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直到 1980 年代后期，大多数生命科学研究人员通过使用固定和染色（实际上是无生命的）标本捕获各种细胞学特征的单个快照来研究生物结构的复杂细节。然而，在过去的几十年里，生物和医学科学的研究重点已经转移到研究生命系统中分子、细胞和整个生物体水平上发生的动态过程，时间尺度从几毫秒到几小时不等。这种向活细胞成像过渡的驱动因素是显微镜仪器和更灵敏的数码相机的先进发展，以及能够高精度靶向特定细胞器的新型合成和基因编码荧光团。因此，
活细胞延时成像技术在透射光和荧光显微镜中的应用越来越多，这也许最好的证明是科学文献中几乎每天都会出现大量研究报告。在大多数情况下，在专门为显微镜阶段设计的组织培养成像室中，使用与顺序图像捕获相结合的荧光探针技术来监测细胞活动。先进的对比度增强技术，例如微分干涉对比度 (DIC)、相位对比度、暗场、荧光和霍夫曼调制对比度(HMC)) 可用于在很长的时间段内将广泛样本的动态记录为连续序列。同样，更先进的荧光技术，包括激光扫描共聚焦、旋转圆盘、多光子和全内反射 (TIRF) 显微镜，正越来越多地用于监测细胞内过程。
除了在细胞生物学中的重要性外，延时成像还可用于研究化学、工业和地质系统中的各种液体样品和固体材料，以及新的和先进的液晶相变和结构分析。金相学中的材料。在基础生命科学中，延时成像（也称为显微摄影）) 已被证明是研究粒子运动、分子间相互作用、细胞迁移、细胞分裂、细胞器动力学、细胞凋亡、分化和神经过程产物的有效工具，其中包括许多新的和有前景的应用。最近，跨越整个可见光谱的荧光蛋白的发展革命导致了无数动态细胞内事件的发现，这些事件只能通过观察随着时间的推移进行研究。
图 1 是活细胞显微镜中用于延时成像的几种更有用和更流行的对比度增强技术的示例。图 1(a) 中所示的贴壁印度麂鹿皮肤成纤维细胞以 DIC 模式成像，以显示细胞骨架的应力纤维生长。图 1(b)中大鼠袋鼠肾上皮细胞 (PtK1系) 的相差成像揭示了因细胞分裂中止而产生的双核细胞，而个体人类骨肉瘤 (U2OS)的成功分裂线）细胞在图 1（c）中用 HMC 捕获。这些强大的透射光技术被广泛用于延时活细胞成像。同样，激光扫描和旋转圆盘共聚焦显微镜的荧光技术（图 1（d），中国仓鼠卵巢细胞中的 dEos 荧光蛋白；和图 1（e），HeLa 细胞中 EGFP 标记的内质网）可用于许多观察结果，包括光活化、共振能量转移 (FRET)、光漂白技术、运动性和荧光蛋白分布的动力学。全内反射荧光显微镜（TIRFM; 图 2(f) 说明了在狐狸肺成纤维细胞中与纽蛋白融合的 mCherry荧光蛋白）用于观察盖玻片附近细胞膜中发生的事件。
延时成像在活细胞中的首次应用是在 100 多年前（大约在查理卓别林制作他的第一部电影前五年）由一名年轻的法国研究生报告的，他正在检查产生梅毒的螺旋体的运动性。学生让·科曼登（Jean Comandon）使用一个巨大的电影胶片相机和一个小得多的暗场显微镜捕捉图像序列，这是那个时期的复杂配置，但按照现代标准被认为非常粗糙。在20世纪下半叶，延时图像序列通常使用配备相差照明的显微镜上的紧凑型 16 毫米相机记录。连续图像捕获之间的时间间隔由笨重的辅助间隔计控制，在图像之间打开和关闭灯以避免过度照明和加热样品的设备。用于显微镜的电子光源快门直到 1980 年代才在市场上销售。
依赖胶片相机的早期延时成像技术存在许多缺陷。首先，影片必须（在大多数情况下）被送出进行商业处理，这意味着对实验结果的评估可能会延迟数天甚至数周。此外，使用胶片成本高昂，并且会受到许多处理变化的影响，这通常会导致结果不一致。例如，曝光错误可能要在实验结束数周后才被发现，并且焦点漂移的常见问题通常在查看处理过的胶片之前无法检测到。尽管在使用现代数码相机时，与延时成像相关的许多伪影，例如焦点漂移、样品加热不均匀和振动，仍然会妨碍最终结果，
