时,则可从公式6、7和8得出除此之外,显微镜系统的分辨率由光学分辨率极限决定。最大数值孔径(接近1.3)和可见光的最小波长(约400 nm)的光学分辨率极限为5,400线对/ mm。在这些相同条件下,像素尺寸小于10 μm的相机传感器的分辨率极限很容易超过该值。对于这种特定情况的条件,根据上面的公式11,可用值范围内的最大放大倍数为1800x。
低倍率
在从样品到相机传感器的低倍放大倍率下,等于或小于1倍,数值孔径通常低于0.03。在这么低的放大倍率下,像素尺寸大于2 μm的相机传感器的分辨率极限将开始低于光学分辨率。因此,在低放大倍率(等于或小于1倍)下,传感器或监视器的分辨率极限可能是影响显微镜系统分辨率的主要因素。
对于数字显微镜的讨论,假设始终在上述有用的观察距离范围内观察到监视器上的图像。每当感知的放大倍率值超出有效的放大倍率范围(即1800x)时,就无法解析有关样本的更多细节。
物体场(OF)是物体的一部分,在最终图像中再现。它也被称为显微镜视场(FOV)。因此,只有在对象字段中存在对象的细节时,才能观察到它们。
通过目镜观察时,OF是样品一部分的可见圆形图像。OF的大小(请参见公式12)取决于目镜的场数(FN),以及物镜和管镜的放大倍数(请参见图3)。
由于接收图像的图像传感器和显示图像的监视器的性质,数字显微镜中的物场呈矩形形状(请参阅图3)。它以mm为单位的宽度和高度表示。对于数字显微镜,必须注意光学系统创建的图像必须足够大以覆盖整个图像传感器。在这种情况下,OF可以通过图像传感器或显示器来限制。在任何一种情况下,都必须考虑有效区域的物理尺寸,该尺寸由有效像素的高度和宽度及其物理尺寸(像素间距)给出。
为了计算OF,必须将传感器有效区域的物理尺寸(请参阅公式13)除以物镜,镜筒和相机投影镜头(M TOT PROJ)的放大倍数,或者将监视器的总面积除以总和。横向显示倍率MDIS。每个高度和宽度的这些值中的较小者定义了数字显微镜的OF。
物场的高度和宽度可能不一定必须由图像传感器或显示器共同限制。例如,高度可以由显示器限制,而宽度可以由传感器限制。最终的OF将取决于图像传感器和显示器的尺寸和宽高比以及它们之间用于图像显示的像素对应关系(1:1、1:2、2:1等)。在此报告中,假设使用1对1传感器像素来监视像素对应关系。
目镜的OF可以通过以下方式确定:
公式 12
哪里
OF目镜是通过目镜观察到的物场,
FN是目镜场编号,并且
MO ×q(来自公式2)是由于物镜,变焦以及目镜之前的任何其他镜筒透镜而导致的目镜之前的总放大倍率。
相机传感器的OF可以通过将传感器的宽度和高度除以在传感器上产生样品图像的光学器件的总放大倍数来确定:
公式 13
哪里
w是传感器观察到的OF的宽度,
h是传感器观察到的OF的高度,
MTOT PROJ是样品到传感器的总放大倍率(公式3b),并且
像素大小为μm。
对于相同的样本,物镜和变焦设置,目镜所看到的图像与相机芯片所记录的图像之间的OF差异如下图3和图4所示。对于图4,物镜和变焦镜头的总放大倍率为1倍,但是已使用几种类型的具有不同放大倍率的Leica C卡口来安装相机,将芯片尺寸为2/3英寸的DFC450安装到M205上体视显微镜。在图4a中看到的红色矩形代表图4b的OF,是使用0.32x C固定座拍摄的图像。蓝色矩形表示图4c的OF,是用0.5x C座获取的。绿色矩形显示的是图4d的OF,是采用0.63x C-mount拍摄的。图4b显示了渐晕的问题,其中图像的边缘比中心暗。为避免此类问题
图3:该图显示了通过目镜(白色圆圈)并同时与来自Leica Microsystems的数码相机的芯片(矩形)所观察到的图像的直接比较。所示的2个示例为:a)视场数(FN)为20mm的目镜,C口安装0.4倍透镜,b)目镜为23mmFN的目镜,C口安装0.5倍透镜。某些相机以4:3的宽高比(红色矩形)格式检测图像以进行数据存储,以16:9的宽高比(绿色矩形)格式检测实时图像输出。
图4:用M205 A立体显微镜拍摄的西门子星的图像,其总物镜和变焦镜头放大倍数(Mo×q)为1x。第一个黑线圆的直径为10mm,第二个黑线圆的直径为20mm(在4a和4b中可见)。图像是a)通过具有23 mm FN的10倍目镜拍摄的,并使用配备Leica C卡口的DFC450数码相机记录的(从管到相机传感器的摄影投影镜头放大倍率):b)0.32x和27.2 x 20.3 mm的OF ; c)0.5x和17.4 x 13 mm OF; d)0.63x和13.8 x 10.3 mm OF。4a中的红色矩形代表4b的OF(0.32x C装),蓝色代表4c的OF(0.5x C装),绿色代表4d的OF(0.63x C装)。
