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我们大家都非常熟悉的明星在一个漆黑的夜晚的外观和知名度，这尽管从地球的巨大距离。 明星可以在晚上，主要是因为他们的微弱的光线和黑色的天空形成鲜明的对比很容易观察到。
然而，星光闪烁，无论白天和黑夜，但他们是在白天看不见，因为太阳的亮度铺天盖地“消灭了”从星星微弱的光线，使他们看不到的。 在日全食时，地球和太阳挡住了太阳的光与恒星之间的月亮移动现在可以看到，即使是白天。 总之，微星光的能见度极大地提高黑暗背景。
这个原理在暗场（也称为暗视场）显微术，用于使未染色透明标本清晰可见的简单和常用的方法施加。这种物体通常具有折射率非常接近的值，他们周围的环境，难以在常规明显微镜图像。 例如，许多小的水生生物的折射率范围从1.2到1.4，导致从周围的水介质中的可忽略的光学差别。 这些是暗场照明的理想人选。
暗场照明需要阻断哪些通常穿过和围绕（周边）的检体的中心的光的，只允许斜光线从每一个方位角为“击”检体安装在显微镜载片上。 一个简单的阿贝暗视场聚光镜的顶部透镜是凹球面状，允许光线从在所有方位角的表面出现以形成光的倒置空心锥体与在试样平面为中心的顶点。 如果没有样品存在和聚光镜的数值孔径比物镜越大，倾斜射线交叉并且所有这些光线将错过进入，因为它们的倾斜的物镜。 视场会出现暗。
在图1所示的暗视场聚光镜/物镜对是表示在其最尖端的配置，这将在下面详细讨论的暗视野显微镜的高数值孔径的安排。 物镜包含一个内部可变光阑，其用于将物镜的数值孔径减小到低于由聚光发射的倒置中空光锥体的值。 心型聚光镜是反映暗场设计，依靠内部的反射镜将光线投射的无畸变锥入试样平面。
当检体放置在滑板，特别是未染色的，非光吸收试样，倾斜光线穿过样品和被衍射，反射，和/或通过光学不连续性（如细胞膜，细胞核和内部细胞器折射）允许这些微弱的光线进入物镜。 然后，标本可以看到明亮的上，否则黑色的背景。 在傅立叶光学方面，暗场照明将删除在物镜的后焦平面形成的衍射图案的零阶（未散射光）。 这导致只从由试样散射高阶衍射强度形成的图像。
图2中的显微照片示出了暗场和明场照明在硅胶骨架的从在一个整装样品小海洋原生动物（放射）的影响。 在普通的明，放射虫的骨骼特征没有明确定义，而且往往在任何传统胶片或数字捕获显微照片记录被淘汰。 在图2（a）的显微照片拍摄于明照明与聚光镜孔径光阑闭合至的点衍射工件掩盖一些样品细节。 这增强了在图像失真为代价标本对比度。 下暗场照明（图2（b）），更详细地存在时，尤其是在生物体的上部，并且图像获取的表观三维外观。 当红色滤光片是与一个暗场停止（图2的（c））一起使用时，放射呈现出多彩的外观是更令人愉快，虽然没有额外的细节产生和存在即使在图像质量有所下降。
具有光滑的反射面试样产生由于图像，部分地光的反射到物镜。 在那里的折射率与周围介质或在那里发生的折射率的梯度（如在膜的边缘）不同的情况，光被样品折射 。 反射和折射的两个实例产生的光的方向相对较小的角度变化，使一些进入的物镜。 与此相反，一些光撞击标本也衍射 ，产生的光的180度圆弧穿过物镜的整个数值孔径范围通过。 物镜的分辨能力是在暗场照明同一明的条件下观察到的，但该图象的光字符不是作为忠实再现（当一个特别设计的光圈被利用来降低有效数值孔径与高除专门为暗视野显微镜放大设计的油浸物镜）。
如在上述星光的例子中，可见性在很大程度上受明媚试样和暗环绕之间的对比度提高。 如上所述，发生了什么事在暗场照明是所有零阶的普通非偏移光线被封锁的不透明光圈。 倾斜射线，现在由试样衍射并产生第一，第二，和在物镜的后焦平面更高衍射级，则继续到成像面，他们彼此干扰，以产生检体的图像。