从 1970 年代开始，视频管摄像机和图像采集卡计算机卡终于与显微镜集成在一起时，延时电影显微摄影的第一次重大进步发生了。尽管摄像机产生的图像的分辨率低于传统的基于乳剂的胶片，但与胶片相机相关的曝光设置的不确定性大大降低。作为一个额外的好处，可以在采集过程中查看图像序列，并且可以立即使用录像带输出查看和编辑扩展延时实验的结果。相比之下，如果考虑到胶片处理的费用，与磁带录音机相连的摄像机的成本明显低于胶片电影摄影机。胶片相比，录像带的复制成本也低得多，并且可以擦除或覆盖包含不良序列的磁带并重新投入生产。
活细胞动力学的一个例子如图 2 所示，使用光转换光学荧光笔荧光蛋白来标记线粒体。该标本是一种粘附的兔肾上皮细胞培养物（RK-13 系），其表达了红绿光可转换 dEos 荧光蛋白与线粒体靶向肽序列的融合。在用 488 纳米激光照射后，在整个细胞质中观察到丰富的绿色荧光线粒体（图 2（a））。位于长丝状体中的单个线粒体在第一帧中使用来自 405 纳米激光的短脉冲进行光转换。当未转化的线粒体接近时，新的红色荧光细胞器在 20 分钟的间隔后被捕获（图 2（b））。分片后，未转化的线粒体靠近光转化的邻居（图 2（c）），两个线粒体随后与分布在细胞器之间的光转化的荧光蛋白标签融合（图 2（d））。在第二个碎片事件之后（图 2（e）），一小部分光转化的线粒体接近第二个未转化的线粒体，但不是融合，而是形成一个环形（图 2（f））。图 2 中所示的帧是从包含在 2 小时内收集的 1000 多张图像的延时序列中选择的。一小部分光转化的线粒体接近第二个未转化的线粒体，但不是融合，而是形成一个环形（图 2（f））。图 2 中所示的帧是从包含在 2 小时内收集的 1000 多张图像的延时序列中选择的。一小部分光转化的线粒体接近第二个未转化的线粒体，但不是融合，而是形成一个环形（图 2（f））。图 2 中所示的帧是从包含在 2 小时内收集的 1000 多张图像的延时序列中选择的。
尽管越来越多的研究人员开始使用荧光蛋白进行活细胞延时序列采集，但数字静止图像继续广泛用于记录细胞培养中长时间的动态事件。在许多情况下，可以使用比串行延时成像更高的照明水平，以更高的分辨率捕获间歇性单幅图像，并提高信噪比。尽管如此，计算机体系结构和数据存储容量的快速技术发展已将缩时电影显微技术推向了一个新的复杂水平。以前在主内存、快速缓存、处理器速度、硬盘容量已被克服，因此包含数千帧和组成数 GB 的复杂图像序列可以本地存储在主机上。硬件进步与新的、复杂的软件包并行，这些软件包能够控制高速图像采集的几乎所有方面，包括载物台运动、照明强度、曝光时间（和其他相机参数）、辅助光学元件（例如将 DIC 棱镜放置在光路）和波长。最先进的软件还可以执行采集后图像处理以增强视频功能。在更简单的系统中，可以使用中等性能的计算机通过多个接口控制科学级数码相机。硬件进步与新的、复杂的软件包并行，这些软件包能够控制高速图像采集的几乎所有方面，包括载物台运动、照明强度、曝光时间（和其他相机参数）、辅助光学元件（例如将 DIC 棱镜放置在光路）和波长。最先进的软件还可以执行采集后图像处理以增强视频功能。在更简单的系统中，可以使用中等性能的计算机通过多个接口控制科学级数码相机。硬件进步与新的、复杂的软件包并行，这些软件包能够控制高速图像采集的几乎所有方面，包括载物台运动、照明强度、曝光时间（和其他相机参数）、辅助光学元件（例如将 DIC 棱镜放置在光路）和波长。最先进的软件还可以执行采集后图像处理以增强视频功能。在更简单的系统中，可以使用中等性能的计算机通过多个接口控制科学级数码相机。最先进的软件还可以执行采集后图像处理以增强视频功能。在更简单的系统中，可以使用中等性能的计算机通过多个接口控制科学级数码相机。最先进的软件还可以执行采集后图像处理以增强视频功能。在更简单的系统中，可以使用中等性能的计算机通过多个接口控制科学级数码相机。