可以使用上面的公式13计算相机传感器的物场(OF)。DMS1000数码显微镜和M205 A配备MD170 HD摄像机的体视显微镜的OF值范围如表5所示。同样,DMS1000的放大率范围是:物镜0.32x至2x和管倍率(q )(包括摄影投影镜头)的比例为8.4:1,对于带有MC170 HD摄像机的M205 A,物镜为0.5x到2x,变焦为0.78x到16x,C型卡口为0.4x到1x。
DMS1000 | OF传感器 | ||
M TOT项目 | 瓦特(mm) | h(mm) | |
0.08:1 | 77 | 58.1 | 最高 的 |
3.96:1 | 1.5 | 1.2 | 分钟 的 |
M205 A / MC170HD | OF传感器 | ||
M TOT项目 | 瓦特(mm) | h(mm) | |
0.16:1 | 39.1 | 29.5 | 最高 的 |
32:1 | 0.19 | 0.14 | 分钟 的 |
表5:来自DMS1000数字显微镜和M205的图像的物场(OF)数据(方程式13)配备MC170 HD数码相机的体视显微镜显示了从最小值到最大值的范围。
数码显微镜使用电子图像传感器(相机传感器)代替目镜。用于视觉感知的显微镜(例如,体视显微镜)具有目镜,并且可以配备数码相机。数字显微镜可以快速采集高质量图像。它通常用于各种领域中的快速简便的文档编制,质量控制(QC),故障分析和研发(R&D)。
由于相机传感器尺寸和电子显示屏尺寸的差异,因此在使用数字显微镜时确定放大倍数和分辨率可能会很困难。通过此报告,数字显微镜的用户可以更好地了解如何评估总放大倍率及其有效范围。另外,还讨论了有关物场或视野的有用信息。
公式4所表示的总横向显示倍率MDIS的定义的基础是监视器上显示的图像尺寸与投影到相机传感器上的图像尺寸相比的“放大”。因此,监视器上的图像尺寸与传感器上的图像尺寸之比决定了总放大倍率:
公式 A1
对于尺寸比,可以使用单个图像尺寸,例如图像宽度或高度。使用该宽度,监视器上的图像宽度等于图像宽度中监视器像素的数量乘以像素大小。对于传感器上的图像宽度,适用类似的参数,因此:
公式 A2
监视器与传感器像素尺寸的比例已在公式5中定义为像素尺寸比例:
公式 A3
当监视器和传感器像素的数量相同(1到1像素对应)时,则:
MDIS = MTOT PROJ x 像素尺寸比
当然是上面的公式4
但是,出现了一个问题:如果2台监视器的像素大小相同但尺寸不同,如果将来自摄像机传感器的相同图像显示在任一像素上,且像素比例为1到1,则总放大倍率是否相同?
可以使用一个示例(不是真实案例)来说明答案。从表2中可以看到2个尺寸分别为40英寸(102厘米)和79英寸(201厘米)的电视,它们的像素大小几乎相同,分别为0.46mm和0.45mm。79英寸电视的像素(3,840 x 2,160像素)是40英寸电视(1,920 x 1,080像素)的4倍,每个尺寸的像素是其两倍。现在想象一下,使用摄像头传感器也具有8.29 MP(3,840 x 2,160像素),可以在两台电视上以1到1像素的对应关系显示相同的图像(1个传感器像素的信号显示在1个监视器像素上)。79英寸电视将显示投影到传感器上的完整图像。但是,像素比传感器少4倍的40英寸电视只能显示投影到传感器上的图像的1/4。尽管如此,两台电视上显示的图像的总放大倍数仍相同。为了证明这一事实,下图A1显示了40英寸和79英寸电视上显示的摄像机的相同图像。白色双箭头指示样品上的相同特征。每个图像中箭头的长度相同,这是因为每个电视的像素大小都相同,并且此功能在每个图像中覆盖了相同数量的像素。
图A1:使用8.29 MP(3,840 x 2,160像素)的相机传感器拍摄的图像的假想示例,并在a上以1比1的像素显示:a)具有与传感器相同像素的79英寸电视像素大小与40英寸电视相同; b)40英寸电视,像素为传感器(和79英寸电视)的1/2倍,像素大小与79英寸电视相同。白色双箭头指示每个图像上相同特征之间的距离。每个图像中箭头的长度相同(像素数和像素大小相同)。
为了进一步阐明这一点,请想象一张很大的纸,上面有一个矩形孔,尺寸为40英寸电视。可以用纸覆盖79英寸电视,然后显示相当于40英寸电视的图像区域。下面的图A2中显示了一个示例。如果将纸上的矩形孔在79英寸电视上移动,则类似于使用软件使用鼠标或光标在40英寸电视上移动显示的图像。同样,在79英寸或40英寸电视上显示的图像中具有1到1像素对应关系的相同特征将具有相同的尺寸,这意味着总放大倍率是相同的。
图A2:与上述图A1的情况相同:a)在79英寸电视上显示的完整图像被一张大纸覆盖,该纸上有一个矩形孔,尺寸等于40英寸电视,因此只有1/4的图像被看到。b)当在40英寸电视机上显示时,只能看到传感器图像的1/4,这相当于a部分所述的用纸覆盖的79英寸电视机。