诸如GFP,YFP或DsRed之类的荧光蛋白(FPs)是可视化活细胞中细胞成分的强大工具。但是,在某些情况下,传统FP会达到极限。普通FP不可能观察到特定目标蛋白质的空间受限的专用蛋白质种群,因为它们在整个细胞中表达。此时可光激活,可光转换和可光切换荧光蛋白进入该阶段。该荧光工具箱的成员可以从非荧光状态激活,可以更改其发射光谱,甚至可以可逆地“打开和关闭”。借助这些“荧光荧光笔”,研究人员可以通过激活给定波长的空间定义光束分别转换其荧光来跟踪随时间变化的不同蛋白质种群。
荧光蛋白的另一种有趣类型是荧光计时器,它可以随时间改变其发射波长。以下文章将概述这些非凡的荧光蛋白。
图1:通过用蓝/紫光谱的光照射,可将可光活化FP从荧光状态的非荧光状态“打开”。光可转换FP能够将其荧光发射光谱从一个最大值更改为另一个最大值。这也可以通过暴露于一定波长的光来触发。可以通过两个不同波长的光脉冲来“打开和关闭”可光切换FP。该循环最多可以执行数百次。
可将光活化蛋白从低荧光状态“开启”到较高荧光状态。通过在紫/蓝光谱中施加一个短的光脉冲,可以在不到一秒钟的时间内发生这种切换,并且可以检测动态细胞过程。感兴趣区域(ROI)中分子的直接光活化可用于监测这些活化蛋白在细胞内的运动。在像FRAP这样的其他脉冲追踪实验装置中,人们无法区分重新进入ROI的蛋白质和新合成的分子,而光激活是绕过此问题的一种方法。
第一个可光激活的蛋白是wtGFP变体,由Lippincott-Schwarz和Patterson创建。它包含一个单点突变(T203H),导致450至550 nm区域的吸光度非常低。PA- GFP(可光激活的绿色荧光蛋白)借助紫光被光激活,将其最大吸收范围从400 nm切换到504 nm(参见图2)。因此,其荧光增加约。当以488 nm的波长激发时,其活性是未折叠蛋白的100倍,在活化蛋白和未活化蛋白之间形成鲜明对比。
图2:PA-GFP(可光激活的绿色荧光蛋白)可以被紫外线从非荧光状态激活到荧光状态。
PA- GFP活化过程中的潜在过程似乎是残基222中谷氨酸侧链的光诱导脱羧。二氧化碳的这种损失将发色团构型从中性变为阴离子型。
此处应提及的另一种候选药物是Phamret(光活化介导的共振能量转移),它是一种特殊的串联二聚荧光蛋白,被FRET光活化。Phamret是一种融合蛋白,由一个与其FRET伴侣ECFP共价偶联的PA-GFP组成。暴露于458 nm波长会导致ECFP在480 nm处发射。PA- GFP的邻近光活化是用405 nm激光束进行的。之后,重复暴露于458 nm会导致激发的ECFP和PA- GFP之间发生FRET,产生绿色荧光。因此,“无效”和“有效”形式可以由相同的激光波长激发(图3)。阴性特征可能是由两个荧光蛋白组成的蛋白大小,可能引起空间问题。
图3:Phamret(光活化介导的共振能量转移)是由PA-GFP及其FRET伴侣ECFP组成的串联二聚体。最初暴露于458 nm会导致ECFP发出蓝色荧光。通过紫外线光活化PA-GFP后,由于两种蛋白质之间的FRET,重复暴露于458 nm会导致绿色荧光。因此,Phamret原则上类似于可光转换的蛋白质,但仅需一条激光线即可激发两种不同的荧光状态。
值得注意的是,与EGFP相比,可光活化的蛋白通常显示出降低的亮度,并显示出降低的光稳定性(表1)。
与可光活化的蛋白质相反,可光转化的蛋白质发出的荧光已经处于未转化状态。在石质开放脑珊瑚Trachyphyllia geoffroyi中发现了光转换。由于其发射属性,在用紫外线进行光转换后,其发射光谱从绿色变为红色,因此荧光蛋白被命名为Kaede就像日本枫树的叶子[4]。在秋天,它们的颜色从绿色变为红色。如果对Kaede进行380至400 nm波长的光转换,则其发射最大值将从518 nm变为582 nm。这显示为绿色和红色荧光之间的比例发生了显着变化,比例为2,000。这种转换是不可逆的(图4)。另一个限制因素是Kaede的四聚体性质,这使其难以用于活细胞成像研究。FPs的低聚可能导致对标记的目的蛋白(POI)的位置和行为的误解。聚合甚至可以完全抑制POI的正常功能。
图4:Kaede的荧光发射可以从绿色转换为红色。488 nm激发光导致518 nm处的荧光发射。随后用380 nm至400 nm之间的光进行转换,将荧光发射峰移动到582 nm,可以由540 nm光源激发。与可光活化的蛋白质相比,可光转化的蛋白质简化了ROI的定义,因为可以从一开始就将它们可视化。
