免疫荧光(IF)是一种可视化细胞内过程,条件和结构的强大方法。IF制剂可以通过各种显微镜技术(例如CLSM,Epifluorescence,TIRF,GSDIM)进行分析,具体取决于应用程序或研究人员的兴趣。同时,IF对于至少可以使用简单的荧光显微镜的大量研究组来说已成为必不可少的。
IF实验的核心是两个不同组件的组合:
·首先,特异性抗体可用于形成免疫复合物,以标记细胞中所需的分子(大多数情况下为蛋白质)。
·第二,与免疫复合物偶联的荧光染料,因此在显微镜检查过程中可以看到目标结构。
图1:此图说明了间接IF的典型工作流程,其中上皮细胞粘附在盖玻片上生长。经过培养,细胞得到修复,因此用化学交联剂(如甲醛)杀害。接下来,用去污剂进行透化步骤,以使抗体能够穿过细胞膜。用正常血清,奶粉或牛血清白蛋白封闭可减少抗体与非靶标结构的非特异性结合,从而最大程度地减少假阳性信号。接下来进行与第一抗体的温育,该抗体特异性识别靶分子上的表位。在第二个孵育步骤中,荧光耦合第二抗体是结合施加到第一抗体,因此可视化靶结构。抗体孵育后,用插入到DNA中的染料(例如DAPI或Hoechst)进行细胞核染色。在将盖玻片和固定介质(例如Mowiol或Prolong Gold)固定在显微镜载玻片上之后,IF制剂即可进行显微镜检查。
根据实验的类型,有两种不同的IF变体:在直接IF或一级IF中,与荧光染料连接的特异性一级抗体可用于结合靶标结构并直接可视化。
在第二种方式中,称为间接或二级IF,进行两步孵育。首先,特定的一抗识别靶标结构。然后应用与第一抗体特异性结合的荧光染料偶联的第二抗体。通过将第二抗体导向产生第一抗体的物种来获得这种特异性(请参阅抗体和荧光染料)。比较这两个IF变体,它们每个都有不同的优缺点:
通过将一抗与荧光染料偶联,直接的IF比间接的IF更快,因为省去了费时的洗涤和孵育步骤。因此,直接中频更易于处理,因此适合在标准化中频实验中(例如在临床实践中)对样品进行快速分析。但是,必须使用对抗原具有高亲和力的功能良好的一抗。同时这也是一个消极的方面,因为荧光偶联和验证的一抗价格昂贵。此外,您需要为每个靶结构使用单独的一抗,并且与间接IF相比,直接IF中抗体与荧光染料的连接会限制您设计实验的灵活性。
这种灵活性是间接IF的显着优势。通常,在一个IF反应过程中,同一样品中的几个不同靶标结构需要可视化,因此必须为每个靶标分子选择不连续的荧光染料。在间接IF中,可以将不同的荧光偶联二抗与不同的一抗结合使用(当然要考虑物种的反应性)。相反,如果要在直接IF中“玩”目标结构的颜色组合,则每种颜色都需要一个单独的一抗。间接方法的另一个优点是通过二抗进行信号放大。多个二抗分子可与一个一抗结合,从而导致荧光增强,这意味着必须使用较少的一抗。
间接IF的工作流程可能会花费更多时间,但是由于一抗和二抗的可能组合以及通常更经济的方法,它是大多数研究人员的首选方法。
图2:通过免疫荧光观察靶结构的方法有两种:在两种变体中,都使用特定的第一抗体识别靶分子上的特定表位。在此,靶分子由几个相同的蛋白质亚基(=大分子)组成,因此它在每个亚基上均表现出几种相同类型的表位。为了简化,这里仅描述一个表位。
