光学显微镜的分辨率和性能可以通过称为调制传递函数(MTF)的量来表征,该量是显微镜以特定分辨率将对比度从样本传递到中间图像平面的能力的度量。调制传递函数的计算是光学制造商经常用来将分辨率和对比度数据合并到单个规范中的一种机制。
调制传递函数不仅可用于表征传统的光学系统,而且可用于表征光子系统,例如模拟和数字摄像机,图像增强器和胶片扫描仪。该概念源自电气工程中使用的标准惯例,该惯例将输出信号的调制度与信号频率的函数相关联。在光学显微镜中,信号频率可以等于在样品中观察到的周期性,范围从蒸发到显微镜载玻片上的金属线光栅或硅藻壳中的重复结构到在活组织培养细胞中观察到的亚细胞颗粒。
样本中每单位间隔的间隔数称为空间频率,通常以定量形式表示样本中的周期性间隔(空间周期)。空间频率的通用参考单位是每毫米的线对数。例如,连续的一系列黑白线对具有每对1微米的空间周期,将每毫米重复1000次,因此对应的空间频率为每毫米1000线。
另一个重要的概念是光学传递函数(OTF),它表示当绘制成空间频率的函数时,图像对比度与样本对比度的比率,同时考虑了实际和理想图像所占据的位置之间的相移。一般而言,光学传递函数可描述为:
OTF = MTF×eiφ(f)
其中,虚项代表相位传递函数(PTF),或相位位置随空间频率变化的变化。因此,光学传递函数是空间频率相关的复变量,其模量是调制传递函数,并且其相位由相位传递函数来描述。如果相位传递函数与频率成线性关系,则它代表图像的简单横向位移,如通过观察到的像差以及诸如几何畸变那样。但是,如果相位传递函数是非线性的,则会对图像质量产生不利影响。在引人注目的示例中,相移180度会产生图像对比度的反转,在这种情况下,明暗模式会反转。
理想的光学系统在所有空间频率下都具有统一的调制传递函数,而同时具有零的相移因子。在显微镜(或其他光学系统)产生的图像为正弦波且没有相移的情况下,光学传递函数的模量恢复为调制传递函数。
在标本是由等宽的黑白线交替组成的周期线光栅(方波)的情况下,与标本对比度传输到图像的百分比有关的图形称为对比度传递函数(CTF)。大多数标本显示出具有不同空间频率的正弦变化强度组成,而不是方波形式轮廓。在这种情况下,将输出作为输入强度与信号(空间)频率之比的一部分的图表类似于调制传递函数。当空间频率接近非常大的值时,方波响应类似于正弦波的响应,从而产生实际上相同的对比度传递函数和调制传递函数图。
本程序从对比度方面回顾了调制传递函数。
图1说明了在衍射极限光学显微镜中提高空间频率对图像对比度的影响。在图的左侧以两个空间频率显示了由交替的白色和黑色矩形条组成的周期线光栅(代表100%的对比度)。在显微镜中产生的图像显示在每个物镜的右侧,并显示为具有降低对比度的正弦强度,该强度在图像下方的图中以物体对比度的相对百分比表示。百分之一百的对比度代表规则的白色和黑色重复条,而百分之零的对比度由融合到相同强度的灰色背景的灰色条表示。对比度值达到零后,图像将变成均匀的灰色阴影,并在所有较高的空间频率上保持不变。
当输入是高对比度方波时,例如图1中所示的周期性光栅目标,对比度的传递由对比度传递函数确定。然而,在显微镜下观察到的大多数标本没有显示出这种规则的周期性,而是由在亚微米水平上呈不同程度正弦变化的“方波”组成。在这种情况下,调制传递函数用于计算从样本到显微镜产生的图像的对比度传递。
输出信号的调制,即形成样本图像的光波强度,对应于显微镜中图像对比度的形成。因此,可以从由样品中存在的周期线或间隔产生的对比度获得特定光学显微镜对MTF的测量值,该周期线或间隔是由于图像中正弦强度随空间频率而变化而产生的。如果使用浸没油以匹配的物镜/聚光镜对在高数值孔径(1.40)下对空间周期为1微米的样品(交替的吸收线和透明线对之间的距离)成像,则各个线对将被清晰地分辨为显微镜。该图像不会忠实再现线对图案,图1)。将线对之间的距离减小到0.5微米的空间周期(空间频率等于每毫米2000条线)将进一步降低图像的对比度,但将空间周期增大到2微米(空间频率等于每毫米500条线) )会相应地提高图像对比度。