光转换的基本过程再次是光诱导过程。在这种情况下,发色团内部的组氨酸残基(His61-Tyr63-Gly64)通过辐照被裂解,最终导致高度共轭的双咪唑环系统的形成。这个过程与荧光向红色波长的移动有关。
红色到绿色的可转换FP来自珊瑚Dendronephtytha sp。它的名称和红色的可激活属性在表达式Dendra中反映出来。商业化开发的Dendra2是第一个单体红色到绿色的光转换蛋白。
另一个广泛使用的荧光荧光笔是tdEosFP,它主要从石珊瑚Labophyllia hemprichii中分离出来。串联二聚体在近紫外光照射后可以从绿色荧光转换为红色荧光,很高兴用于超分辨率显微镜,单体版本mEos和mEos2也是如此。
在第三个石质珊瑚:Favia favus中发现了一种具有与Keade非常相似特性的光可转换蛋白。在近紫外线照射后,四聚体KikGR将其荧光从绿色变为红色,但两者都比Kaede明亮得多。它的商业名称为Kikume,可以通过750 nm波长的多光子激发进行光转换。这样可以用于厚组织样本。KikGR的诱变导致单体形式mKikGR。与mEos2和Dendra2一起使用时,它通常是用于超分辨率成像的光学荧光笔。
光活化是从非荧光状态到荧光状态的不可逆转换,而光可切换蛋白能够在两种条件之间穿梭。借助于不同波长的光脉冲,这些荧光蛋白可以打开和关闭数百次,而无需进行光漂白。这种在荧光状态和暗状态之间切换的现象称为光致变色现象,虽然在非常低的范围内,但已在wtGFP的单分子水平上出现。
一种超高分辨率显微镜中使用的众所周知的光切换蛋白是从石质珊瑚中获得的:Dronpa是一种单体,由于其阴离子,去质子化的生色团而在503 nm处具有一个最大吸收,在390 nm处具有较小的最大吸收。由于其具有中性的质子化生色团(参见图5)。阴离子形式在518 nm处有最大发射,而中性形式则表现为非荧光态。
图5:Dronpa的荧光发射可以可逆地打开和关闭。488 nm的光激发产生绿色荧光,荧光下降相对较快。随后用紫外线照射会重新激活荧光状态。
此外,存在与发色团的质子化相关的顺式-反式异构化。在发色团的中性状态下,Tyr66侧链呈反式构象(参见图6)。Tyr66在阴离子状态下具有顺式构象。在用405 nm激光脉冲照射时,Dronpa被迫转变为荧光顺式构象。然后,一个488 nm的激光脉冲将Dronpa构象切换到其非荧光透射状态。此循环可以重复数百次。
图6:Dronpa发色团的Tyr66侧链在光切换过程中发生顺反异构化。虽然反式构象是非荧光的,但顺式构象却发出荧光。
在红色区域具有最大发射量的四聚光切换蛋白是Kindling FP(KFP1)。
创建新的荧光荧光笔的最新努力是结合了一种蛋白质,该蛋白质将光转换和光转换结合在一起。IrisFP是一种wtEosFP衍生物,在其绿色荧光以及其红色荧光构象中均具有开和关可切换状态。换句话说,在用高强度405nm照射时,激光束IrisFP从其绿色转移到红色发射状态。可以在488 nm激光的帮助下关闭绿色IrisFP。405 nm的低强度激光再次将其打开。另一方面,红色IrisFP被532 nm激光关闭,并且可以被440 nm激光再次打开。单体形式mIrisFP的相邻结构为进一步的应用打开了大门。
图7:IrisFP将光电转换和光电转换结合在一起。适当的触发波长和强度的选择可以在荧光状态和非荧光状态之间切换,或者将蛋白质的发射从绿色波长转换为红色波长。
除了易受光操纵的荧光蛋白外,还有其他蛋白可通过其他触发因素切换(图8)。例如,对活细胞离子状态感兴趣的研究人员可以选择GCaMP作为Ca 2+指示剂。GCaMP根据其Ca 2+结合改变其荧光行为。其它荧光蛋白如VSFP1被用于检测膜电位,而黄色荧光蛋白YFP-H148Q是氯敏感-离子。此外,有些FP根据周围的pH值改变其荧光特性。超黄PHluorin(SEP)和pHuji是两个例子。借助它们的帮助,可以跟踪胞吞和胞吐事件以及细胞内分选事件。
随时间变化其发射光谱的荧光蛋白称为荧光计时器。此行为不是pH值变化,离子强度或蛋白质浓度的结果,而是独立于这些生化参数而发生的。换句话说,相关蛋白质的年龄可以通过其颜色来估计。利用这些特性,可以测量活细胞内的时间以及与时间有关的事件。
