自从第一篇介绍原位杂交作为检测和研究染色体和细胞中DNA序列的方法的研究论文发表以来,已经过去了近25年。然而,在过去的15年中,通过发展荧光技术使光学显微镜发生了突破,该技术允许以前所未有的简便性,精确度和准确性来定位,识别和记录生物医学样品的基因组成数据。
同时使用多种荧光色可以大大扩展原位杂交的能力。最简单的多色荧光原位杂交(FISH)可用于识别与杂交中使用的不同荧光团一样多的标记特征。通过不仅使用单色,而且使用颜色的组合,可以使用数字成像显微镜在单个细胞中同时检测更多标记的特征。
在呈现图1是一个典型的多色FISH标本。正常雄性淋巴细胞与FITC生物素标记的Chr21和ChrY探针以及CY3洋地黄毒苷标记的Chrl3和ChrY探针杂交。左上方是使用DAPI滤镜组拍摄的DAPI染色的DNA核图像。右上方是使用FITC滤镜组拍摄的用FITC染色的Chr21和ChrY图像。左下方是使用CY3滤镜组拍摄的Chrl3和ChrY染色的CY3图像。右下方的图像是合并的彩色合成图像,显示了所有目标染色体的颜色。标本由马萨诸塞州弗雷明汉的整合遗传学的蒂姆·豪斯尔博士提供。
如今,多色FISH技术与数字成像技术相结合,为多种同位素序列的非同位素检测提供了无与伦比的功能,可用于分析细胞成分,染色体和基因。
在整个生命科学中,荧光是一种在一种光波长下激发化学物质发出不同波长(通常更长)的光的现象,用于研究各种各样的结构和细胞内活性。在过去的十年中,探针和显微镜技术的进步导致荧光技术的飞速发展。
这篇评论文章将介绍FISH技术的基础知识。研究人员多年来在使用FISH方面面临的局限性;影响该技术发展的硬件,软件,探针和试剂的最新发展;和该领域的最新发现。随着该技术开始从单纯的研究扩展到临床诊断环境,FISH的新发展也将得到审查。
FISH在基因组学,细胞遗传学,产前研究,肿瘤生物学,放射标记,基因作图,基因扩增和基础生物医学研究中正在迅速增长。原则上,该技术非常简单。
杂交反应识别或标记了靶基因组序列,因此可以研究其位置和大小。首先用报告分子标记来自适当的染色体特异性探针的DNA或RNA序列,然后通过荧光显微镜鉴定。然后将标记的DNA或RNA探针与载玻片上的中期染色体或相间核杂交。洗涤和信号放大后,通过荧光显微镜检查样本中的报告分子。
FISH可以对形态和基因组结构进行非常精确的空间解析。该技术快速,易于实施,并提供出色的探针稳定性。取决于所使用的探针,可以鉴定出特定物种的基因组,整个染色体,染色体特异性区域或单拷贝独特序列。
直到最近,FISH仍受硬件,软件,试剂,探针技术以及实施该技术涉及的成本的限制。
针对多色FISH优化的市售显微镜硬件直到1990年代中期才面市。在此之前,必须为FISH应用定制显微镜。大多数显微镜光学系统并非旨在检测FISH信号固有的弱光水平。随着该技术的基因组分辨率的显着提高,对显微镜光学器件的要求也进一步提高。多个波长之间的色差是个问题。特别是对于多色分析,所有透镜(包括集光透镜)都必须进行色校正。另外,落射荧光光源难以对准以均匀照明。
要分析多色FISH图像,需要使用(a)各个激发块隔离各种信号。或(b)使用带有多通二向色和势垒滤波器的激励滤光轮。滤光器技术的最新发展纠正了由单个滤光器立方体的机械切换引起的光学失准所遇到的一些先前的问题。与多通二向色滤光片和势垒滤光片一起使用的励磁滤光轮可以通过对每种颜色采用单独的励磁滤光片而没有套准偏移的方式有效地用于多达三种颜色。但是,对于三种以上的颜色,仍然必须使用单通滤镜。
高速彩色胶片或CCD(电荷耦合器件)相机被用来收集数据,并且色彩保真度存在问题。此外,在单个样本中叠加使用不同探针获取的不同颜色图像的过程也存在限制。