当空间频率接近500线/毫米(空间周期等于0.2微米),并且在高数值孔径(1.4)下使用500纳米的照明波长时,达到了光学显微镜的分辨率极限。此时,几乎无法检测到对比度,并且图像将显示中性的灰色阴影。在真实的样本中,在显微镜下观察到的对比度的大小取决于图像的大小,亮度和颜色,但是对于紧密排列的条纹,人眼在对比度水平低于大约3-5%时不再检测到周期性,并且可能无法达到分辨率极限为0.2微米。
当在光学显微镜中观察标本时,除了光学中的微小组装和对准误差外,由于像差和衍射现象还会使所得图像有些退化。在图像中,明亮的高光将不会像在样本中那样明亮,并且深色或阴影区域将不像在原始图案中观察到的那样黑。样品的对比度或调制度可定义为:
调制(M)=(I(最大)-I(最小))/(I(最大)+ I(最小))
其中I(max)是重复结构显示的最大强度,I(min)是在同一样本中发现的最小强度。按照惯例,将调制传递函数在零空间频率下归一化为单位。图像中的调制度通常小于样本中的调制度,并且图像相对于样本的相位偏移通常很小。通过比较具有不同空间频率的几个样本,可以确定图像调制和相移都将作为空间频率的函数而变化。根据定义,调制传递函数(MTF)由以下等式描述:
MTF =图像调制/对象调制
如上所述,该量是在正弦物体的图像中观察到的对比度变化随空间频率变化的一种表达。此外,正弦曲线的位置或相移取决于水平坐标和垂直坐标中的空间频率。视频显微镜就是一个很好的例子,其中光栅扫描过程产生的响应略有不同,从而导致水平和垂直调制传递函数之间的差异。
理想成像系统的相位响应显示出对空间频率的线性依赖性,其位置偏移与频率无关,并且在零空间频率下归一化为零。在理想系统中,所有正弦图像分量都偏移相同的量,从而导致图像的净位置偏移而不会降低图像质量。当相位响应偏离理想的线性行为时,某些组件将比其他组件发生更大程度的偏移,从而导致图像质量下降。这在电子视频系统中尤其重要,因为电子视频系统通常具有不理想的相位特性,从而可能导致图像质量下降。幸好,具有圆形孔径和中心光轴的理想无像差光学系统(例如高性能显微镜)将产生一个相位传递函数,该函数对于所有方向上的所有空间频率都为零。在这种情况下,相移仅发生在离轴光线上,仅需要考虑调制传递函数。
无像差光学系统称为衍射极限,因为光瞳处的光衍射效应限制了空间频率响应并建立了分辨率极限。示于图2是与通过可见光和非相干照明成像与具有圆形光瞳几个不同的衍射限制的显微镜物镜的重复试样的调制传递函数的曲线图。在这种情况下,客观质量会根据空间频率影响调制响应。更高质量的目标(图2中的红线)比低画质(黄线)表现出更好的性能,并且能够在更高的空间频率下更有效地传递对比度。黄色曲线表示的物镜在低空间频率下具有高性能,但在较大频率下却无法达到高数值孔径物镜。该图下方是相对特征尺寸相对于瑞利标准和麻雀极限的空间频率的表示。还介绍了一系列代表样本(物体)的正弦波,以及当正弦曲线频率增加时在典型显微镜中产生的所得图像。
当光学系统中不存在像差时,调制传递函数与衍射图样的大小有关,而衍射图样的大小是系统数值孔径和照明波长的函数。用定量的术语来说,具有均匀照明的圆形孔径的光学系统的调制传递函数可以表示为:
MTF = 2(φ-cosφsinφ)/π
哪里
φ= cos - 1(λν/ 2NA)
在这些等式中,ν是每毫米周期的频率,λ是照明的波长,NA是数值孔径。在低空间频率下,图像对比度高,但随着空间频率增加超过特定点而下降到零(图2中绘制为图像中产生的振幅减小)。在切断(F(c))的是在该对比度达到零并且可以由以下等式来表示空间频率:
f(c)= 2NA /λ
有趣的是,该方程式表示(就空间频率而言)分辨率随着数字孔径和较短波长的增加而增加。
调制传递函数还与点扩散函数有关,点扩散函数是点状光源(通常称为艾里斑)从显微镜物镜投影到中间像面上的图像。光学像差和数值孔径变化会影响在图像平面上观察到的光强度分布,从而影响点扩散函数的形状。还应注意,由样品在衍射极限显微镜中产生的点扩散函数的总和包括在像平面上产生的衍射图样。