在直接IF中,第一抗体直接连接至荧光染料,该荧光染料在显微镜下可视化靶标结构。
在间接IF在特异性标记第一抗体的第二温育步骤中应用荧光偶联的第二抗体。由于几个二级抗体分子可以结合一个一级抗体,因此在选择抗体和荧光染料方面具有更大的灵活性,并且还导致信号放大。
高质量的IF染色最关键的工具是好的一抗。同时,对于几乎每种细胞类型中的每种蛋白质,一种或什至几种可商购的抗体是可用的。但是,这里需要注意一些非常重要的事情。
要根据您的IF染色做出精确的科学或临床陈述,您必须确保一抗对其靶抗原的特异性。这样做时,您不应仅依赖商业提供商的声明。根据关于该主题的文献中已经使用并经过验证的第一抗体选择抗体。检查制造商网站上抗体的数据表,以获取IF染色的可用图片,并将其与您的期望或其他已发布的插图进行比较。请注意抗体的克隆性,因为单克隆抗体仅特异性结合一个表位,而多克隆抗体可识别多个表位,因此更可能对非靶标结构进行非特异性标记。因此,
如果要执行多色间接IF,则不同的一抗必须来自不同物种,才能通过随后用荧光偶联的二抗进行标记来区分免疫复合物(请参见表1)。例如,您正在用源自小鼠的抗体抗蛋白A,来自兔子的抗体抗蛋白B和来自大鼠的抗体抗蛋白C进行IF。选择二抗时,您必须记住,它们各自只能特异性识别一种一抗。此外,在三个二级抗体的该实例中的荧光染料必须在波长谱上不同以在显微镜分析中区分其荧光信号。如今,可以购买与波长范围从紫外线到红外的荧光染料连接的二抗,针对几乎任何物种的一抗。因此,研究人员仅受可用配置的限制显微镜(滤光片组,激发激光器)。
靶蛋白 | 蛋白A | 蛋白B | 蛋白C |
---|---|---|---|
目标物种 | 人的 | 人的 | 人的 |
一抗 | 抗蛋白A | 抗蛋白B | 抗蛋白C |
一抗物种反应性 | 鼠抗人类 | 兔抗人类 | 大鼠抗人类 |
二抗反应性 | 山羊防鼠 | 山羊抗兔 | 山羊抗鼠 |
荧光染料激发/发射 | 490/525纳米 | 556/573纳米 | 650/665纳米 |
交叠 蛋白A
蛋白B 蛋白C
标签1:此多色间接IF的示例演示了如何在同一细胞中同时标记三种不同的蛋白质。为了使用三种不同的荧光染料偶联的二抗检测它们,三个第一抗体必须来自不同的物种。为了在显微镜中进行独特的分析,二抗的荧光染料的波长光谱必须不同。样品图像中描绘的细胞也用Hoechst 33342处理以进行细胞核染色。显微镜在Leica TCS SP2上进行。
IF协议适用于各种不同的样本或样品。最简单和最常用的方法是从细胞培养物中对培养的(真核)细胞进行染色。粘附生长的细胞可以接种在盖玻片,多孔插入物上或直接接种在玻璃底培养皿上,并在所需时间用于IF。在将细胞施加到目标玻片上后,例如通过cytospin,悬浮细胞也可以进行IF。在这两种情况下,重点都是分析细胞内过程或结构,这被称为免疫细胞化学(ICC)。
