荧光显微镜的本质特征是提供一种通过选择性过滤的照明激发样本,然后使用第二个激发块隔离弱得多的荧光发射的机制,从而能够以大的灵敏度在深色背景上形成图像。在现代荧光仪器中,通过组合激发块可以满足这些条件,激发块可以根据双色分束器的作用和特性来协调激发和发射要求。该交互式程序使访客能够与当前的Olympus荧光滤光片一起确定的荧光团特性,以大激发和发射效率。
本程序以标准Olympus长通紫外线滤光片的光谱图初始化,该图叠加在标题为“ Spectral Profiles”的图中的合适的荧光团上。所选滤光片组合的绝对透射比在左纵坐标(透射率,%)上指定,而所选荧光团激发和发射光谱的归一化强度由右纵坐标(相对强度,%)表示。该光谱横断面在荧光团吸收和激发滤光片透射之间的重叠区域中用浅蓝色表示“γ”。同样,发射的横截面在重叠区域中显示为红色。可以使用“激发”和“发射”复选框来打开或关闭横截面重叠颜色。也可以通过分别从“激发块光谱”和“探针光谱”复选框中删除相应的复选标记来删除单个激发块和/或探针光谱。选择双频和三频激发滤波器组合后,“探头频谱”下方将出现“交叉”复选框控件。禁用此复选框可消除在这些滤镜组合中使用的多个光谱之间的交叉,以便于查看。请注意,重要的滤光片组光谱参数以及用于激发和发射的荧光探针峰值波长显示在滤光片和探针复选框旁边。
为了操作本程序,请使用窗口左侧的单选按钮选择一个激发范围。选择范围从紫外线到红外线,以及双重和三次激发,以及荧光蛋白滤光片组合。选择激发范围后,使用“选择滤波器组”下拉菜单选择所需的滤波器组合(请参见表1)。接下来,使用“选择探针”菜单来查看具有与所选滤光片组合一致的光谱特征的荧光探针集合(提示:为了更快地操作,在选择滤光片组之后,使用向上和向下箭头快速切换探针选择键)。
典型的荧光滤光片的解剖结构以及双色镜,激发滤光片和势垒滤光片的相关光谱图如图1所示。滤光片通常使用制造商提供的定制工具进行组装,因此操作员可以互换滤光片和双色镜。激发滤波器和势垒滤波器通过固定夹,光学胶或圆形螺纹安装件固定到位(请参见图1)。通常,由于这些激发块位于平坦外表面上的凹孔上方,因此可以在不打开光学模块的情况下将其移除。更换双色镜比较困难,并且需要拆卸模块才能进入内部。大多数块型部件都铸有45度对角线接头,该接头通过保护内部并以适当的角度支撑双色镜来起到双重作用。卸下将木块部分固定在一起的紧固件(销钉或小螺钉)后,可以通过松开或移动固定夹,然后小心地将其从木块中掉出,来卸下镜子。应谨慎处理二色镜,因为干涉膜通常不受保护并且容易划伤。一些供应显微镜公司的滤光片制造商还为多种荧光应用提供了多种售后滤光片和二色镜。卸下将木块部分固定在一起的紧固件(销钉或小螺钉)后,可以通过松开或移动固定夹,然后小心地将其从木块中掉下来,来卸下反光镜。应谨慎处理二色镜,因为干涉膜通常不受保护并且容易划伤。一些供应显微镜公司的滤光片制造商还为多种荧光应用提供了多种售后滤光片和二色镜。卸下将木块部分固定在一起的紧固件(销钉或小螺钉)后,可以通过松开或移动固定夹,然后小心地将其从木块中掉下来,来卸下反光镜。应谨慎处理二色镜,因为干涉膜通常不受保护并且容易划伤。一些供应显微镜公司的滤光片制造商还为多种荧光应用提供了多种售后滤光片和二色镜。
荧光滤光片设计包括长通,短通(边缘滤光片)以及窄,中和宽系列的带通滤光片。图1所示的光谱说明了几种常见滤光片配置文件的示例,表1列出了当前奥林巴斯滤光片组合的目录。图1中的发射滤光片光谱(蓝色曲线)由具有以下特性的长通干扰滤光片产生:截止波长约为575纳米。较长的波长通过滤光片,而较短的波长被阻挡。来自同一组的窄带通激发滤光片(红色曲线,图1)的带宽大约为20纳米,而双色镜(绿色曲线)具有近似于介质(455-490纳米)的透射区域和宽带通滤光片(560)。 -775纳米)。因为双色镜在可见光谱(560到700纳米)的绿色,黄色和红色区域中有效地用作长通滤光片,所以在滤光片组中将其照原样处理。对如何利用荧光团吸收和发射光谱图选择合适的滤光片组进行荧光显微镜检查的知识,对于成功实施该技术至关重要。
在荧光显微镜滤光片组合中,双色镜(或分光镜)是关键的组件,类似于长通干涉型滤光片,它们被制造成与多层介电材料具有紧密的公差。双色镜和标准干涉滤光镜之间的主要区别在于,该镜是专门为在定义的边界波长下反射和透射而设计的,并且必须相对于显微镜和照明器光轴成45度角运行。放置双色镜时,干涉膜面向激发光源,以便以90度角将短激发波长通过光学系统反射到样品。相同的反射镜还必须充当透射滤镜,以将长波长荧光发射从物镜传递到像平面。由于几乎全反射和大透射之间的波长过渡区域通常20或30纳米,因此双色镜能够精确地区分激发和发射波长。
奥林巴斯通用荧光镜组件规格
设计荧光滤光片组,以使特定的激发波长带与双色镜中的反射区域匹配。结果是激发光通过显微镜有效反射到样品上。样本发出的荧光必须与双色镜中的高透射区域匹配,以使这些波长能够传递到检测器。屏障滤光片在整个方案中不太重要,但在确保消除散射和反射的激发波长,来自目标以外的探针的荧光以及由于自发荧光引起的一般背景强度方面仍然发挥着重要作用。建立滤镜组的重要因素是要确保透过率,反射率,所涉及的滤光片的发射曲线在适当的区域内匹配。否则,激发波长可能能够穿过二色镜并雾化图像,或者荧光发射会在无意中反射到反射镜上,从而损害图像亮度。
即使在看似良好匹配的滤光片组合中,各个滤光片的光谱曲线之间也会出现轻微的重叠,从而降低性能。特别需要注意的是激发滤光片和双色镜之间的串扰,该串扰使一些激发光可以通过反射镜并从滤光片壁反射。如上所述,以高倾斜角反射的光可以部分透射通过屏障滤光片,以降低图像对比度。这种通过激发块的泄漏称为渗漏或交叉,并且几乎在所有激发块组合中都或多或少地出现。滤光片制造商和显微镜公司关注的主要领域之一是改善荧光滤光片组合的设计,以减少交叉的程度。