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光学显微镜用于放大人眼看不见的物体。为此，需要高质量的光学元件以实现适当的分辨率。但是，除了有意的影响之外，所有光学组件还对光具有有害的固有影响，从而导致像差。本文重点介绍了此过程中涉及的光学元件及其物理参数。基于此，它提供了有关如何应对像差减少的哲学的历史回顾。将显微镜视为一个整体系统是有益的，从而可以协调其组成以获得优良的显微镜效果。
光学显微镜系统的成像受其组成部件产生的像差的影响。例如，球差，彗差和轴向色差以及横向色差和像散会干扰图像。
传统上，制造商试图消除产生它的组件上的像差。多年来，哲学改变了，光学开发人员开始考虑将显微镜作为一个整体系统。1992年，徕卡显微系统公司将这一愿景变成了一个名字-DELTA系统，它是用于透射和入射光显微镜的通用无限远光学系统。它允许所有用户无限制地模块化使用所有光学对比技术。
秉承这种系统理念，HCS（Harmonic Component System：协调分量系统）是1998年DELTA系统的进一步发展，至今仍在应用。它的突出思想是整个显微镜系统的所有组件之间的“Harmonic”。在保留基本物镜和功能的同时，HCS使DELTA系统更具通用性，并使其得以开放，从而可以满足用户的需求并解决特定的问题。
HC系统包含以下光学组件，它们相互匹配以生成优良图像，并参与了光学像差的校正：
物镜，目镜，套筒镜和相机适配器。
它在1990年代的实施仍然影响着最近的显微镜，因为现代研究显微镜的显着模块化极大地取决于所有光学成分的协调性（图1）。
图1：三代倒置研究显微镜。配备DELTA光学元件的Leica DM IRB（左）允许模块化使用所有光学对比技术。徕卡DM IRE2（中）是1990年代新推出的协调复合系统的首批产品之一。2014年推出的Leica DMi8（右）仍然受益于这种方法，可以协调所有显微镜组件。
图2：无限远显微镜的装配尺寸：共焦距d+x的效果图。给定物镜与镜筒之间的距离I∞，即用于安装照明和对比度组件的相同空间（阴影线），物镜后面的光学组件的直径及其与出瞳的距离会增加。给定正常镜筒透镜的参考焦距fNTL，中间图像偏移x。
在无限光学的发展过程中，“长”（金相显微镜的参考焦距为250 mm直到1987年）和“短”（管长为160 mm）的参考焦距积累了深厚的技术经验，它们的优缺点是严格分析。随着1992年引入DELTA概念，将200 mm的参考焦距定义为徕卡的新标准，以实现整个系统高效设计的优良长度。这个概念协调地结合了以前系统的优点，同时消除了它们的系统缺点。
1858年，伦敦显微镜学会采用了经典的RMS（皇家显微镜学会）物镜螺纹作为显微镜的标准螺纹。无限远光学的发展和用户要求的变化（例如，对荧光显微镜对高孔径物镜的需求不断增长）使其成为现实。显然，RMS线程将阻止进一步的发展。为了创造新的自由度，徕卡于1992年推出了带有DELTA系统的新型M 25x0.75物镜螺纹。
在DELTA系统的开发过程中，还研究了物镜新的更大焦距的必要性和可能的优势。
共焦距离d是纯机械尺寸，即物平面和物肩之间的距离（图2a）。通过转动镜架改变物镜时，或多或少会保留图像焦点（共焦）。除了确定用于集成透镜元件的空间量之外，共焦距还影响物镜和整个显微镜系统的结构和人体工程学设计。
尽管长焦距（例如60 mm或更长）在显微镜和宏观显微镜之间的阈值范围内为设计物镜提供了某些优势，但对于整个显微镜范围的技术和应用均衡设计却具有相当大的缺点。
除了增加物镜的尺寸和增加光学模块的使用会引起许多用户的不赞成外，更长的焦距也对人体工程学产生不利影响。立式显微镜的观察口和倒置显微镜的样品台位置不可避免地与共焦距的增加成比例地增加。
物镜的后焦平面（出射光瞳）的位置在后续镜筒透镜的校正中以及在物镜与物镜之间的无限光路中的图像对比模块的光学和几何设计中起着重要作用。管镜。焦化距离越长，出射光瞳与随后的光学元件之间的距离越长，从而导致直径更大，校正问题，成本更高等。物镜焦距越长，通常会提高物镜的对中灵敏度，这对于高性能物镜特别不利（图2b）。
在仔细分析并考虑了均匀显微镜范围的所有关键方面之后，徕卡决定保留45mm的共焦距离，这已经证明是DELTA光学系统的优良解决方案。这些适合安装在HCS系统上的尺寸的继续使用，确保了对整个“显微镜工作场所”的光学，机械和人体工程学要求的协调解决。
所描述的机械和光学装配尺寸定义了用于成像和校正光学像差的光学组件组成的几何框架。