图8:离子敏感的荧光蛋白在结合例如 Ca2 +,而对pH敏感的荧光蛋白(例如pHuji)在一定的pH范围内显示出极大的荧光强度。 荧光计时器正在按时间更改其发射光谱。 在他们的帮助下,有可能将蛋白质的年龄和细胞位置关联起来。
Sergey A. Lukyanov的实验室在2000年描述了第一个荧光计时器。这个名为FT(用于荧光计时器)的DsRed突变体在18小时内将其发射光谱从红色变为绿色。由于FT是四聚体,Vladislav Verkhusha认为有必要制造单体单体。mCherry的诱变导致另外3个具有不同转化时间的荧光定时器(见表1)。这些蛋白质以快速,中等或缓慢的时间尺度从蓝色变成红色,但仍然太慢而无法测量几分钟内发生的细胞过程。
然而,借助荧光计时器,有可能以空间和时间分辨率观察活细胞中蛋白质的行为。例如,可以观察到分化和细胞极化过程。此外,可以追踪蛋白质转运事件或病毒装配或可以监测基因活性。该应用列表肯定可以扩展,并显示将来荧光计时器的潜在用途。
蛋白 | Exmax(nm) | Emmax(nm) | QY | 亮度 | pKa | 结构体 | 杂项 |
光活化蛋白 | 激活条件 | ||||||
PA-GFP | 400 | 515 | 0.13 | 2.7 | Monomer | violet | |
PAmCherry | 404 564 | ND 595 | ND 0.46 |
8 |
6.3 | Monomer | 350 – 400 nm |
PATagRFP | ND 562 | ND 595 | ND 0.38 | ND 25.1 | ND 5.3 | Monomer | violet |
PAmKate | ND 586 | ND 628 | ND 0.18 | ND 4.5 | ND 5.6 | 405 nm | |
Phamret (PA-GFP + ECFP) | 458 | 475 | 0.40 | 13 | Monomer | violet | |
光转换蛋白 | 转换条件 | ||||||
mClavGR2 | 488 566 | 504 583 | 0.77 0.53 | 14.6 17 | 8 7.3 | Monomer | 405 nm |
mMaple | 489 566 | 505 583 | 0.74 0.56 | 11.1 16.8 | 8.2 7.3 | Monomer | 380 nm |
Dendra2 | 490 | 507 | 0.50 | 22 | 6.6 | Monomer | Initial state |
PS-CFP2 | 400 490 | 468 511 | 0.2 0.23 | 8.6 10.8 | Monomer | violet | |
Meos3.2 | 507 572 | 516 580 | 0.7 0.55 | 53 18 | 5.4 5.8 | Monomer | 405 nm |
Kaede | 508 | 518 | 0.88 | 87 | 5.6 5.6 | Tetramer | Initial state |
EosFP | 506 571 | 516 581 | 0.7 0.55 | Tetramer | |||
mEosFP | 505 569 | 516 581 | 0.64 0.62 | Monomer | |||
mEos2 | 506 | 519 | 0.84 | 47 | 5.6 | Monomer | Initial state |
kikGR (Kikume) | 507 583 | 517 593 | 0.7 0.65 | 37.6 22.8 | 7.8 5.5 | Tetramer | 365 nm |
PSmOrange | 548 636 | 565 662 | 0.51 0.28 | 58 9 | 6.2 5.6 | Monomer | blue-green |
PSmOrange2 | 546 619 | 561 651 | 0.61 0.38 | 31.1 7.2 | 6.6 5.4 | Monomer | 489 nm |
mKikGR | 505 | 515 | 0.69 | 34 | ND | Monomer | Initial state |
光转换蛋白 | 活化/淬灭条件 | ||||||