另一方面,在免疫组织化学(IHC)中,在组织特定的情况下检查蛋白质或分子的存在。在这里,器官制剂的超薄切片(通常包埋在石蜡中)用于例如研究与患病器官相比在健康器官中蛋白质的表达。除了准备组织切片外,还可以对整个生物体进行IF,这一过程称为“整体安装IHC”。为了这个目的,不同的模式生物如小鼠,鸡,斑马鱼或,例如,或植物模式生物等的胚胎拟南芥拟南芥被使用。在整个IHC中一个受样本尺寸和相关的IF试剂穿透深度的限制。单独的孵育步骤比培养的细胞染色需要更长的时间。此外,还必须配备带有用于分析大样本的特殊光学设备的显微镜。
图3:a)人肾脏的免疫组织化学(IHC)染色显示不同结构(例如,肾小球,近端小管,远端小管)的细胞类型不同。用绿色荧光染料标记的蛋白质的表达仅限于特定的细胞类型,而红色标记的蛋白质则广泛表达。
b)免疫细胞化学(ICC)图像显示通过间接IF对同一类型细胞(MDCK)中的两种蛋白质染色。在这里,不可能进行组织特异性研究,但是要分析两种蛋白是否共定位在同一结构中。两个样品均用Hoechst 33342处理以进行核染色。显微镜在Leica TCS SP2上进行。
在中频过程中应特别注意洗涤步骤,因为通过适当的洗涤可以提高中频质量。PBS是标准的洗涤缓冲液,而诸如PBS ++或PBS-T之类的变体也很普遍。PBS ++包含1 mM CaCl 2和MgCl 2,据推测具有防止细胞脱离的膜稳定作用。对于PBS-T,为了提高抗体的结合特异性,最终浓度为0.05%的洗涤剂吐温20被添加。小心涂抹和吸取洗涤缓冲液非常重要,以免使细胞脱离培养容器或盖玻片。如果您有足够的时间,请在抽气步骤之间等待几分钟,以确保洗涤缓冲液有效扩散到样本中。IF程序的各个清洗步骤在下面的标准协议中列出。
常规IF反应的各个步骤描述如下。本文末尾附有用于培养细胞间接IF的最常见程序的标准协议。
固定是中频程序的第一步。目的是使细胞,细胞形成或组织保持其当前状态,并在较长的时间内通过化学试剂保存制剂。在固定过程中,重要的是细胞结构应尽可能保持其天然构象。不同的固定方法可用于IF,每种试剂对一抗的表位有不同的作用。抗体结合位点可能被固定掩盖或损坏,这会损害IF染色的质量。由于每种抗体依赖于各种固定化合物的方式不同地结合其抗原,因此有必要尝试几种针对新抗体的固定方法。通常,可以在抗体的数据表中找到合适的固定剂的规格。理想的固定方法可保留细胞和亚细胞结构,并为抗原的良好结合提供无阻碍的抗原。实际上,您必须在两者之间取得平衡。
固定剂可大致分为两类:化学交联剂和有机溶剂。
化学交联剂,例如甲醛通过其游离氨基交联的蛋白质;在大多数情况下,细胞形态被很好地保存。但是,抗原也是交联的,可能会减少抗体的结合。戊二醛对细胞结构也具有防腐作用,但在显微镜下会导致标本的高自发荧光(请参阅“对照”)。
诸如甲醇或丙酮之类的有机溶剂具有脱氢作用并沉淀蛋白质,从而将其固定在其细胞内。但是请记住,可溶性分子和许多脂质成分会在此过程中丢失。通常,使用甲醇和丙酮的组合,因为尽管甲醇最适合保存细胞结构,但它对许多表位具有极其不利的影响。丙酮在这里的损害较小。您还应该考虑到,已经存在于细胞中的荧光蛋白(如GFP)会因与有机溶剂固定而在很大程度上被破坏。如果一抗的生产商不建议使用固定剂,则在室温下以4%甲醛开始10分钟即可适用于各种细胞系和抗原。
固定剂 | 影响 | 优点 | 缺点 | |