对于暗场照明的理想候选包括分钟活的水生生物，硅藻，小昆虫，骨，纤维，头发，未染色的细菌，酵母，在组织培养细胞和原生动物。 非生物样品包括矿物和化学晶体，胶体颗粒，灰尘计数试样和聚合物的薄切片和陶瓷含有小的夹杂物，气孔的差异，或折射率梯度。 护理应制备试样时为暗视场显微术，因为位于聚焦平面的上方和下方的功能也可以通过散射光，并有助于图像劣化作出。 试样厚度和显微镜载玻片的厚度也很重要，并且在一般情况下，薄的样品是期望消除衍射伪像可以与图像形成干扰的可能性。
在图3所示的台下聚光镜上演示光通路不透明停止通过简单的折射聚光效果。 在左侧（图3的（a）），是定位成打开以最大化光锥的数值孔径的孔径光阑的典型阿贝明聚光镜。 来自光源的光穿过孔径光圈，然后通过几个透镜元件的折射以形成光的倒锥具有大约1.20的数值孔径。 当不透明蜘蛛式光停止（如图3（b））插入到完全打开孔径光圈以下时，中央光线被阻挡，只允许外围光线穿过透镜以形成光的倒斜中空锥形在数值孔径（1.20）没有变化。 照明中空光锥通过光的折射的透镜元件，其中，光学校正常常是最差的周边形成。 即便如此，该聚光镜将执行充分使用低倍率的物镜，并产生了质的暗场的工作很不错的结果。 对于更严格的定量显微术，它是必要使用消球差聚光镜（用于色差和球面像差修正），它执行由更清晰细节和更可靠的功能产生图象好得多。
在暗视野显微镜下，如果你看看物镜通过伯特兰透镜或相望远镜背后，似乎充满了光。 在与黑色背景上的其对比度颠倒，明亮的图像的目镜膜片的平面这微弱的衍射光重新构建成可视图像。 由于暗视野显微镜消除了明亮的光线非偏移，这种形式的照明是非常浪费的光，因此需要高强度照明光源。 显微镜载玻片必须是适当的厚度，大约1毫米+/- 0.1毫米。 标本幻灯片和在光路径中的所有光学表面必须一尘不染，因为每一粒灰尘会毫不留情地亮。
有几件被用于生产的暗场照明设备。 最简单的是台下聚光镜的“蜘蛛停车”只是底部透镜之下（在前焦面）（图3（b）和图4（a））。 光圈和视场光阑都睁大通过斜射线。 中央不透明光圈（你可以做一个通过安装透明玻璃盘上硬币）块把中央的光线。 此设备工作相当良好，即使与阿贝聚光镜（图3），用10倍的物镜到具有数值孔径不大于0.65更高40倍或更高的物镜。 不透明光阑的直径应为数值孔径0.25到大约20-24毫米的10倍的物镜为20倍大约16-18毫米，并且接近0.65数值孔径的40倍的物镜。
该组中的图4所示停止（a）的大小为8毫米至30毫米变化，并且几乎任何数值孔径物镜提供优异的暗视野不透明停止（下面0.65）。 个人站可以简单地通过在支撑蜘蛛的底部除去螺钉并用新的尺寸更换的停止互换。 蜘蛛夹持器的外尺寸将取决于壳体开口直径在聚光镜的底部而改变。
图4中的光停止（b）所示的是膨胀和收缩“反向虹膜”振膜以增加或减少使用杠杆控制臂的停止的大小的巧妙设备。 作为此控制杆转动时，中央的尺寸留下约10毫米至25毫米直径的变化，从而为较高倍率的物镜较大站。这种类型的可变轻停止隔膜的无需用于改变光每一个更高的倍率物镜被插入到光路中时停止。 它也有被“调谐”为在必要同时观察试样，以达到最佳性能的视场直径略有不同的附加的优点。 虽然这些类型的膜片光站的现在是非常罕见的，但它们提供实现与暗场照明高度期望效果的唯一方法。