专业荧光显微镜技术的现代进步，包括激光扫描共聚焦、旋转圆盘、TIRF和多光子结合最新的检测器技术，科学家们能够利用新开发的针对特定细胞区室、生物分子和受体蛋白的荧光探针来观察广泛的动态事件。通过采用这种先进的方法，可以在四个或更多维度（横向、轴向、时间和光谱）同时记录多个事件，以在选定的时间段内提供细胞内活动的非侵入性窗口。此外，活细胞成像技术帮助引领了当前的细胞生物学革命，为科学家提供了以前无法获得的空间和时间信息。
尽管在过去几年中光学显微镜技术取得了广泛的进步，但在延时成像过程中，由于标本焦点的缓慢变化而表现出的轴向波动仍然是一个重大问题。术语“焦点漂移”通常用于描述显微镜无法长时间保持选定的焦平面。这种伪影的发生与活体标本的自然运动无关，主要受多种因素影响，如下所列。一般来说，使用高倍率和数值孔径油浸物镜（具有非常浅的焦深）时，焦点漂移比使用具有更宽焦深的低倍率（10 倍和 20 倍）物镜更成问题。
热漂移- 温度变化可能是最常见的焦点漂移来源。由于实验室中的空调和中央供暖装置、显微镜上的强照明源以及物镜和载物台加热不均匀而产生的温度波动通常是焦点漂移的主要罪魁祸首。此外，用于构建培养室和/或显微镜光学系统的材料的不同膨胀和收缩率会导致物镜前透镜和盖玻片之间的距离发生变化，从而导致失去焦点。使用最高放大倍率的物镜，仅 1 摄氏度的变化通常足以在焦平面中产生 0.5 至 1.0 微米的偏移。
盖玻片 Flex - 培养室温度的热梯度和其他变化，以及在灌注期间迫使流体通过成像室相关的伪影，可产生隔膜效应当盖玻片弯曲时，样本弹离焦点。在灌注系统控制不佳的腔室中，这种伪影通常很明显。在图像捕获序列可以在灌注会话之间交错的情况下，盖玻片弯曲可能不会出现重大问题，但它会严重影响那些需要相对较高时间分辨率（2 秒或更短）的研究。通过减小流动室中灌注输入端口的直径，并通过为显微镜配备客观加热器来补偿室温度的波动，可以最大限度地减少盖玻片弯曲。在具有导电透明涂层以保持温度的培养室中也可能发生盖玻片的小但可重复的运动。在这种情况下，将电流负载施加到带涂层的盖玻片上会产生收缩或膨胀，从而暂时扰乱焦点。一旦移除当前负载，通常会重新建立正确的焦平面。
成像室加热不均匀- 活细胞成像室有多种配置，通常使用完全不同的技术来将样本保持在恒定温度。例如，带有用导电涂层加热的盖玻片的腔室（图 3（a））通常比仅加热盖玻片外围的金属的腔室在整个玻璃表面产生优异的热一致性。在后一种情况下，热梯度可能很大（图 3（b））。此外，高数值孔径油浸物镜或水浸物镜可以充当散热器，将热量从样品室传导到金属物镜中，从而在浸没介质区域产生热梯度。其他文物，
振动- 一种具有多种起源的常见人工制品，除了周围环境中出现的源之外，振动通常由与乐器配置相关的各种元素产生。在显微镜和附件中，滤光轮、快门、自动载物台、滤光器转盘和其他组件的机电运动是干扰稳定聚焦的常见振动源。常见的外部（非显微镜）振动源是空气处理系统、人流量、冰箱压缩机、电梯和成像装置附近的重型设备运动。隔离台、阻尼垫和台式平台可从各种分销商处获得，可用于最大限度地减少振动。
机械不稳定性- 满载物镜的物镜转盘重量在 3 到 5 磅之间，这通常代表显微镜聚焦机制中涉及的机械部件的显着重力应变。结果，仅由于物镜转盘上的重力拉力就可能发生焦点漂移。通过仅使用单个目标来记录延时视频，可以在一定程度上减轻这种伪影。此外，明智的做法是确保（如果可能）显微镜配备机械长度较短的精密聚焦系统，并保持聚焦张力控制的正确设置。机械不稳定的其他来源包括调焦架或聚光镜支柱中的松动齿轮组以及辅助部件。
沉浸式媒体波动- 在高分辨率活细胞研究中，用于延时实验的显微镜物镜可能需要由油、水或甘油组成的浸没介质。在收集足够数据所需的较长时间内，成像介质的粘度波动和化学分解会影响浸没介质的特性和扩散。浸油的粘度和折射率通常取决于温度，而且水容易蒸发，必须考虑和监测这些因素以避免焦点漂移。新开发的高性能有机油具有广泛的折射率（包括与水和甘油相同的值），为使用传统浸入介质提供了出色的解决方案。在某些情况下（取决于成像室配置），