化学交联剂 | 甲醛 | 通过其游离氨基交联蛋白质 | 保留良好的细胞形态。 适用于已经存在的荧光蛋白。 | 抗原也可能是交联的 |
戊二醛 | 保留良好的细胞形态。 适用于已经存在的荧光蛋白。 | 抗原也可能被交联 高自发荧光 | ||
有机溶剂 | 甲醇 | 通过脱氢固定和蛋白质沉淀。 细胞将同时被透化。 | 良好保存蜂窝体系结构。 与化学交联剂相比,程序更快。 | 对许多表位有强烈的负面影响。 不适合荧光蛋白。 可溶性和脂质成分正在流失。 |
丙酮 | 对表位的损害较小。 更快的程序 | 不适合荧光蛋白。 可溶性和脂质成分正在流失。 |
标签2:固定试剂
通过通透性,抗体无法进入细胞内结构,否则抗体将无法穿过细胞的脂质膜。根据固定类型的不同,需要一个单独的通透步骤。当用有机溶剂固定时,细胞膜已经变得可渗透,您可以直接进行封闭。用化学交联剂固定的细胞需要使用去污剂进行额外处理以实现通透性。可以使用Triton X-100或NP-40等经典洗涤剂,但也可以使用皂苷,吐温20或洋地黄皂苷。同样,根据所施加的物质,其浓度和孵育时间可获得各种结果,因此您应在开始时尝试不同的参数。典型的起点表示通透性为0。
如果要通过IF分析脂质相关或膜蛋白,则应仔细进行通透步骤(=脂质去除)。为此目的的一个很好的选择是皂素,它可以选择性地从质膜上去除胆固醇,而使细胞内膜保持完整。如果在抗体染色之前没有透化作用(只能通过化学交联剂固定才能实现),则可以特异性标记细胞外质膜结合抗原,以区别于细胞内抗原库。诸如DAPI或Hoechst的核酸染料(请参见Nucleus染色和样品固定)可透过膜,不需要渗透。
阻断是使细胞内一抗的非特异性结合最小化的重要步骤。为此,可以使用牛血清白蛋白(BSA),奶粉或血清中的蛋白质。重要的是,这些阻断蛋白不能来源于一级抗体产生的物种,否则二级抗体对一级抗体的特异性将会丧失。如果使用二抗,例如在山羊中产生的抗鼠一抗的抗体,那么理想的封闭剂是正常的山羊血清。封闭溶液的浓度通常为1%(乳粉,BSA)至5%(正常血清),并在洗涤缓冲液中稀释。孵育在室温下进行30-60分钟。
通过固定,透化和封闭制备样品后,就会发生实际的免疫反应。现在将样品与特异性一抗一起孵育,以标记所需的靶标结构。可以将几种一抗同时应用于样品。如上所述,几种一抗必须来自间接多色IF中的不同物种。首先根据制造商,在所选的封闭溶液中进行抗体稀释。如果您对染色不满意,或者制造商未提供有关有效稀释的任何信息,则应尝试在1:50到1:1,000之间进行浓缩。取决于抗体的亲和力,孵育时间可以变化。室温下默认孵育时间为1-2小时;
如果您进行直接中频分析,您可以直接继续进行样品安装,因为一抗已经带来了自己的荧光染料。现在在间接IF中,二抗荧光标记一抗。这里的关键点是与一抗孵育后要进行大量洗涤,以减少二抗的非特异性结合。第二抗体也可以在封闭溶液或洗涤缓冲液中稀释。如果制造商没有特别说明,则可以以1:200的稀释度开始,并在室温下孵育1小时。有必要在黑暗中进行孵育步骤,以防止荧光染料漂白。