几乎所有的明场实验室显微镜可以很容易地转换为与暗场照明。 如上所述，中央遮光站可以从一个小的硬币，纸板，塑料，或黑纸可以放置在过滤器载体聚光镜下方（或贴在聚光镜底部用胶带）被塑造到进入阻挡光物镜的镜头前。 不透明光阑的直径将从物镜变化到物镜，并应通过放置一个透明直尺在台下过滤载体和保持其稳定对聚光镜的底部进行仔细测量。 接着，通过除去一个目镜和使用相望远镜观察在物镜的后焦平面标尺的图像（或者通过插入一个伯特兰透镜）确定的开口尺寸。 请确保无论是台下聚光器光圈和视场光阑正在执行这个动作之前，打开其最宽位置。 在后焦面可见标尺分割数将等于必要从进入物镜方框零阶光的停止的大小。 更改为下一个最大尺寸物镜，进行另一次测量，直到重复所有物镜停止尺寸是已知的。
近似不透明光圈大小与倍率的导向于表1中的实际尺寸会有所不同，这取决于几个因素，包括停止相对于聚光镜孔径光阑，物镜和聚光镜的数值孔径时，在接近给定像差校正的聚光镜，和目镜的场号的程度。 另外，在确定的视场尺寸重要的是聚光镜的直径后透镜，目镜的放大倍数（较小放大率需要稍大站），和安装介质的类型。 停止大小成比例地变化到安装介质的折射率：更高的折射率需要较大的视场。 干安装也将需要比的含水悬浮较小的光阑。
| 放大倍数 | 数值孔径 | 视场尺寸（mm） |
|---|---|---|
| 1X | 0.03 | 25-30 |
| 2X | 0.05 | 8-11 |
| 4X | 0.10 | 8-14 |
| 10X | 0.25 | 16-18 |
| 20X | 0.40 | 18-20 |
| 20X | 0.65 | 20-22 |
| 40X | 0.65 | 22-24 |
用剪刀或（最好）黄铜打孔器切一组匹配到所有的物镜止损，并把它们粘到醋酸明确或玻璃的一个坚固的片材。 乙酸盐或玻璃基板应该很容易安装到台下聚光器的下侧，或者通过过滤器保持器或通过其他手段，如粘接带。 停止的取向可通过观察其通过伯特兰透镜或取出目镜和观看通过相望远镜同时调整聚光镜定心螺钉来完成。
暗视野显微镜在高放大倍率
对于更精确的工作和黑的背景，你可以选择特别是对暗场设计了一个聚光镜，即只传送斜射线。 种类有：“干”与聚光镜的顶部和所述滑动件的底面之间的空气暗场聚光镜 - 并且需要使用浸油的一滴浸没暗场聚光镜（一些被设计为使用水代替）建立聚光镜的顶部和试样滑动的底面之间的接触。 浸没暗场聚光镜内部镜面上，并将大倾角和免费色差的光线，产生最好的结果和最黑暗的背景。
也许是最广泛使用的暗视场聚光镜是抛物面，包括一个固体片的玻璃地非常精确地成抛物面的形状，如图5（b）所示。 于反射面的入射光（图5中的玻璃和聚光镜壳体之间（b））的一个抛物面聚光器的将被聚焦在反射镜的焦点处。 最抛物面聚光镜被切断，以确保焦点略微超出所述聚光镜的顶部，使平行光线将在最大化试样照射的位置进行聚焦。 在玻璃聚光镜底部的光停止用来从到达试样方框中央光线。 由所述聚光镜的反射光线被比反射的临界角倾斜更高和在聚光镜的主要焦点会聚。 载玻片，安装介质，和浸油（聚光镜与显微镜载玻片之间）的组合完成抛物面形状的光学均匀性。
如上所述，干暗视场聚光为下面数值孔径物镜有用0.75（如图5（a）），而抛物面和心浸液聚光镜（图1和图5（b））能够以非常高的数值的物镜使用孔（高达1.4）。 具有高于1.2的数值孔径物镜将需要一些减少他们的工作的孔的，因为它们的最大数值孔径可能超过聚光镜的数值孔径，从而允许直接光入射到物镜。 由于这个原因，设计为与暗场用途以及明照明许多高数值孔径物镜被与作为孔径光阑内置可调光阑制成。 这种减少在数值孔径也限制了物镜的分辨能力，以及光的图像中的亮度。 专为暗视场工作专门物镜产生具有最大数值孔径接近暗视场聚光的数值孔径的下限。 它们不具有内部光阑，但是镜头座直径被调整的至少一个内部透镜具有的最佳直径来执行作为孔径光阑。
