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自 17 世纪荷兰发明家 Antoni van Leeuwenhoek 和英国科学家 Robert Hooke 首次分别报道使用单镜头和复式显微镜进行观察以来，光学显微镜在帮助解开复杂的生物学奥秘方面发挥了核心作用。在过去的三个世纪中，大量的技术发展和制造突破导致显着先进的显微镜设计具有显着提高的图像质量和最小的像差。然而，尽管用于制造现代镜片组件的计算机辅助光学设计和自动研磨方法，基于玻璃的显微镜仍然受到光学分辨率的最终限制的阻碍，这是由可见光波前在穿过物镜后焦平面的圆形孔径时的衍射所施加的。因此，使用光学显微镜可获得的最高点对点分辨率受一组基本物理定律的支配，这些物理定律无法通过物镜或光圈设计的合理变化轻易克服。这些分辨率限制通常被称为衍射屏障，它限制了光学仪器区分横向距离小于用于对样品成像的光波长的大约一半的两个物体的能力。
衍射过程涉及光波与构成典型样本的复杂结构相互作用时的传播。由于在显微镜中观察到的大多数标本都由高度重叠的特征组成，这些特征最好由多点光源表示，显微镜衍射屏障的讨论集中在描述代表单点光源的波前通过各种光学元件和孔径光阑。正如下面将要讨论的，从显微镜样品平面中的一个点发出的透射光或荧光发射波前在物镜孔径的边缘发生衍射，有效地扩展波前以产生点源的图像，该图像被扩展为具有有限但比原始点更大尺寸的中心圆盘的衍射图案。因此，由于光的衍射，样品的图像永远不会完美地代表样品中存在的真实细节，因为存在一个下限，低于该下限显微镜光学系统无法解析结构细节。
除了在光学仪器中随着发散光波发生衍射现象，干涉的过程描述了两个或多个叠加波前的重组和求和。光的干涉可能是光学显微镜中最普遍的现象，在图像形成的各个方面都起着核心作用。在荧光或激光扫描共聚焦显微镜中，物镜的作用是将激发光聚焦到一个焦点上，以确保聚焦波前在样品平面上的相长干涉。根据这一要求，相长干涉（下文讨论）可确保从所有可用物镜孔径角入射的波前电场矢量处于同一相位，因此产生尽可能小的激发点。
干涉和衍射实际上是同一过程的表现，负责在显微镜的中间图像平面上创建样品的真实图像。简言之，两个波前之间的干扰随着加入发生，如果波是完全同相（向的振幅加倍建设性干扰），但波完全彼此抵消时出180度相位（称为破坏性干涉; 然而，大多数干扰发生在两者之间）。当两个光波干涉时，光波中固有的光子能量本身不会加倍或湮灭；相反，这种能量在衍射和干涉期间被引导到允许相长干涉的方向。因此，干涉和衍射应被视为涉及光波和光子能量重新分布的现象。
显微镜中的点物体，例如荧光蛋白单分子，在中间平面生成图像，该图像由干涉作用产生的衍射图案组成。当高度放大时，观察到点物体的衍射图案由被一系列衍射环包围的中心点（衍射盘）组成（见图1）。在与衍射理论相关的命名法中，明亮的中心区域被称为零级衍射斑，而这些环被称为一级、二级、三级等衍射环。当显微镜正确聚焦时，环之间最小值处的光强度为零。结合起来，这种点源衍射图被称为艾里圆盘（以 19 世纪英国天文学家 George B. Airy 爵士的名字命名）。艾里斑中心光斑的大小与光的波长和物镜的孔径角有关。对于显微镜物镜，孔径角由数值孔径 ( NA ) 描述，其中包括术语sin θ，即物镜可以从样品收集光的半角。在分辨率方面，横向（x , y）像平面中衍射艾里斑的半径由以下公式定义：
阿贝分辨率x,y = λ/2NA
其中λ是透射光中的平均照明波长或荧光中的激发波长带。物镜数值孔径 (NA = n•sin(θ)) 定义为成像介质的折射率 ( n；通常是空气、水、甘油或油) 乘以孔径角的正弦 ( sin(θ)）。由于这种关系，点光源产生的光斑尺寸随着波长的减少和数值孔径的增加而减小，但始终保持一个有限直径的圆盘。因此，数值孔径为 0.90 的 100 倍放大物镜在绿光（550 纳米）下产生的图像光斑尺寸约为 30 微米，而数值孔径为 1.4 的 100 倍物镜产生的光斑尺寸约为 200 纳米，几乎为 50小了一个百分点。衍射极限分辨率理论由德国物理学家 Ernst Abbe 在 1873 年提出（见方程（1）），后来由瑞利勋爵于 1896 年完善（方程（3）) 量化两个艾里模式之间必要的分离度量，以便将它们区分为单独的实体。