免疫反应后通常是用DNA染料对细胞核染色。一方面,这使研究人员感兴趣的话,可以在显微镜检查期间在细胞或组织部分内更好地定向,另一方面,它指示细胞状态(例如有丝分裂)。为此,即使没有透化作用也可插入DNA的染料,例如Hoechst或DAPI。因此,您应该非常小心,避免皮肤直接接触这些染料!在室温下用在PBS中稀释的Hoechst或DAPI进行简单的核染色10分钟。
完成IF程序后,必须安装样品以适合显微镜检查。为此,使用固定介质(例如Mowiol或Prolong Gold),该固定介质将样品固定在显微镜载玻片上,并且还可以防止其脱水。另外,固定介质会增加折射率,这对于带油浸物镜的显微镜检查是有利的。一些制造商提供了带有添加剂的固定介质,例如DABCO,一种防褪色剂,可保护样品免于光漂白。根据使用的荧光染料,某些抗褪色剂比其他抗褪色剂更有效。此外,还可以使用添加了DNA染料的固定介质,以便在包埋过程中对细胞核进行染色,而单独的细胞核染色是多余的。如果通常使用硬化的安装介质,样品可以整夜固化,因此第二天可以进行显微镜检查。以这种方式生产的永久制剂几乎可以在室温或4°C的黑暗中无限地储存,但是请记住,荧光染料的荧光强度会随着时间的推移而减弱。
图4:粘附生长的上皮细胞(MDCK)培养在盖玻片上,固定后的细胞核用Hoechst 33342染色。大多数细胞显示间期DNA染色,但有些细胞显示浓缩的染色体,在有丝分裂中分离(星号)。显微镜在Leica TCS SP2上进行。
图5:此图像显示了成纤维细胞(COS-7)中细胞微管网络的间接IF染色。细胞核用Hoechst 33342染色,并在Leica TCS SP2上进行显微镜检查。
免疫荧光必不可少的是适当控制,以正确解释显微镜图像。控件缺失或不正确通常会导致错误的肯定陈述和错误的数据。首先,您应该分析仅固定,透化和封闭的样品,以便了解细胞区室的自发荧光。有时,即使没有IF染色,结构也会呈现高荧光性。
作为进一步的控制和调整间接IF的显微镜参数,使用的样品也已经如上所述进行了处理,但还与第二抗体孵育。首先,这将揭示二抗与标本之间的强非特异性结合。其次,设置显微镜参数,以便在获取此控件的图像期间不记录任何信号。此设置用作后续采集的阈值,以排除二抗产生的假阳性信号。在直接中频中,自发荧光控制用于调节阈值。接下来,分析与特异性一抗一起孵育的样品,在间接IF的情况下与二抗一起孵育。
为了确保第一抗体排他性地标记所需的结构,一些制造商提供了用于第一抗体的封闭肽,该肽可掩盖特定抗原,从而防止抗体与其表位结合。这比较昂贵,但也是确定抗体特异性并因此获得可靠结果的最佳方法。在多色IF实验中,您还必须注意所选荧光染料之间的串扰。如果是首次执行多色IF,建议在单独的准备工作中另外对目标结构进行染色,并将这些图像与多色图像进行比较。最终,您应该精打细算地查看所获取的数据,并将其与您的期望值和相同一级抗体的现有数据进行比较。
控制 | 样品制备 | 对...有用 |
自发荧光 |
| 细胞自发荧光的分析。 直接中频显微镜的阈值。 |
二抗(仅间接IF) |
| 二抗的非特异性结合。 间接中频显微术的阈值。 |
多色IF |
| 比较单个染色与多色图像:
|
封闭肽 |
| 检查第一抗体与其表位的结合特异性。 |
标签3:要测试哪个控件?