添加试剂- 许多研究需要在延时成像序列期间更换培养基或添加化学试剂。将试剂引入培养室的物理行为会产生机械冲击，从而导致焦点漂移，加入与成像介质温度不同的试剂也会产生类似的效果。在加热灌注系统中，新介质或化学品的引入通常会对轴向焦平面产生微不足道的变化，但使用移液管或注射器向开放室中添加液体会干扰聚焦。
横向载物台移动- 在某些情况下，室温波动或振动会产生机械载物台的小的横向 (x-y) 平移，这（在某些情况下）会导致轴向焦点漂移。这通常是一个微不足道的问题，但如果开放的管道直接在显微镜上推动冷或暖空气，则可能会变得严重。如果载物台配备了夹具，则应在开始延时成像之前启用它，否则几乎没有补救措施。使用步进电机的高级显微镜载物台通常不受横向运动伪影的影响。
不安全的标本室- 在延时序列期间标本成像室的移动可能会由于盖玻片的新位置而导致焦点漂移。在将玻璃底培养皿固定在载物台孔中的载物台适配器中，由于夹子弯曲或机械伪影（例如干扰将腔室连接到控制器和其他设备的电线和气/液管），可能会导致培养皿位置发生变化。辅助组件。此外，当单独的盖玻片连接到每个孔时，多孔成像室通常会受到轻微的放置变化，导致扫描板时出现聚焦错误。腔室移动和盖玻片高度不一致是必须定期解决的常见问题。
标本移动- 活细胞成像中不可避免的伪影是标本远离显微镜焦平面的移动。这通常发生在使用正在进行有丝分裂的贴壁细胞收集延时序列时，其中细胞在中期显着改变形状。在其他情况下，标本可以通过从盖玻片上分离或通过运动而完全移出视野。除了使用凝胶和试剂（如纤连蛋白）将细胞和组织固定在盖玻片上之外，没有用于样本移动的机械、化学或电疗法。
多年来，校正焦点漂移的最佳解决方案是在显微镜附近安置一名学生或技术人员，以便在必要时提供手动重新对焦。不幸的是，这是一种成本相对较高且效率低下的解决方案，当然不适合长期成像实验。焦点漂移问题已通过多种途径得到解决，包括软件算法、专用显微镜硬件、防振垫和工作台，以及将显微镜封闭在保护环境中（如图4所示）。这些方法取得了不同程度的成功，但都没有提供可扩展到几乎任何活细胞成像场景的焦点漂移通用解决方案。
热不稳定性可能是焦点漂移的最重要来源，可以通过大型有机玻璃外壳（称为环境室）在很大程度上消除; 图 4(c)) 将显微镜与其外部环境隔离，并为促进对数期细胞生长提供了极好的条件。培养箱式外壳围绕着显微镜载物台、物镜、荧光滤光片和透射光聚光镜，几乎涵盖了整个显微镜和标本。这些腔室可与各种培养容器一起使用，包括标准培养瓶、培养皿、装有盖玻片的显微镜载玻片以及各种开放式和封闭式成像腔室。温度由外部加热单元（通常是强制空气）保持，二氧化碳浓度由与调节器相连的传感单元控制，调节器由一瓶纯气体供给。
环境室还可以配备湿度控制，多种设计提供橡胶手套通道，以避免在成像过程中操作细胞时干扰环境平衡。为了保持高度的温度控制并避免焦点漂移，除了目镜、相机和灯箱外，几个更复杂的培养箱几乎封闭了整个显微镜。不利的一面是，环境室会妨碍快速获取标本，并且在需要重复操作时很麻烦。此外，由于齿轮润滑剂的过早降解以及金属表面和镜片涂层的氧化，腔体内的高湿度水平会增加维护仪器的费用。作为备选，
在过去的几十年里，已经设计了许多软件算法来解决基于对比度或边缘检测的焦点漂移问题。其中许多最终被纳入科学成像软件包，旨在处理图像和控制显微镜。焦点漂移的软件控制要求显微镜配备数码相机和计算机控制下的电动物镜转换器。通常，基于寻焦软件的显微镜需要两种互补的算法来实现焦点控制。第一个建立轴之间的对应关系 ( z) 客观和真实焦点的位置。第二种是搜索算法（图 5），它通过捕获图像来对焦平面进行采样，以确定最大焦点“得分”（最佳位置）的位置。然而，大多数为软件控制焦点开发的算法都是使用具有稳定几何形状的静态样本创建的，并且在延时研究中应用于动态活细胞时效率要低得多。此外，这些算法通常针对特定的照明场景（明场、相衬等）进行优化，并且在应用于非设计的对比度增强技术（例如荧光）时可能会失败。