mTFP0.7 | 453 | 488 | 0.5 | Monomer | 405 nm / 458 nm | ||
PDM1-4 | 503 | 517 | 405 nm / 488 nm | ||||
Dronpa | 503 | 518 | 0.85 | 80.8 | 5.0 | Monomer | violet / blue |
Dronpa-2 | 489 | 515 | 0.28 | Monomer | 405 nm / 488 nm | ||
Dronpa-3 | 489 | 515 | 0.33 | Monomer | 405 nm / 488 nm | ||
bsDronpa | 460 | 504 | 0.5 | Monomer | 405 nm / 488 nm | ||
Padron | 503 | 522 | 0.64 | Monomer | 503 nm / 405 nm | ||
Padron0.9 | 500 | 524 | 500 nm / 400 nm | ||||
Mut2Q | 496 | 507 | 0.28 | Monomer | 405 nm / 478 nm | ||
rsFastLime (DronpaV157G) | 496 | 518 | 0.77 | Monomer | 405 nm / 488 nm | ||
rsKame (DronpaV157L) | 503 | 518 | 0.86 | ||||
Dreiklang | 515 | 529 | 0.41 | 34 | 7.2 | Monomer | 365 nm / 405 nm |
mGeos-M | 503 | 514 | 0.85 | 43.9 | 4.5-5 | Monomer | 405 nm / 488 nm |
EYQ1 | 510 | 524 | 0.72 | Monomer | 405 nm / 514 nm | ||
KFP1 | 590 | 600 | 0.07 | Tetramer | 532 nm / 458 nm | ||
rsCherry | 572 | 610 | 0.02 | Monomer | 550 nm / 450 nm | ||
rsCherryRev | 572 | 608 | 0.005 | Monomer | 450 nm / 550 nm | ||
rsTagRFP | 567 | 585 | 0.11 | Monomer | 445 nm / 570 nm | ||
mApple | 568 | 592 | 0.49 | Monomer | 480 nm / 570 nm | ||
asFP595 | 572 | 595 | <0.001 | Tetramer | 569 nm / 450 nm | ||
Kindling FP (KFP1) | 580 | 600 | 0.07 | 4.1 | ND | Tetramer | green / 450 nm |
rseGFP | 493 | 510 | 0.36 | 16.9 | 6.5 | Monomer | 405 nm / 488 nm |
rseGFP2 | 478 | 503 | 0.3 | 18.4 | 5.8 | Monomer | 408 nm / 478 nm |
光转换/光转换蛋白 | |||||||
IrisFP | 488 | 516 | 0.43 | 22 | Tetramer | ||
mIrisFP | 486 | 516 | 0.54 | 25 | 5.4 | Monomer | 紫色(深绿色) |
荧光计时器 | 过渡时间(h) | ||||||
Slow-FT | 402 | 465 | 0.35 | 12 | 2.6 | Monomer | 9.8 |
Medium-FT | 401 | 464 | 0.41 | 18 | 2.7 | Monomer | 1.2 |
Fast-FT | 403 | 466 | 0.30 | 15 | 2.8 | Monomer | 0.25 |
mK-Go | 500 | 509 | ND | ND | 6.0 | Monomer | 10 |
Exmax:最大激发光,Emmax:最大发射光,QY:量子产率,亮度由量子产率和摩尔消光系数除以1,000得出