如前所述,IF具有许多优点,但也有一些缺点。关键是样品的固定:固定意味着杀死,因此不再可能进行活细胞成像。动态过程的分析因此很复杂,因为必须在每个时间点固定和染色细胞。因此,IF无法观察到快速的动态过程。这显然是表达带有荧光标签(例如GFP)的融合蛋白的优势,适用于活细胞成像。如上所述,IF过程(固定/通透化)改变了蜂窝体系结构,因此伪像可能会被解释为假阳性信号。因此,必须为每种IF染色准备适当的对照,这可能很耗时。另一个缺点是不可避免的:荧光染料的光漂白。荧光蛋白(如GFP)也受此影响,但在适当条件下存储时,即使在永久制剂中放置数月也可检测到GFP。相反,IF荧光染料失去强度的速度更快,这在显微镜检查过程中样品的快速漂白反映了出来。甚至带有抗褪色剂的安装介质也只能在此临时提供帮助。
图6:整个过程流程图
中频程序的持续时间:约5个小时。
这是通过化学交联剂固定的培养细胞在盖玻片上间接IF的标准方案。
·加湿室非常适合IF程序,并且可以很容易地自制(请参见幻灯片“如何准备加湿室”)。它防止了制剂的干燥,并允许在黑暗中孵育,这对于处理荧光染料很重要,对于已经存在的荧光蛋白是必需的。
·选择的体积要使盖玻片完全润湿。确保样品永远不会完全干燥。
·所有孵育步骤均在室温下进行。
清洗细胞两次,并用镊子将带有向上翻转细胞的盖玻片小心地放入加湿室中。
用4%甲醛修复10分钟,然后洗涤3次。
用0.1%TX-100 / PBS渗透15–20分钟,并洗涤3次。
用5%正常山羊血清/ PBS或1%BSA / PBS封闭45分钟(无需清洗)。
在封闭溶液中稀释一抗,并将其应用2小时(或在4°C过夜)。彻底清洗4次以除去未结合的一抗。
与二抗孵育1小时,在封闭溶液或洗涤缓冲液中稀释。
吸出二抗,如果需要,与Hoechst或DAPI [1 μg / mL]在PBS中孵育10分钟。彻底清洗4倍,即使没有核染。
用镊子轻轻取下盖玻片,将其浸入dH 2 O中,以除去洗涤缓冲液中的残留盐分。
在显微镜载玻片上滴一滴安装介质,然后将盖玻片倒置,使细胞倒置。用镊子轻轻按压样品,使安装介质分布均匀,而不会挤压样品。
固化后即可用于显微镜检查。
1.要组装加湿室,您需要以下物品:带盖塑料盒,泡沫塑料镶嵌物,一片石蜡膜,结实的纸巾,水和镊子,用于处理盖玻片。
2.将嵌体放入盒子中,并彻底弄湿。
3.将封口膜放在嵌体上。
4.用镊子小心地将盖玻片从封口膜上翘的培养皿中移出,并移出细胞。标记盖玻片的位置,并确保细胞永远不会干dry。
5.弄湿纸巾并将其紧紧地放在盒子上。注意毛巾不要碰到盖玻片。
6.将盖子盖在盒子和毛巾上,将细胞孵育所需的时间。
幻灯片:如何准备加湿室。
·1×PBS(磷酸盐缓冲液)
·137毫米:NaCl
·2.7毫米:KCl
·10毫米:Na HPO 4
·1.8毫米:KH 2 PO 4
·用HCl将pH调节至7.2–7.4
·对于PBS ++,添加终浓度为1 mM CaCl 2和MgCl 2
·对于PBS-T,添加0.05%Tween的终浓度20
·甲醛:
·将4%PFA(多聚甲醛)溶于pH 8的温暖的(50-70°C)dH 2 O中(用NaOH调节)。
·加入10×PBS至终浓度为1×PBS(例如900 mL 4%PFA / dH 2 O中的100 mL 10×PBS)。
·用HCl将pH调节至7.2–7.4。
·甲醇(预冷至–20°C):
·100%甲醇(–20°C)
·甲醇/丙酮(预冷至–20°C):
·50%甲醇(–20°C)和50%丙酮(–20°C)
·TX-100(Triton X-100):
·终浓度为0.1%TX-100的PBS
·皂素:
·终浓度为0.1%皂苷的PBS
·其他去污剂可以以相同浓度在PBS中使用。
·BSA(牛血清白蛋白):
·最终浓度为1%BSA的PBS
·牛奶粉:
·终浓度为1%奶粉的PBS
·正常血清:
·终浓度为5%正常血清的PBS
·Hoechst或DAPI:
·配制Hoechst 33342或DAPI在PBS中的最终工作浓度为1 μg / mL的溶液。