表2列出了最常见的反射高数值孔径暗场聚光镜的几个特性。 这个表应当为具有高数值孔径的暗场应用选择聚光镜/物镜组合时，可以使用作为指导。
| 聚光镜类型 | 空心锥形 数值孔径 | 最大物镜 数值孔径 | 反射面 | 光学校正 |
|---|---|---|---|---|
| 抛物面 | 1.00-1.40 | 0.85 | 1抛物线 | 消色差 |
| 心形 | 1.20-1.30 | 1.05 | 1 球形 1 心形 | 消色差/ 消球差 |
| 双中心式 | 1.20-1.30 | 1.05 | 1 心形 1 球型 | 消球差 |
| 双中心式 | 1.20-1.30 | 1.05 | 2球型 | 消球差 |
| 卡塞格林式 | 1.40-1.50 | 1.30 | 1非球面 1 球型 | 消球差 |
| 视场环 （双中心） | 1.40-1.50 | 1.30 | 2 球型 | 消球差 |
| 纳尔逊 卡塞格林 | 1.30-1.45 | 1.20 | 1非球面 1 球型 | 消球差 |
在图5所示的聚光镜是特别设计以产生用于暗场照明高数值孔径的斜中空光锥。 在这两种情况下，在聚光镜的上表面是平的并垂直于显微镜的光轴。 左侧的聚光镜（图5的（a））被设计为可以使用“ 干 ”与聚光镜和显微镜载玻片的下侧之间没有油。 与此相反，在图5（b）该抛物面聚光旨在是“ 油污 ”到显微镜载玻片的底部，试样直接下方。 浸油的遗漏时使用该聚光镜（或任何表2中列出的其他聚光镜）将从到达试样排除任何光线。由这些电容器所发出的光线斜向中空锥形不能从顶端透镜无油出现，将被完全反射回到聚光镜中。 从照明光源发射的光被反射在聚光镜的内部镜像玻璃表面，并退出聚光镜的顶部以倾斜的比在其中发生全反射光的通路的临界角（约41度）高得多的角度从玻璃到空气中。 在涂油抛物面聚光器（图5（b）和表2的聚光镜），其中所述聚光镜的玻璃的折射率，浸油和载玻片相等的情况下，从聚光镜发射的光穿过由无折射试样玻璃 - 空气接口。
反射表2中所列的高数值孔径聚光镜涵盖广泛用于生产所必需的高倍率暗场显微镜的光的倾斜空心锥形设计。抛物面暗视场聚光已在上面详细讨论过。 另一个非常有用的设计是在图1所示的心形电容此聚光镜设计采用在于既作为光站和一个反射器，以直接光到成形为类似于一个第二反射面聚光的中心的镜像半球革命的心形，从该聚光镜而得名。 球形和心形反射表面的组合产生的聚光镜是昏迷和两个球差和色差自由。 有几种技术缺陷使用这种高数值孔径的聚光镜。 该心形电容是对准非常敏感，必须谨慎地利用光照的非常尖锐的锥形的优势，使之成为最困难的暗视场聚光使用。 另外，在聚光镜产生的眩光的一个显著量，甚至是从最微小的灰尘颗粒，和短焦距可能会导致照明差的大小超过或厚度为几微米的物体。 当选择定量高倍率镜暗视野显微镜载玻片，使一定要选择从玻璃的混合物，是免费的荧光杂质制成幻灯片。
高数值孔径反射聚光镜（图1，图5，图6和表2）与暗场照明观察和拍摄非常小的颗粒或胶体悬浮液的集合提供选择的方法中，即使当颗粒直径大于分辨率的极限显著低为物镜。 这是由于由粒子衍射光，穿过物镜及变得明亮衍射磁盘可见。 每个粒子是作为一分钟衍射磁盘可见，提供相邻颗粒之间的横向距离比解决物镜的倍率的上限。 作为照明强度增加，分钟衍射颗粒和它们的背景的增加之间的光学差异。 同时，甚至更小的颗粒（其散射光的能力仅可检测）现在衍射足够的光成为可见并悬浮颗粒即使当它们的直径是小于40纳米，这是大约五分之一的200纳米分辨率极限与可见最高的数值孔径的油浸物镜。 在生物应用中，活细菌鞭毛的，在直径平均约为20纳米的运动可以观察（太小，在明或DIC照明中可以看出），并使用高数值孔径暗场聚光镜拍照。
