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光学成像仪器可以放大微小的物体，放大远处的恒星，并揭示肉眼看不见的细节。但是众所周知，它存在一个烦人的问题：景深有限。我们的眼透镜（光学成像仪器）也有同样的问题，但是在信号到达有意识的认知之前，我们的大脑会巧妙地删除所有未聚焦的信息。如果图像保留在照片上，则无法使用。通过优化参数，我们可以增加焦点的深度，但是随后通常会丢失分辨率以及z位置的信息。
如果可以只记录聚焦的特征并测量相对的z位置，则可以解决聚焦深度问题：在记录一堆图像后，我们可以重建整个样本而没有模糊的部分并量化对象。所有这三个维度。
图1：真正的共聚焦扫描显微镜中的光路示意图。激发光（蓝色）通过用于入射照明的分光镜耦合到显微镜中，并通过物镜1聚焦到衍射极限点。发射光通过分光镜并被针孔进行空间滤波。在x和y方向上扫描光斑会生成图像，即光学部分。
最常见的是，我们有共聚焦显微镜在提及光学切片时请牢记。共聚焦原理无缝地集成到标准型光学显微镜中（尽管技术集成需要进行很多修改）。与普通的光学显微镜不同，真正的共聚焦成像需要对单个光斑进行尽可能小的照明。光斑的直径由波光学控制，并在d≈λ/ NA处达到衍射极限最小值。详细的强度分布由点扩展函数描述。同时，检测器还必须感测尽可能小的斑点。由于光路是对称的，因此相同的数学运算适用于点状检测器的感测分布。通过将针孔孔径引入到检测路径中的中间像平面中来实现点检测器。在样本中照明和检测的焦点必须重合-因此采用“共聚焦”显微镜。如图1所示，此针孔的作用是光学去除了所有不是从焦平面发出的光线。它的功能是z方向上的空间滤波器。
由于光学刀一次只能在一个点上工作，因此该点必须从上到下成行移动才能生成图像。强度被同步转换为数字信息，并存储在计算机上的帧存储中。从该电子存储器中，图像显示在普通监视器上。由于必须逐点顺序构造图像，因此只有在某些影响帧格式和可接受的信噪比的限制下，才可能实现高帧速率。高度透明的光路，例如LeicaSP检测器以及非常高效的传感器（例如混合检测器（HyDs））有助于提高高帧率性能。同时，共聚焦显微镜可实现高达12,000 Hz的行频，而PAL标准电视的行频约为15,000 Hz。在适当的条件下，帧速率最高可达每秒500个是可能的。尽管如此，为了获取足够高的信噪比图像，帧速率通常不会超过每秒10帧。
与扫描过程有关的另一个问题是，焦平面上方和下方的样品区域会暴露于大量的照明能量，这对图像没有帮助，但可能导致荧光染料的光物理降解。由于荧光染料也会在焦平面上方吸收光，因此当深入样品时，荧光强度会越来越暗。这可以通过自动增益调整来补偿，但是要以信噪比为代价。
真正的共聚焦成像的积极方面是高分辨率（易于使用高NA透镜），图像在焦平面内固有地均匀并且使用共聚焦显微镜可以轻松，轻松地分析标准制剂的事实。共聚焦显微镜基于标准的同轴光学显微镜，显微镜师可通过一个简单的开关即可访问所有标准显微镜方法和对比模式。它也是其他类型的扫描显微镜的基础，例如多光子激发，高次谐波产生显微镜，相干抗斯托克斯拉曼散射显微镜和超分辨率技术STED（受激发射损耗显微镜）。
尽管共聚焦显微镜是光学切片的黄金标准，但半个世纪前才出现了第一台执行此任务的显微镜。“ Spalt-Ultramikroskop”使用聚焦在狭缝光圈中的明亮光源（弧光灯或太阳）。第二个透镜（通常是可重复使用的物镜）将该狭缝垂直于显微镜的光轴投射到样本中。这种设计有效地创建了大约两微米厚的片状照明。最初的应用程序涉及亚分辨率粒子，例如有色玻璃中分散的金。事实证明，它适用于各种胶体样品和混浊介质，在化学和医学研究中通常会对其进行分析。这种早期的光片显微镜仅限于观察低至5纳米的微小颗粒，这会导致照明的球形散射，这种散射在显微镜的垂直光束路径中可作为衍射图观察到。作为结果，它可视化了称为“ Ultramikronen”的不可分辨的粒子，这些粒子“超出了显微镜的分辨率”。“超显微镜”这个名字最初就暗示了超分辨率设计的类型，但作者明确指出，超显微镜显然受到光学衍射的限制。