显微镜物镜可成像的高空间频率与数值孔径成正比,并基于点扩散函数的分布大小。具有低数值孔径的物镜产生的点扩散函数比具有较高数值孔径的物镜形成的点扩散函数在像平面上具有更宽的强度分布。在分辨率的极限下,相邻的艾里斑或点扩散函数开始重叠,从而掩盖了区分单个强度的能力。较窄的强度分布(在较高的数值孔径下)可以更紧密地相互靠近,并且仍然可以通过显微镜解决。这意味着窄点扩展函数对应于高空间频率。实际上,光学传递函数
衍射极限光学显微镜的调制传递函数和点扩展函数之间的关系如图3所示。如上所述,调制传递函数的极限截止频率(f(c))与目标数值孔径成正比,与照明波长成反比。围绕点扩散函数(或艾里斑)的中心强度峰值的首个黑色同心环的半径由以下公式表示:
r =0.61λ/ NA
通常将其称为瑞利标准或显微镜的分辨率极限。由于r与数值孔径成反比,并且与照明波长成正比,因此r和f(c)也成反比,这是傅立叶变换的基本性质(函数的宽度与函数的宽度成反比转变)。
显微镜中的单个物镜显示特定的调制传递函数(或光学传递函数),该函数取决于数值孔径,物镜设计,照明波长和对比度生成模式。当聚光镜的数值孔径等于或大于物镜的数值孔径时,空间频率截止值会随着物镜数值孔径的减小而减小(图4(a))。保持客观数值孔径值不变并改变聚光镜数值孔径会导致逐渐降低的截止值,同时减小聚光镜数值孔径(图4(b))。
利用诸如相位对比和微分干涉对比(DIC)之类的对比增强技术,可以产生独特的调制传递函数,该函数显示的曲线与使用物镜的完整数值孔径在明场照明下观察到的曲线不同(图5)。例如,在相衬显微镜中由相环产生的狭窄照明会产生在明场曲线上方和下方振荡的调制传递函数曲线,而DIC物镜产生的曲线随样品周期和试样剪切方向之间的角度而变化。沃拉斯顿或诺马尔斯基棱镜。在图5中也有说明是单边带边缘增强显微镜(由Gordon W. Ellis博士开发)产生的曲线,该曲线可在高空间频率下产生出色的对比度图像。
在实践中,显微镜物镜或其他透镜系统的性能通常是通过在物镜的渐晕入射光瞳上以均匀分布的阵列跟踪由点光源发出的大量光线来确定的。在穿过出射光瞳并分布在像平面上之后,射线交叉点用于在像平面上绘制光点的点图。在大多数情况下,利用数百条光线来构建点图,如果这样调整光线的间距,则可以考虑光学像差。然后将所得的点图视为点扩展函数,并通过傅立叶变换将其转换为调制传递函数与空间频率的关系图。
调制传递函数的直接测量是通过利用特定的测试图案目标来进行的,该目标图案目标由高对比度周期线光栅组成,这些光栅具有一系列间距,通常从一毫米或几毫米到0.1微米不等,如图8所示。这些目标可以在各种对比度增强模式下评估聚焦和聚焦外的显微镜物镜衍射图样。检测器阵列用于通过点扩散函数的求和来测量图像平面中的光分布,并将傅立叶变换算法应用于数据以确定调制传递函数。
图6(a)所示的目标专为测试宏观成像系统(例如望远镜,双筒望远镜,视频系统,相机或数字录像机)的水平调制传递函数而设计。它由空间频率范围为每毫米0.2到80条线对的正弦图形组成,灰度光学密度范围在0.2到1.2之间变化并且正弦波调制率为80%。这种类型的目标可以在很宽的频率范围内传递图像质量信息,并且包含目标上的参考,用于表示正弦频率的对比度。在视频显微镜中,正弦目标的微观测试目标不易获得,因此通常确定与显微镜耦合的视频检测器的对比度传递函数,而不是调制传递函数。
在具有圆形光圈的系统(例如光学显微镜)中,通常使用类似于图6(b)中所示的星形和条形目标来计算或测量调制和/或对比度传递函数。。这种类型的目标具有彼此正交的径向和切向图案,也可用于检测聚焦误差和像差,例如像散。基本星标设计的变体包含成对的线和点,这些线和点允许确定焦点内和焦点外的客观衍射图,并适用于在明场,反射对比度或落射荧光照明模式下进行的测量。楔和条的间隔时间范围从0.1微米到数十微米,空间频率在每毫米0.2到25条线对之间。径向调制传输目标非常适合使用胶卷或模拟传感器进行高分辨率测量