小心应注意到注油高数值孔径聚光镜样品载玻片的底部的细节。 它是非常困难的，以避免引入微小气泡进入聚光镜顶部透镜和显微镜载玻片的底部之间的区域，并且该技术应实行完美。 气泡会导致图像眩光和失真，导致对比度和整体图像劣化的损失。 使用显微镜载玻片这是不是太粗或太细的问题时，也遇到过。 许多暗场聚光镜包含直接在聚光镜装入刻可用滑动厚度的范围内。 如果滑动太厚，往往难以对焦聚光镜不诉诸较高粘度浸油。 另一方面，幻灯片过于薄必须打破聚光镜和滑动之间的油键的倾向。 它是购买正确的厚度的精度显微镜载玻片，以避免任何的上述问题是个好主意。
当使用高数值孔径暗视场聚光镜被成像浸没在水性介质中的标本的唯一的情况出现。 在这些条件下的水溶液的折射率限制倾斜下的光可以从显微镜载玻片（N = 1.515）到围绕样品的水（N = 1.336）通过的角度。 从玻璃透光与水的最大数值孔径由下式给出：
NA（照度）= 1.555 × sin(i) = 1.336 × sin(90°)
因为sin(90°) = 1
NA（照明）= 1.336
即使设计用于油浸反射暗场聚光镜与数值孔径的上限高达1.50（见表2）中列出，光促进的在含水介质中的标本的照明必须具有一个数值孔径不大于1.336时，减少了有效暗场照明的上限。 在沉浸在较高折射率的液体试样的情况下，暗视场照明的数值孔径的有效上限最多可1.50接近，虽然这是在实践中难以实现的。
高数值孔径聚光镜，是否打算用于干燥或油，必须准确地居中在显微镜的光路中来实现最佳性能。 为了实现这一点，许多暗场聚光镜都建有刻到所述上表面在中心聚光镜，以帮助一个小圆圈。 定心是通过成像刻圈以及使用该聚光镜定心螺钉，以确保圆（和聚光镜）中的光路被正确地居中用低倍率（10倍至20倍）的物镜进行。 有关暗视野显微镜照明对准的更详细信息，请咨询我们的部分暗视野显微镜配置在显微镜底漆别处。
一般情况下，暗场照明的适当条件下成像对象是颇为壮观看到（例如尝试新鲜血液暗场下降）。 通常含标本在暗视野显微镜明闪耀出光彩非常低的固有对比度。 这样的照明是最好对揭示的轮廓，边缘，边界和折射率梯度。 不幸的是，暗场照明是在揭示内部细节不太有用。
其他类型的标本，其中包括许多有污渍，也反应良好暗场条件下的照明。 图7示出三种类型的样品，所有这些都产生在两个明场和暗场照明良好对比度的暗场显微照片。 在图7中所示的鹿蜱（ 硬蜱demmini）的主体的信息（一）可以在明被淘汰，除非聚光镜光圈缩小最大化对比度。 然而，在暗场，大部分蜱标本的细节变得可见，可以在电影很容易捕获。 重染色蠕虫吸虫（ 卷棘口吸虫 ，图7（b））也揭示了当暗视场的条件下照射相当详细地说，作为是否蚕气管和在如图7（c）气门示出。 除了上面给出的例子中，一些其他标本也可以查看和既明场和暗场照明以获得所需的效果下拍照。
在二十世纪上半叶，暗视野显微镜有一个非常强大的内容和大量的精力优化暗场聚光镜和照明消耗。 这种强烈的兴趣慢慢开始用更先进的反衬增强技术，如相衬，微分干涉对比和霍夫曼调制对比出现褪色。 最近，结合使用时，在传输暗场显微术的新兴趣已经出现，由于其优点荧光显微镜。
暗视野显微镜仍然是生物学和医学研究的优秀工具。 它可以有效地使用在高放大倍数拍摄活细菌，或在低倍率查看和照片的细胞，组织和整个支架。 海洋生物学家继续使用暗场照明在低倍率观察和有关淡水和海水生物，如藻类和浮游生物记录数据
