为了在光学显微镜中观察到精细的标本细节,存在的微小特征必须具有足够的对比度,并以比人眼的角分辨力大的角度投射中间图像。在选定的数值孔径下,当显微镜提供的放大图像的大小等于人眼的分辨率极限时,超出此点的其他放大率不会导致甚至更小的样本细节的分辨率。
有效倍率范围为物镜/目镜组合是通过显微镜光学系统的数值孔径限定。要分辨图像中的细节,必须具有最小的放大倍率,并且通常将该值任意设置为数值孔径(500 x NA)的500倍,并由以下公式定义:
有效放大倍数(总计)= 500至1000×NA(物镜)
在光谱的另一端,图像的最大可用放大倍率通常设置为数值孔径的1000倍(1000 x NA),如上式所示。高于此值的放大倍率将无法获得更多有效的信息或图像细节的更高分辨率,并且通常会导致图像质量下降。表1列出了在有效放大倍率范围内的常见物镜/目镜组合。
物镜 | 目镜 | ||||
---|---|---|---|---|---|
(数值孔径) | 10倍 | 12.5倍 | 15倍 | 20倍 | 25倍 |
2.5倍 (0.08) | — | — | — | X | X |
4倍 (0.12) | — | — | X | X | X |
10倍 (0.35) | — | X | X | X | X |
20倍 (0.55) | X | X | X | X | X |
40倍 (0.70) | X | X | X | X | — |
60倍 (0.95) | X | X | X | — | — |
100倍 (1.42) | X | X | — | — | — |
超过可用放大倍数的限制会导致图像出现空放大现象(如图1(b)所示),其中通过目镜或中间镜筒的放大倍数只会使图像变大,而倍率不会相应增加。详细解析。相反,图1(a)所示的图像是使用正确的物镜和目镜组合捕获的,以有效利用数值孔径以获得分辨率。
实际上,过大的放大倍率会在图像中引入伪影,衍射边界和光晕,从而模糊标本的特征并使视觉观察的解释变得复杂。显微镜的观察还受到人眼对照明强度和色温的敏感性,观察者的年龄,眼睛中浮子的存在以及眼睛是否静止或疲劳的影响。
确定物镜与目镜的组合是否在有效的放大倍率范围内。
为了目视观察,必须以比人眼分辨力稍大的角度观察样品细微结构的图像。对于具有良好照明的显微镜,在250毫米的参考视觉距离处观察到的样品中两个分辨点之间的距离约为0.15毫米,对应于约2分钟弧度的视敏角。该限制角受到视网膜中视觉元件的间隔距离的限制,视觉元件之间的间隔约为五微米。
为了将眼睛的分辨率极限与物镜的分辨能力联系起来,可以考虑样品中两个紧密间隔的点。如果这两个点位于物镜分辨力的极限处,则:
r(分离距离)=λ/ 2NA
其中r是将两点分开的距离,λ是照明的波长,NA是物镜的数值孔径。为了放大距离,直到样本点以0.15毫米的间隔距离(代表2分钟的弧度)出现在眼睛上,我们检查以下关系:
0.15毫米= M×λ/ 2NA
可以重新安排为:
M =(2NA×0.15)/λ
其中M是显微镜放大倍数。当假定照明波长位于可见光谱的绿色区域(550纳米或0.00055毫米)时,我们可以代入等式:
M =(NA×0.30)/0.00055)=(大约)500×NA
结果是目视观察细小样本细节的最小放大倍率,大约是物镜数值孔径的500倍。该讨论适用于具有中等对比度的标本,但是对于具有较高对比度的标本,即使它们彼此靠近,也可以通过较高的放大倍率来解析这两个点。在实践中,通常采用大大偏离有效放大倍率范围的放大倍率。例如,非常低的放大倍率(1x到4x)通常用于对标本进行地形图绘制(例如组织学染色的薄切片),在该标本中需要大视野以便快速记录所有可用的标本特征。在许多情况下,为2。
在高放大倍率下,有时会超出可用放大倍数的限制,以便更舒适地查看图像。当观察到小颗粒或生物并以很高的数值孔径和放大倍数计数时,通常会出现这种情况。然后牺牲了样品细节的清晰度,这通常不会干扰图像的定量分析。
选择目镜/物镜组合时应格外小心,以确保在不增加不必要伪像的情况下,放大样品细节。例如,要实现250倍的放大倍率,显微镜师可以选择25倍目镜和10倍物镜。同样放大倍率的另一种选择是使用25倍物镜的10倍目镜。因为25倍物镜的数值孔径(约0.65)比10倍物镜(约0.25)更高,并且考虑到数值孔径值定义了物镜的分辨率。如果使用上述每种物镜/目镜组合拍摄了相同视野的显微照片,