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奥林巴斯显微镜偏斜照明光路图


2021/3/17 9:16:20 发布者:admin


偏斜照明所需的条件可通过简单的透射光学显微镜通过多种技术来实现。简单的方法是偏移部分关闭的聚光镜虹膜光圈,在聚光镜孔径附近插入不透明的扇形光圈,或使光源图像偏心。不管用于建立偏斜照明的机制如何,成像所需的条件都保持不变。

该交互式程序探讨了显微镜光路的变化,并演示了随着照明从轴向偏斜到高度偏斜而在物镜后焦平面发生的事件。本程序使用在窗口中配置为轴向明场照明的显微镜示意图进行初始化。显微镜图上方是虚拟物镜后焦平面的视图(黑圈),该图说明了穿过样品的零级(未衍射光;在程序中由标记为0的黄点表示)和两个一级衍射光。边带(-1和+1)。要使光源偏离显微镜光轴,请使用鼠标光标平移“照明角度”滑块从左到右。在左手位置,虚拟显微镜以明场(轴向)模式存在,照明光线轨迹始于聚光镜前焦平面,并以显微镜光轴为中心。假定样品是具有周期性结构的衍射光栅,该结构非常接近显微镜物镜的光学分辨率极限。

当“照明角度”滑块缓慢向右平移时,穿过显微镜的光线轨迹的起点移到左侧,这说明了通过显微镜进行偏斜照明的新途径。同时,虚拟物镜后焦平面中的衍射点移动,直到-1边带完全消失,并建立了偏斜照明。偏斜照明的入射角在滑块上方指示,并且达到72度的大值,即干燥显微镜物镜的大约一半的角孔径(0.95的数值孔径)。该角度的上限值代表偏斜照明技术可提供的分辨率极限。

当照明的方位角在聚光镜前焦平面中向左移动时,在物镜后焦平面中可见的图像也会发生横向位移,直到一阶最大值(-1)达到足以不再除零阶最大值(0)外,相同阶次的另一个最大值(+1)以较小的偏斜角前进,并且仍然可以进入物镜前透镜。物镜偏斜照射时,它们会在中间像平面受到相长和相消干涉,以形成相对高对比度的图像。

偏斜照明能够分辨样品细节,而传统的明场技术很难分辨这些细节。当偏斜的光线以与显微镜光轴成“ ob ”角的角度入射到物镜时,聚光镜与物镜之间的介质的折射率为n,则分辨率,照明波长(λ)和折射率可描述为:

分辨率(D)=λ/(n•sin(ob)+数值孔径(NA))

一些作者将术语n•sin(ob)等同于照明的数值孔径,但这具有误导性,因为该方程式并非旨在表示从所有方位角发出的整个光锥,而是局限于由单个方位角的轴向照明。如果样品的细节精细,以至于零阶未衍射和一阶衍射边带光之间的距离等于物镜孔径光阑的直径,则分辨力是轴向透射照明的两倍,表示为由等式:

分辨率(D)=λ/ 2NA

显微镜符合上述方程式时(使用偏斜照明时)所需的光学条件应使样品周期的精细细节受到物镜的分辨能力的限制。在许多情况下,利用明场照明解决的标本细节严重缺乏对比度,几乎无法可视化或成像。用偏斜照明观察标本的结果通常是分辨率的提高(超过了使用封闭的聚光镜孔径光阑在明场照明中获得的分辨率),并且在阴影图像中还产生了阴影状,样品图像中出现浮雕状的伪三维外观。

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