可以定量分析使用荧光试剂制备的样品的成像软件也受到限制,因为现有的图像分析系统并未针对荧光样品进行优化。视觉分析是一项劳动密集型工作,通常是主观的过程,在某些情况下,如果不使用高级荧光成像功能,则对荧光样品的分析将非常困难且模棱两可。研究人员通常必须由软件开发人员来创建自己的内部图像分析软件。幸运的是,今天制造商提供了许多软件选项,包括尼康的NIS-Elements显微镜软件。
试剂和探针本身不足以用于所有应用。例如,杂交位点检测的效率随探针尺寸的减小而降低,从而大大限制了通过荧光显微镜观察到的结果。不同颜色的荧光染料的数量是有限的,并且染料的光稳定性差。但是联邦政府资助的人类基因组计划的荧光染料技术和衍生技术的新发展现在正在产生影响。有所有人类染色体的探针,并且越来越多的新基因特异性探针可供使用。原位杂交试剂盒和荧光标记探针可从几家公司购得。
成本是另一个主要障碍。由于市场上没有市售的FISH系统,因此研究人员必须组装定制系统,包括试剂,探针,显微镜,成像硬件,软件以及数据分析和报告功能。要同时执行多色FISH和复杂的图像分析,研究人员可能要花费20万美元以上,对于大多数临床研究人员而言,这笔钱不容易获得。结果,许多希望在实验室中使用FISH的研究科学家被禁止这样做。
许多硬件和软件制造商已经开发出了一些方法来创建自定义系统的可负担的商业替代方案。参与FISH的许多公司和实验室之间已经形成了合作精神,从而可以取得新的突破。作者将根据自己的经验将这些发展作为此类系统的示例。
在美国使用的系统提供了一种中等价位的商业化FISH研究系统,该系统包括许多制造商的组件,并依赖于图像分析软件,显微镜硬件和配件的最新发展。临床研究实验室将发现该系统可用于多种应用。该系统提供了集成和自动化功能,以最终处理临床测试量。
此处说明的软件系统是MultiFluor(TM)多参数成像软件(Biological Detection Systems),它是一种基于Microsoft® Windows(Microsoft Corp., Bellevue, WA)的系统,可以检测,分析和显示多色的结构和分子特征。FISH样品。通过关联在每个样品中在各种波长下测量的多个特征,可以提高分析时间和准确性。该系统有助于图像采集,图像存储,数据库管理,显微镜自动化控制和全功能图形数据分析。
所示图2是MultiFluor软件数据查看屏幕。用户可以一起查看图像和相应的数据,并使用各种交互式图形绘图工具(包括直方图,散点图等)将来自多种颜色(波长)的多参数数据进行关联。此处,显示了多个数据图以及所选的多色图像集细胞(显示DAPI核,FITC-ChrX,CY3-ChrY和CY5-Chr21)以及表中显示的原始数据测量值。
FISH研究人员可以自动捕获多个波长和多个焦平面上的图像,可视化多色FISH探针,注释和打印出图像,以及存储和检索大量的多色图像数据集。可以分析多色FISH中期染色体,包括基因作图,CGH(比较基因组杂交)比率和核型生成。用户选择的样品区域可以被扫描和分析。该软件可自动聚焦,获取多种波长的图像,记录细胞的玻片位置并测量多种功能,包括探针计数,荧光强度和细胞形态。可以关联来自各种波长的多个特征。
该系统的另一个功能是可以与联网的个人计算机(PC)一起使用。在典型设置中,一台PC是连接到相机和显微镜硬件的在线分析站。该PC可处理图像采集和即时分析。其他PC充当辅助检查站,以分析第一台PC产生的结果,或离线执行专门的分析。