阿贝分辨率z = 2λ/NA 2
根据阿贝理论，图像由一系列具有不同强度的衍射极限点组成，这些点重叠以产生最终结果，如上所述。因此，优化空间分辨率和图像对比度的唯一机制是通过降低成像波长、增加数值孔径或使用具有更大折射率的成像介质来最小化衍射极限点的尺寸。然而，在具有最强大物镜的理想条件下，横向分辨率仍被限制在接近 200 到 250 纳米的相对适中的水平（见等式 (1)) 由于玻璃在 400 纳米以下波长的透射特性和数值孔径的物理限制。相比之下，艾里斑的轴向尺寸形成椭圆图案，通常称为点扩散函数 ( PSF )。沿光轴的点扩展函数的细长几何形状源于显微镜物镜出现的非对称波前的性质。光学显微镜中的轴向分辨率甚至比横向分辨率差（如等式 (2) 所示）)，大约为 500 纳米。当试图对高度复杂的特征（如细胞器）进行成像时，衍射极限分辨率表现为轴向切片能力差和成像平面对比度降低。此外，在三维标本中实现的整体标本对比度通常由相对较差的轴向分辨率主导，这种分辨率是由于离焦光与点扩散函数的干扰而发生的。
在示出的图1是物镜孔径角对在典型的光学显微镜产生的衍射点的尺寸的效果。对于具有大（图 1（a））和小（图1（b））数值孔径的物镜，图示了波前会聚并经历相长干涉的图像平面中的点源及其共轭 (P) 。点P1在焦平面中横向移动，直到某个距离处的相消干涉（由物镜数值孔径决定）定义了第一个衍射最小值的位置，从而定义了衍射点的半径。对于图 1(a) 中的高分辨率配置，点A和波前的B产生较小的光斑尺寸，10 个任意单位定义成像光斑尺寸。相比之下，对于图 1(b) 中呈现的较低分辨率配置，减小的孔径角增加了A和B之间的距离到 18 个任意单位。换句话说，荧光团（点光源）发出的光被物镜聚焦在图像平面上，其中传播相同距离的波前同相到达图像平面并相长干涉以产生具有高强度的光斑。导致零强度的破坏性干涉是由异相到达二分之一波长的波前产生的（参见上面的讨论）。因为强度沿着光斑的横轴逐渐下降，所以比光斑尺寸更靠近的两个点源（或荧光分子）看起来像是一个更大的光斑并且无法分辨。
如上所述，艾里斑在三个维度上的强度分布被称为点扩散函数，它完整地描述了一个点光源（如单个荧光团）在横向（x , y）中的衍射图案和轴向 ( z) 尺寸由衍射极限光学显微镜修改。点扩散函数的大小由成像光的波长和物镜的特性（数值孔径）和成像介质的折射率决定。在实际意义上，分辨率通常被定义为两个点状物体之间的最小间隔距离，在该距离中它们仍然可以区分为单独的发射器（而不是合并成一个点）。因此，大多数分辨率标准（例如，瑞利标准、Sparrow 极限或半高全宽；FWHM）与点扩展函数的属性和几何形状直接相关。
瑞利分辨率x,y = 0.61λ/NA
根据瑞利准则，当主衍射最大值（艾里斑的中心点；见图 2) 来自一个点源与来自另一个点源的艾里斑的第一个最小值（围绕中心点的暗区域）重叠。如果两个艾里斑或点扩散函数之间的距离大于该值，则认为两个点源已解析（并且可以很容易地区分）。否则，艾里斑合并在一起，视为未解析。换句话说，当两个相距很近的点源的图像之间的距离大约等于点扩散函数的宽度时，瑞利准则就满足了。相比之下，Sparrow 分辨率限制被定义为两个点源之间的距离，其中图像的中心峰值之间的亮度不再下降，而是在峰之间的区域表现出恒定的亮度。Sparrow 分辨率限制更接近阿贝值，大约三分之二 (瑞利分辨率极限的方程 (4) )。
麻雀分辨率x,y = 0.47λ/NA
示于图2是瑞利准则的两个紧密定位点源二者的横向和轴向尺寸的图形表示。在图 2(a) 中，点光源的强度由蓝色实线和黄色虚线表示。由组合点源产生的总强度由红色曲线表示，为清晰起见，该曲线沿纵坐标移动。为了区分这些点源，峰值之间的距离应该足以产生一个介于峰值强度 20% 到 30% 之间的强度最小值（图 2（a））。相同的标准适用于轴向尺寸（图 2(b)）。请注意，分辨率（在图 2(a) 和 2(b) 中沿横坐标表示）沿z轴显着降低。