软件聚焦算法通常依赖于这样一个事实，即聚焦良好的图像比失焦的图像包含更多的对比度或更精细的细节（实际上，频率更高）。例如，当使用拉普拉斯算子估计焦点时，该算法计算样本图像的二阶空间导数，将物镜向上或向下移动预定量，然后重复该过程直到确定最佳拟合。在分析过程中，通常在两个方向上都采取越来越小的步骤。过滤器的高输出值表示强度变化大的区域，这通常表示图像中的边缘。在任何图像中，最高频率分量出现在边缘，并且当样本被最佳聚焦时应该是最突出的特征。随着焦点的漂移，边缘模糊以在整个图像中产生较低的二阶导数。重复采样直到确定最佳拟合。通常这可能需要几分钟，这将软件聚焦例程降级到那些需要在图像捕获之间使用长间隔的延时实验。
在共焦延时显微镜中，无论仪器是否经历轴向漂移，每个图像都保持清晰对焦，可以通过定期从样品中收集一系列z堆栈（光学切片）来完成焦点校正，而不管厚度如何. 然后使用软件分析各个堆栈以确定z 中每个图像之间的 Pearson 相关系数-stack 和在序列开始时记录的参考图像。在分析堆栈后，具有最大像素强度相关系数的图像用于识别正确的焦平面（对应于参考图像的平面）。然后可以使用共定位信息来重置物镜的焦平面。尽管如果软件和硬件接口正确，这种技术应该可以很好地工作，但目前还没有商业应用。
理论上，由于明亮的荧光结构和暗背景之间的对比度极高，因此在荧光标本上使用软件算法应该会产生出色的结果。然而，在实践中，基于软件的补偿技术需要基于荧光物种的几个图像的捕获进行计算，这可能导致光漂白和光毒性效应，随着样品每次暴露于光线下而加剧。此外，无论轴向焦点位置如何（例如共焦、多光子和 DIC），这些算法对于使用产生清晰对焦光学截面的仪器来确定焦点几乎毫无用处。使用软件保持焦点时的另一个陷阱是，算法通常可以确定与延时序列开始时选择的初始平面不同的最佳焦平面。当结合软件焦点确定算法使用荧光时，另一种方法是使用样品的透射光图像执行焦点分析步骤。然而，这需要为荧光和透射光路应用机械快门，这会引入额外的振动。
图6 中说明了两个延时序列，要么没有任何焦点漂移校正（图 6(a)、6(b) 和 6(c)），要么使用基于硬件的焦点维护系统，如下所述（图6(d)、6(e) 和 6(f))。标本为狐肺培养物（FoLuline) 成纤维细胞，表达 mPlum 荧光蛋白和线粒体靶向序列的融合，以产生发出明亮荧光的细胞器。使用共聚焦显微镜在 7 小时内以 30 秒的间隔在荧光和 DIC 模式下操作，收集图像。如果没有自动对焦系统，显微镜会迅速失去焦点，如图 6(b) 和 6(c) 中荧光强度的连续损失所证明的那样，这发生在不到 45 分钟的时间内。相比之下，硬件自动对焦设法为整个调查生成清晰、对焦良好的图像（图 6(d) 到图 6(f)）。
多年来，已经开发了许多旨在补偿焦点漂移的基于硬件的解决方案。在大多数情况下，这些设备会尝试测量物镜与样品架或载物台之间的距离，以便使样品长时间保持聚焦。例如，连接到显微镜物镜转换器的涡流传感器是由一位发明者设计的，用于监控到载物台的距离并使用与聚焦机构耦合的直流电机来校正波动。另一种技术利用样品架和连接到物镜的项圈之间的距离相关电容，以便为支撑样品架的压电元件提供误差信号。三分之一，更复杂的方法依赖于在物镜瞳孔中放置一个全息光栅，以保持标本的焦点。专用光栅产生两个散焦的一阶图像，这些图像由单独的传感器检测以生成焦点校正信号。最后，现代硬件解决方案的先驱在离轴氦氖激光束的背反射中加入了焦点相关的变化，该光束被引导到放置在光学系统中的小棱镜上，并使用双光电二极管阵列进行监控。焦点中的自发漂移被检测为非零差信号，然后用于驱动连接到精细对焦机构的简单电机。尽管这些硬件焦点补偿解决方案在不同程度上取得了成功，但没有一个在商用显微镜系统中发挥作用。专用光栅产生两个散焦的一阶图像，这些图像由单独的传感器检测以生成焦点校正信号。最后，现代硬件解决方案的先驱在离轴氦氖激光束的背反射中加入了焦点相关的变化，该光束被引导到放置在光学系统中的小棱镜上，并使用双光电二极管阵列进行监控。焦点中的自发漂移被检测为非零差信号，然后用于驱动连接到精细对焦机构的简单电机。