成像介质的折射率对于确定显微镜物镜的工作数值孔径至关重要。当将物镜设计为在前透镜和样品保护玻璃之间的浸没介质(例如油,甘油或水)运行时,会观察到数值孔径的急剧增加。
本程序探讨了成像介质折射率的变化如何影响物镜如何捕获光线,该物镜的角度孔径任意固定为65度。要操作本程序,请使用鼠标光标平移“折射率”滑块并调整对象空间中成像介质的有效折射率(n)。样品发出的12条假设光线穿过玻璃盖罩,但只有4条以最低折射率(n)值。其他八种光线要么被物镜前透镜罩阻挡,要么被折射到物镜周围的空气中,要么被反射回保护玻璃。这些光线不会有助于图像的形成。随着通过将滑块向右移动来增加成像介质的折射率值,依次有更多的光线能够折射到物镜前透镜中,直到在最高n值时所有12条光线进入物镜为止。
决定物镜分辨率的最重要因素之一是角孔径,其实际上限约为72度(正弦值为0.95)。当与折射率结合时,乘积为:
n(sin(θ))
称为数值孔径(缩写为NA),它为任何特定物镜提供了一种方便的分辨率指标。在选择显微镜物镜时,数值孔径通常是要考虑的最重要的设计标准(而不是放大倍数)。对于非常低的放大倍率(1x到4x),该值的范围从0.1到使用专用浸油的高性能物镜的最大值到1.6。对于相同倍率的一系列物镜,随着数值孔径值的增加,我们通常会观察到更大的聚光能力并提高分辨率。
通过设计与油,甘油,硅树脂或水等浸没介质一起使用的物镜,可以大大提高物镜的数值孔径。通过使用折射率与玻璃盖玻片的折射率相似的浸没介质,实际上消除了由于盖玻片的厚度变化而导致的图像劣化,从而宽倾斜角的光线不再发生折射并且更易于被物镜抓住。典型的浸入油的折射率为1.51,且色散与玻璃盖玻片相似。穿过样品的光线在盖玻片和浸油之间遇到均匀的介质,并且在进入透镜时不会折射,而只会在离开透镜的上表面时折射。因此,如果将样本放置在第一物镜的非平点上,则通过该透镜系统的该部分成像将完全没有球差。