该软件允许所有图像成分以生动的伪彩色显示,以实现多色同时成像。例如,使用DAPI(蓝色),FITC(绿色),CY3(红色)和FITC-CY3(黄色)的组合同时进行四色实验的图像都可以单独显示,也可以组合以形成彩色合成图像图像(如图1所示)。可以交互增强每个图像以显示感兴趣的特征。此外,可以通过该软件轻松创建直方图,散点图,电子表格,折线图以及其他形式的数据列表和查看(图2)。最后,数据以易于访问的流行数据库格式维护,并且可以存储为TIFF,JPEG,GIF或其他文件。
自动化显微镜硬件也是系统的一部分。OPTIPHOT后来模型显微镜系统(尼康仪器公司,梅尔维尔,纽约)有一个自动化的,计算机驱动的XYZ载物台和聚焦系统,设计成存储每个对象的坐标。因此,只需在重新定位的细胞按钮上单击鼠标,即可立即在显微镜载玻片上重新调用重要的细胞和染色体位点,从而可以进行更广泛的显微镜视觉检查或检查。
显微镜系统最重要的优点之一是为FISH应用设计了照明器。Quadfluor(TM)和以后的模型落射荧光照明器(Nikon Instruments Inc.)最多可容纳四个荧光滤光片立方体,并显着提高亮度和对比度,这对于使用多种荧光染料的研究人员来说是重要的好处。
使用照明器,执行FISH和其他高级荧光技术的研究人员可以自由地使用四个或更多不同的探头,而不必停下来更换激发块。通过用于在四个滤镜之间切换的非常精确的线性滑块的平滑运动,可以确保出色的图像配准。
滤光片立方体通过使用激励器,二向色性和挡板滤光器技术提供更高的亮度和很高的对比度;内部挡光板 挡板过滤器的高精度倾斜安装角度;和专有的抗反射涂层。此外,落射荧光照明器一次最多可容纳四个立方体,以分离不同的荧光信号,或者可与多波段滤光片立方体一起使用,以同时对几种荧光染料进行成像。
高透射物镜对于成像染色体上的微小目标区域也至关重要。所述CFI60计划氟目标(尼康仪器公司)设有光学水泥和高透射的涂层,以允许更广泛的波长范围和明亮的图像。物镜没有颜色和球差,并且提供极高的对比度和极低的背景自发荧光。
一些制造商目前正在开发其他计算机控制的显微镜附件,以创建先进的电动系统,这些系统将是模块化的,并且对于研究和临床应用而言价格甚至更低。相机是系统的另一个重要考虑因素。可以使用数字CCD或增强型摄像机获取图像。系统中的关键因素是它们在不牺牲保真度的情况下执行弱光成像的能力。使用适当的软件,可以通过全自动显微镜自动设置相机设置,以确保准确性和易用性。
与旧的定制系统相比,此处描述的FISH系统旨在让更多的研究人员可以使用,并且正在广泛用于癌症研究,病理学,细胞遗传学和发育生物学中。它们的应用包括分析相间细胞的多色探针斑点计数,免疫表型,细胞形态和DNA含量。
该系统正在测试染色体拷贝数的畸变,该畸变与总DNA含量相关,并与膀胱肿瘤有关。在产前研究中,该系统可用于测试与产前缺陷(包括唐氏综合症,特纳氏综合症,克林费尔特氏综合症等)相关的相间核的非整倍性。在细胞和发育生物学研究中,该系统可用于绘制细胞表面标志物(例如受体),细胞质标志物(包括细胞骨架蛋白,信使RNA和特定基因)的存在和相对分布。
在过去的十五年中,研究人员已经知道,FISH技术具有巨大的潜力,不仅可以用作纯粹的研究工具,而且可以用于产前诊断,细胞遗传学和肿瘤评估等领域的临床诊断。缺乏高级的,价格适中的系统,不仅减慢了大多数研究人员使用FISH的速度,而且还阻止了该技术在诊断性医疗保健环境中不可避免地扩展。
该系统最重要的影响之一是它可以提供高级结果,而以前只有昂贵的定制配置系统才能提供。在不久的将来,将FISH不仅应用于更广泛的生物医学研究应用中,而且还可以满足患者的直接需求的梦想可能会成为现实。