尽管这些硬件焦点补偿解决方案在不同程度上取得了成功，但没有一个在商用显微镜系统中发挥作用。专用光栅产生两个散焦的一阶图像，这些图像由单独的传感器检测以生成焦点校正信号。最后，现代硬件解决方案的先驱在离轴氦氖激光束的背反射中加入了焦点相关的变化，该光束被引导到放置在光学系统中的小棱镜上，并使用双光电二极管阵列进行监控。焦点中的自发漂移被检测为非零差信号，然后用于驱动连接到精细对焦机构的简单电机。尽管这些硬件焦点补偿解决方案在不同程度上取得了成功，但没有一个在商用显微镜系统中发挥作用。现代硬件解决方案的先驱将离轴氦氖激光束的背反射与焦点相关的变化结合在一起，该光束被引导到放置在光学系统中的小棱镜上，并使用双光电二极管阵列进行监控。焦点中的自发漂移被检测为非零差信号，然后用于驱动连接到精细对焦机构的简单电机。尽管这些硬件焦点补偿解决方案在不同程度上取得了成功，但没有一个在商用显微镜系统中发挥作用。现代硬件解决方案的先驱将离轴氦氖激光束的背反射与焦点相关的变化结合在一起，该光束被引导到放置在光学系统中的小棱镜上，并使用双光电二极管阵列进行监控。焦点中的自发漂移被检测为非零差信号，然后用于驱动连接到精细对焦机构的简单电机。尽管这些硬件焦点补偿解决方案在不同程度上取得了成功，但没有一个在商用显微镜系统中发挥作用。然后用于驱动连接到精细对焦机构的简单电机。尽管这些硬件焦点补偿解决方案在不同程度上取得了成功，但没有一个在商用显微镜系统中发挥作用。然后用于驱动连接到精细对焦机构的简单电机。尽管这些硬件焦点补偿解决方案在不同程度上取得了成功，但没有一个在商用显微镜系统中发挥作用。
作为提高显微镜焦点稳定性的一般方法，制造商已花费大量精力进行工程改进，将焦点漂移降至最低。例如，改进了几个嵌入式机械系统（聚焦组件、快门、电动载物台、转塔旋转）并解决了重物镜的问题。仪器框架现在由抗热膨胀的专用合金制成，而诸如鼻梁之类的辅助部件现在由耐热聚合物制成。这些改进与先进的线性编码器相结合，这是一种电动组件，可以将载物台或物镜转盘重新定位到精确位置，精度优于 50 纳米。
为了解决几乎所有基于盖玻片的成像室中固有的热漂移伪影，显微镜和售后市场制造商最近推出了新的硬件解决方案，通过采用几种不同但仍然密切相关的方法来补偿焦点漂移。需要注意的重要一点是，对于浸入式物镜，这些设备中的大多数基于以下假设运行：被观察的样本与盖玻片的水表面之间的关系是固定的（因此，细胞或薄组织不能自由浮动在培养基中）。相反，细胞或组织（如黑腹果蝇蛋室）要么自然粘附在玻璃上，要么通过层粘连蛋白、纤连蛋白、聚赖氨酸或糖蛋白的薄层附着在盖玻片上。所有市售系统都通过测量弱近红外激光或发光二极管 ( LED ;如图 7 所示）。相比之下，对于干物镜，来自盖玻片下表面（与空气接触）的光反射用于确定样品是否在焦点上。
图 7 中的图示说明了焦点漂移补偿系统如何能够利用来自盖玻片的光反射来测量相对焦点位置。操作员使用标本中的一个感兴趣区域来设置与上盖玻片表面的初始偏移量，从而建立焦平面并作为补偿的基础（图 7（a））。当发生焦点漂移时（此处，由于盖玻片轴向移动更靠近物镜；图 7(b)），检测到的来自盖玻片的激光或二极管反射强度提供了重新定位物镜和恢复目标所需的信息偏移补偿。因此，电动轴向聚焦单元接收来自补偿系统的反馈，以校正盖玻片上检测到的漂移，然后将偏移恢复到预定义的轴向值，为样品提供清晰的焦点（图 7（c）和 7（d））。请注意，样品本身不参与焦点校正，而是由玻璃-水界面处的反射产生的干涉图案控制这些设备。
一种流行的低成本售后商业焦点校正系统通过使用盖玻片的全内反射测量近红外 LED 光源的反射率来运行。这种设计在使用高数值孔径物镜（1.4 或更大）时非常有效，并且可以与聚焦控制电机一起改装到几乎任何显微镜框架。使用全内反射测量焦点的主要限制是对非常高数值孔径的油浸物镜的绝对要求，以实现焦点测量光束的临界入射角。具有更小的数值孔径的干和水浸物镜不适合这种修改，因为物镜数值孔径必须显着高于样品及其周围介质的折射率（对于沐浴在生长中的活细胞，大约为 1.33 至 1.38或成像介质）。因此，虽然适用于大多数高分辨率活细胞成像研究，但该设备不适用于浸水至关重要的场景或涉及多孔板和干物镜的高通量检查。另一种售后产品使用高分辨率传感器（精度为 5 纳米）来测量物镜前透镜和样品之间的间距，以确定焦点。在这个设备中，物镜安装在安装在物镜螺纹和物镜转换器之间的压电纳米定位器中。纳米定位器的运动范围约为 100 微米，足以提供宽广的焦距范围。