图2：Spalt-Ultramikroskop中光路的示意图。激发光由物镜1通过狭缝（Spalt）正交聚焦到样品中。该发射由物镜2收集并且可以由照相机记录为光学部分。
后来，开发了绕过精密狭缝的设计，并采用了筒形透镜来产生垂直于光轴的光片。然后将这种布置用于荧光固定样品。事实证明，薄板显微镜对于厚样品的快速实时成像特别有利，因为漂白不那么明显，并且由数码相机共聚焦和数字薄板成像并行执行图像记录，如Huisken所示。在z方向上的吸收不是问题，因为显微术师正在聚焦的z位置上的所有位置的照度均相等。但是，发射光必须像普通显微镜一样通过样品，这可能会使厚样品中的图像在某种程度上劣化。仍然在横向上有阴影效果：首先在照明光进入样品的一侧吸收光，因此荧光在相反的一侧变暗。Voie通过旋转样本并收集不同方向的图像来补偿这种影响。Dodt从两个相对的侧面照亮了样品，以补偿光片的吸收。凯勒（Keller）无需使用投影的狭缝孔径或柱面透镜，扫描了垂直于观察轴的细激光束。该方案称为“数字扫描光片”。
图3：真正的共焦扫描和垂直转折数字光片扫描的相干融合光路示意图。有关详细信息，请参见图1和2的图例。此配置允许在两种光学切片模式之间无缝切换。
两种范例均已引入生物医学研究和常规研究中，为生物学概念和疾病以及细胞成分的构建和功能提供了许多新的见解和理解。在仪器方面，两种方式有很大不同，将正交照明视为系统的独立部分，并与同轴显微镜组合以执行任务。共聚焦显微镜使用光束扫描系统创建二维图像，数字扫描的光片使用光束扫描从线条创建区域。这立即引起了一个问题，即是否有可能将两种策略结合在一个单一的系统中。徕卡显微系统公司在新型徕卡TCS SP8 DLS中引入了这种组合光片显微镜。
徕卡TCS SP8 DLS同轴扫描设备基于普通的共聚焦显微镜，该同轴扫描设备通过借助检测针孔在空间上过滤散焦光来执行光学切片。图像通过检流扫描镜在两个横向方向上移动照明光斑来生成。要将这样的系统转换成数字光片显微镜，必须使照明光束垂直于光轴穿过样品。通过在焦平面的位置处，在观察场的外面引入一个小镜子，可以实现所需的正交照明。这样的偏转镜与观察镜机械连接，以确保照亮的z位置始终处于图像生成光学系统的焦点上，
照明光束的单个位置不会产生二维图像，而只会产生一条直线。可以利用在共聚焦显微镜中固有实现的横向扫描模式之一来在垂直方向上扫描照明线，从而产生所需的二维平面。
如果在相反的一侧插入第二个反射镜，则只需使用共聚焦显微镜的光束扫描装置的第二轴，就可以通过同一透镜从两侧照亮样品。这满足了补偿吸收引起的阴影的需要。然后，再次从具有不同照明方向的两个图像构造最终图像。
为了以共焦模式成像，z驱动机构必须定位成使照明光束的焦点与要成像的特征重合。然后，扫描过程仅覆盖视场的内部，这是操作共聚焦显微镜的常用方法。要切换到光片采集，必须将焦点移动大约镜子到光轴的距离。在这种情况下，照明光束的平面产生部分将落入观察场的中心。扫描设备需要指向视野的边缘才能撞击镜子。
这种组合不仅可以将两种不同的仪器合并为一个仪器，从而降低了仪器成本，而且还可以将经典的共焦显微镜和数字光片显微镜相结合。因此，同一系统允许使用最适合解决当前研究问题的技术来探索任何样品。由于共焦路径可用于光操纵以及随后的诱导效果的柔光片成像，因此它还提供了各种新的应用机会。