尽管瑞利准则和类似的度量是用于观察样本的有用分辨率规，但这种分辨率定义仍然存在一些缺点。例如，在研究人员意识到两个粒子合并形成一个单点图像的情况下，可以应用计算机算法来区分任意更小的距离的粒子。确定两个相邻粒子的确切位置然后成为由光子统计决定而不是由瑞利极限描述的实验精度问题。此外，分辨率限制不一定对应于可以在图像中观察到的细节水平。虽然瑞利极限被定义为到点扩展函数的第一个最小值的中心的距离，这个值可以通过先进的光学系统或线性光学系统变得更小。分辨率标准也不依赖于这样一个事实，即光是一种衍射波前，它对波中实际包含的细节水平构成了有限的限制。
分辨率的阿贝方程避免了瑞利准则和斯帕罗极限的缺点，但具有更间接的解释。在显微镜中对样品进行成像的过程可以通过照明和荧光发射（或透射光）点扩散函数之间的卷积运算来描述。进行傅立叶变换后（见图3)，在显微镜下观察到的物体（无论它们是否是周期性的）可以被独特地描述为具有不同空间频率的众多正弦曲线的总和。请注意，存在于所有共轭图像平面中的样本图像作为傅立叶变换存在于相应的孔径平面中，其中较高的频率代表精细的样本细节，而较低的频率代表粗略的细节（图 3（a））。这一点用图 3(b )中物镜后孔径的波形来说明。较低的空间频率位于孔径中心附近，而对于接近孔径边缘的区域，频率逐渐增加。
通过检查傅立叶空间中的等效运算，可以很容易地简化实际空间中卷积的概念。在后者中，变换后的对象可以与点扩展函数的傅立叶变换相乘，以产生没有噪声的理想图像的傅立叶变换。傅里叶变换后，点扩散函数描述了样本的每个空间频率转移到最终图像的效率。因此，傅里叶变换的点扩展函数被称为光学传递函数 ( OTF；见图 3(b)）。OTF 定义了包含样本信息的空间频率在成像过程中丢失、保留、衰减或相移的程度。在成像过程中丢失的空间频率信息无法恢复，因此所有形式的显微镜的主要目标之一是为样本获取尽可能高的频率范围。每个空间频率下的 OTF 值（以每米的振荡为单位）是描述特定正弦对象特征在最终图像中实现的对比度的有用指标。
关于光学显微镜要记住的重要点之一是检测光学传递函数具有用作分辨率“截止”边界的特征频率（阿贝极限频率；参见图 3(b)）。显微镜记录的图像中不存在高于极限值的频率。能够通过物镜的最高空间频率的峰峰值距离（图 3(a) 中绿色波形的值d ）) 因此通常被称为阿贝极限，它更正式地定义为结构中可以在最终图像中检测到的最小周期性。由于点源发射或传输的空间频率范围很广，因此在跨越三个维度的点扩展函数中也必须存在阿贝极限。
传统的宽场显微镜通过捕获物镜中不同位置的光并在穿过光学系统时进一步处理波前以最终在图像平面上干涉来生成点光源的图像。由于光学中的互易原理，显微镜横轴上的阿贝极限对应于通过以物镜捕获的最极端角度干涉两个波可以获得的最大到最大距离。阿贝分辨率极限很有吸引力，因为它仅取决于离开样品并被物镜捕获的不同波前之间的最大相对角度。因此，此限制描述了可能成像的最小细节级别，
即使在光学显微镜配备了最高质量的镜头元件、完美对齐并具有最高数值孔径的情况下，在最佳情况下，分辨率仍然限制在大约光波长的一半。在实践中，通常在常规成像中实现的分辨率通常不会达到衍射所施加的物理限制。这是因为试样中的光学不均匀性会扭曲激发光束的相位，导致焦体积明显大于衍射限制的想法。此外，分辨率也可能因使用不兼容的浸油、厚度超出最佳范围的盖玻片以及未正确调整的校正环而受到影响。
激光扫描共聚焦和多光子显微镜已被广泛用于适度提高横向和轴向的空间分辨率，但这些技术在实现实质性改进方面仍然有限。聚焦激光激发与共聚焦显微镜中的针孔限制检测相结合，原则上可以将空间分辨率提高 1.4 倍，尽管这只是在信噪比方面付出了巨大的代价。同样，多光子荧光显微镜利用非线性吸收过程来减小激发点扩展函数的有效大小。然而，更小、更精细的点扩散函数再次被使用更长波长激发光的必要性抵消了。结果，而不是提供分辨率的显着改进，
然而，通过利用法律中的“漏洞”，可以超过管理光学显微镜的物理定律强加的分辨率限制，该漏洞强调限制仅在某些假设下才是正确的事实。利用这些“漏洞”的技术被称为超分辨率显微镜，许多主要制造商现在提供各种类型的超分辨率显微镜。