在过去的几年里，主要的显微镜制造商已经推出了几种商业焦点漂移补偿设备。所有这些系统都旨在利用活细胞成像室中盖玻片-介质界面的近红外光反射来确定物镜和盖玻片之间的距离，但没有一种系统适用于使用高折射率介质的固定样本（接近 1.5，大多数盖玻片的值）。在操作过程中，来自激光器或 LED 的线形光通过与主显微镜光学系统相交的专用光学系统，并由物镜聚焦在盖玻片和支持观察细胞的培养基之间的界面上。CCD）。软件反馈系统根据CCD捕捉到的反射光的强度和位置，建立玻璃-水界面与物镜焦点之间的关系。
激活焦点校正硬件后，操作员可以引入偏移将物镜焦点移动到标本内的选定区域，同时在界面处保持相同的参考点，从而为距界面特定距离的标本提供清晰的聚焦（见图 7）。因此，偏移值被定义为物镜焦平面与水-玻璃（或玻璃-空气）界面边界之间的距离。根据制造商的不同，这些焦点补偿系统能够监控和校正不同时间尺度的焦点漂移，范围从几毫秒到 10 秒或更长时间。这与基于软件的聚焦补偿例程相比具有明显的优势。此外，在大多数情况下，可以在显微镜控制软件中定义焦点漂移补偿参数，以协调漂移校正与图像采集，
图 8(a) 给出了硬件补偿前后长期焦点漂移的示例。标本是人类癌细胞（HeLa 系）的贴壁培养物，标记有 EGFP 与人类α-微管蛋白。在旋转圆盘共聚焦显微镜的荧光照明下，使用 60x 油浸物镜以 4 分钟的间隔捕获图像，持续 4 小时。细胞被安置在电阻加热室中，其中盖玻片温度由嵌入盖玻片周围金属中的元件保持。显微镜实验室的温度以每小时 1 摄氏度的速度下降。在 240 分钟的时间内，没有硬件补偿，焦平面的轴向位移约为 2.8 微米。相比之下，通过硬件焦点漂移校正，焦平面在同一时间段内保持在大约 200 纳米的精度。图 8(b) 说明了打开平衡到 37 摄氏度的环境室的检修门 1 分钟的效果。请注意由于温度冲击而发生的轴向位移的突然下降（大约 3.4 微米）。
焦点漂移补偿硬件的一个例子是尼康完美对焦系统 ( PFS)，它被集成到 Ti-E 倒置显微镜系列的轴向控制硬件中（如图 9 所示）。各种干式和油浸式物镜，从 4x 到 100x，具有不同的数值孔径，可与 Ti-E-PFS 仪器配合使用以进行聚焦补偿。可用于 PFS 的物镜工作距离范围从 120 微米到超过 15 毫米，具有高度的多功能性。PFS 使用的近红外 870 纳米 LED 和 CCD 线传感器安装在一个专门的物镜转盘单元（图 9）中，该单元不需要无限空间，并使主显微镜光学系统保持专用于成像。尼康 PFS 最先进的功能之一是 5 毫秒 (200 Hz) 采样率，它独立于显微镜和相机控制软件，并且比必须重复探测盖玻片界面和感兴趣的焦平面的其他系统快得多。利用长波长 LED 使 Ti-E-PFS 能够与在 340 到 750 纳米之间的波长范围内发射的荧光团一起使用。此外，PFS 可用于多种对比度增强成像模式，包括明场、相衬、霍夫曼调制对比度、DIC、宽场荧光、共焦、TIRFM、旋转圆盘和线扫描扫场。尼康 PFS 最先进的版本是 利用长波长 LED 使 Ti-E-PFS 能够与在 340 到 750 纳米之间的波长范围内发射的荧光团一起使用。此外，PFS 可用于多种对比度增强成像模式，包括明场、相衬、霍夫曼调制对比度、DIC、宽场荧光、共焦、TIRFM、旋转圆盘和线扫描扫场。尼康 PFS 最先进的版本是 利用长波长 LED 使 Ti-E-PFS 能够与在 340 到 750 纳米之间的波长范围内发射的荧光团一起使用。此外，PFS 可用于多种对比度增强成像模式，包括明场、相衬、霍夫曼调制对比度、DIC、宽场荧光、共焦、TIRFM、旋转圆盘和线扫描扫场。尼康 PFS 最先进的版本是适用于 Ti2-E 倒置显微镜的完美对焦系统 4。