图7(a)中显示了由以高数值孔径复消色差物镜测得的恒星目标进行的典型强度扫描,该复数物镜在透射光模式下运行。在平行于目标光栅线的尺寸上对强度值求平均值。当在不同的数值孔径下针对各种物镜收集这些类型的数据并绘制为对比度与空间频率的百分比时,该图类似于图7(b)中所示。获得。在非常低的空间频率(宽间隔时间)下,对比度传递接近100%,并且随着空间频率的增加而逐渐下降。当空间频率达到阿贝极限(成像波长除以目标数值孔径的两倍)时,对比度值通常太低而无法检测线栅中的各个间距。
在某些情况下,光学显微镜的调制传递函数实际上可以小于零。当由于散焦,像差和/或制造错误导致性能下降时,这会在其他功能系统中发生。通常,当显微镜通过焦点对准具有高空间频率特征的样本时,调制传递函数将在零上下波动。当传递函数降到零以下时,图像会经历相位反转,其中暗色特征变亮,反之亦然。
对于从硅藻壳的弯曲表面成像的周期旋钮,该现象在图8(a)中进行了说明。当改变显微镜焦点时,旋钮会发生对比度反转,从而在相对调制中产生波纹效应(比较图8(a)中的旋钮(1)至(5))。散焦程度的增加将在使用调制传递函数图观察到的振荡中产生相应的增加,而对比度反转会影响图像中越来越大的特征。当样本平面散焦时,对于具有高空间频率的微观特征,对比度会迅速下降,而对于具有低空间频率的微观特征,对比度会下降得更慢。在特定的空间频率下测量对比度,然后在图像平面的任一侧随距离变化而变化的对比度通常非常有用。有时将这种分析称为通过焦点传递函数,是对特定物镜的焦点深度的度量。
图8(b)示出了空间频率与硅藻的调制传递函数之间的关系。该图表示一系列不同的聚焦级别,其中相对于空间频率(每单位距离的正弦特征数)绘制了测得的MTF。在固定空间频率下,随着散焦的发生,相对调制值的下降在焦点级别4和5处,其中降低的空间频率变为MTF的负值。曲线编号1代表聚焦时的硅藻壳,曲线2至5表示散焦水平连续提高的结果。虚线对应于图8(a)中所示旋钮的近似空间频率。虚线与曲线4交叉时对比度小,而曲线5在y轴上倾斜至零以下时,对比度小。
所有光学系统和支持组件,包括显微镜,数字和模拟视频系统,视频捕获板,电缆,计算机监视器,胶卷乳剂和人眼,均具有特征调制传递函数。在模拟和数字电子成像检测器的情况下,上面讨论的空间分辨率和频率响应之间的相互关系是有效的。然而,在这种情况下,点扩展函数被对非常短的电脉冲的时间响应所替代,而光学传递函数被成像系统对正弦电信号相对于幅度和相位的响应所替代。电子系统缺乏光学系统的对称性,光学系统将非线性相位效应引入功能。不管这些差异,
包含一系列级联组件(显微镜,数码摄像机,视频捕获板,计算机监视器等)的光学系统的调制传递函数可以通过乘以每个组件的各个MTF来计算。通过仔细分析组合的系统调制传递函数,可以获得有关系统性能的预测。以相同的方式,可以通过将各个组件的相位传递函数相加来获得系统相位响应(注意:相移函数相加,而调制传递函数相乘)。调制和相位传递函数共同定义了系统的光学传递函数。重要的是要指出,对比度传递函数不具有与调制传递函数相同的数学特性,并且不能简单地通过将各个分量的CTF相乘来获得。
在一起工作以产生图像的级联的一系列设备中,对比度在每个步骤的某些频率区域中丢失,通常在空间频率范围的较高端。在这方面,每个检测器或图像处理功能也可以用于在某些频率上切断或增强调制传递函数。在每个阶段,图像传输和处理所引入的噪声也是空间频率的函数。因此,微调响应以获得图像对比度和系统性能不仅取决于所需图像信息的类型,还取决于图像中噪声水平的频率相关性。另外,由于检测器的调制传递函数与波长有关,因此必须在仔细定义的照明条件下确定它。
对于光学显微镜中常用的几种对比度增强模式(例如偏振光),尚未建立调制传递函数,这些模式等待更完善的图像形成理论和适当的测试图案(或样本)来通过实验确定MTF值。