上述焦点漂移校正系统主要用于对安装在配备厚度从 150 到 180 微米（#1 或 #1.5 盖玻片）的盖玻片的专门成像室中的活细胞进行成像。由于红外反射率较弱或散射光过多，其他样品可能更难以观察到焦点漂移校正。这些包括安装在高折射率介质中的固定样本（与盖玻片更接近）。在这种情况下，来自焦点监控系统的反射光量可能不足以检测界面表面。同样，散射大量光的厚组织标本很难与焦点漂移校正一起使用。也不推荐使用厚玻璃盖玻片（大于 180 微米）或塑料组织培养皿，因为由于偏移不足，可能无法检测到边界表面。最后，盖玻片表面的灰尘和碎屑会降低边界检测的精度，导致过度狩猎或焦点校正错误。
尽管当前可用的焦点漂移校正系统旨在测量盖玻片界面的反射率，但从一种设计到另一种设计的许多变化为进行长期延时成像的研究人员提供了多种选择和潜在的陷阱。主要兴趣是商业系统之间价格的巨大差异，这使研究人员在某些情况下能够选择更符合预算而不是实际活细胞成像需求的解决方案。如上所述，一些售后市场制造商提供了辅助焦点校正装置，可以对其进行改装以用于现有的电动（或非电动）显微镜。相比之下，显微镜制造商提供的更精致的交钥匙系统完全集成到他们的倒置框架中，因此不需要修改显微镜或使用光学端口进行安装。所有焦点校正系统都能够在不同的横向和轴向位置对多个特征进行成像（实际上，对于在每个时间点捕获的每个视场）。
评估商用焦点漂移校正系统时的一个主要考虑因素是反馈回路监控和调整焦点的频率。尼康 PFS 系统提供连续主动机制，独立于显微镜和相机控制软件运行，而其他系统则在拍摄每张图像之前立即进行焦点检测和校正过程。每种方法都有优点和缺点。例如，如果实验涉及实时图像捕捉，那么采用连续进给机制的尼康 PFS 系统可能更有用，因为它可以独立于软件调用来校正漂移。然而，对于长时间间歇性地捕捉图像是关键考虑因素的实验，在每次图像捕捉之前评估焦点的较慢系统可能就足够了。一般来说，选择聚焦补偿系统的主要考虑因素是图像的拍摄速度。较快的系统在以较长的时间间隔捕获图像时表现良好，而较慢的系统对于以短于 3 到 5 秒的间隔进行图像捕获的用处不大。
在典型的延时场景中，图像捕获之间发生显着延迟，测量反射率然后偏移到盖玻片上方特定轴向位置所需的短间隔是无关紧要的。然而，当以每秒 30 帧或更多帧的速度快速采集图像流时，最快的补偿系统将显示出卓越的性能。然而，应该注意的是，根据设计，连续反馈系统可能无法在每次曝光之间完成补偿步骤，因此可能会在系统仍在寻找参考平面时捕获图像。在这种情况下，生成的视频通常会出现抖动播放时出现伪影（沿横轴之一的不可预测的像素偏移，每隔几帧间歇性发生一次）。在连续和捕获驱动的聚焦补偿系统之间进行选择时应考虑的另一个变量是总实验时间。延时实验的长度可以从几秒到几小时甚至几天不等。对于持续数小时或数天的实验，依赖压电执行器的连续反馈系统可能会因滞后或蠕变而出现机械漂移或定位不一致。在短期实验中，这些工件的影响通常可以忽略不计，但在长时间的采集中，它们的贡献可能很大。
总之，解决焦点漂移问题可能是近代以来活细胞成像领域最重要的进步。在为延时成像设计的实验系统的配置过程中，必须始终解决这种伪影问题，并且在使用高数值孔径物镜时更明显，在这种情况下，窄焦深很容易随着最轻微的振动或温度变化而发生变化。在每个时间间隔对单个样本内的横向和轴向位置的复杂序列进行成像时，焦点漂移也是要消除的关键因素（以及相当大的挑战）。在大多数情况下，显微镜制造商提供的新焦点漂移补偿系统能够提供出色的校正，尽管速度不同。然而，无论仪器的复杂程度如何，在对活细胞进行延时实验时，都必须密切注意上面列出的漂移因素，包括热环境、样品成像室、振动、浸没介质和机械稳定性。一旦所有的基本细节都得到解决，谨慎的调查人员应该会得到出色的结果。