所涉及的每个组件-物镜，目镜，镜筒，相机适配器等-都有不同的物理工作要做，因此对校正物理上不可避免的光学像差有其特定的要求。已经详细描述了需要校正的像差的因果关系。
显微镜已采用各种方法进行“整个显微镜系统”的光学设计，并将校正工作分配到所涉及的组件之间。
首先，将每个组件设计为本身没有像差的方法似乎很有吸引力。尽管从原则上讲这是可能的，但它存在纠正“过载”的风险：成本太高，达到或超过了可能的极限。
事实证明，更好地整体观察整个显微镜系统的某些光学像差的校正并在多个系统组件之间分配影响。
球面像差，彗差和轴向色差在源头（即产生它们的组件）中得到了有效校正。但是，很早就发现，通过将校正工作委托给物镜和目镜，可以较好地校正横向色差和像散。自从引入无限光学以来，每台显微镜都具有镜筒系统，这是形成真实中间图像所必需的。正如我们已经描述的那样，该系统可用于在中间图像中建立特定的校正状态，从而创建额外的自由度。
随着1992年DELTA光学器件的推出，物镜的横向色差补偿从目镜转移到了无限远筒镜。这是通往HCS系统的又一重要步骤，为设计广角目镜带来了特殊优势。
图3：DELTA和HCS系统中的像散和场曲率补偿。示出了物镜，管镜和目镜的矢状和子午图像曲线。在HCS系统中，补偿效果在所有组件之间协调分配。
在光学成像中，散光是一种典型现象的名称，该现象是在径向或切向方向上延伸的离轴标本细节以不同距离聚焦，即在凸矢状或子午像面上。消除散光后，它们会重合，从而形成单个（在简单情况下也是凸形）图像表面（像场弯曲）。在没有像场弯曲和像散的理想光学系统中，像面位于高斯像面上，并且标本细节清晰地聚焦在整个视场中。
散光校正后的剩余场曲率主要取决于所使用物镜的类型。物镜的构造越复杂，场曲越小。散光的程度特别受镜片形状的影响。当满足非平面校正（即球面像差和彗差校正）的基本要求时，简单类型的物镜（例如消色差透镜）始终具有一定的剩余像散量。使用简单的经非球面校正的目镜，就有可能以“自然”方式获得足够的成功来补偿这种残留的像散。
尽管没有目镜参与，但只有通过开发更复杂的平面物镜，才可能对剩余的场曲进行额外的校正。但是，经验表明，将曲率和像散校正工作更均匀地分配到所涉及的各个组件（包括管状透镜）中，将更为有益。HCS系统已经发生了这种情况（图3）。
具体而言，这意味着物镜对场曲校正的部分贡献由以下组件的共同补偿工作量承担。这使物镜“更加放松”，并为特殊应用创造了更大的自由度。
显微镜组件之间不仅可以协调统一，而且可以与相关应用程序相结合。尤其是物镜可以根据其任务进行定制。主要是由于荧光的应用，除了出色的场平坦度和色校正之外，还需要高UVA透射和低自发荧光。
物镜质量的标准是Strehl强度比，它给出了像差物镜形成的图像在衍射盘中心的强度与相应的强度的关系，而该强度在其他方面相同但经过理想的校正。该值的大小对于图像对比度起决定性作用。在光学设计中，瞄准并实现了图像中心99％的斯特列尔强度比。为了满足高要求，对于高性能物镜，制造公差一定不能使该值降至95％以下。关于该主题的文献允许根据人眼的生理特性，使斯特雷尔强度在像场边缘下降至80％。
的点扩展函数（PSF）是用于在一个自发光点的艾里衍射图案中的强度分布的视觉3D显示器。中心值的高度（强度）和宽度取决于孔径。斯特雷尔强度仅用一个数字描述物镜的性能，而PSF则提供有关残余误差的程度和性质的信息。因此可以容易地区分球差，昏迷和散光。
该图案越高越细，对比度和分辨率就越高。如果存在像差，则强度在中心值处下降，而在衍射环中上升，从而导致对比度降低。除此之外，旋转对称性以及因此成像精度朝着图像的边缘减小。
图4 以40倍物镜的典型示例显示了HCS系统的性能改进。
图4：FOV 25的三代开发物镜的点扩散函数。使用有限系统的NPL FLUOTAR 40 / 1.30，像散和彗差使图像在视场边缘几乎无法区分（a）。DELTA系统中的∞物镜PL APO 40x / 1.25显示出显着改善的场性能（b）。在HCS系统中，同一物镜产生的视场曲率明显较小，对比度增强（c）。
有时，高空油浸物镜的特殊性能是突出了更长的自由工作距离。然而，实际上，假定的优势经常被证明是不利的。
具有很高孔径的油浸物镜仅在相对较窄的温度间隔内才能达到其全部光学性能，这是因为浸油的折射率随温度的突然变化。从图5可以看出，油层越厚，折射率的温度特定变化对图像的损害越大。因此，为了可靠地应用，自由工作距离必须与实践中通常出现的温度间隔相匹配，即，大于0.1 mm的自由工作距离是不合适的。
图5：斯特列尔强度比与自由工作距离和浸油温度的关系。在与标称值相差DT = 10°且光圈为1.40且自由工作距离大于0.1毫米的情况下，斯特列尔强度已经降至90％的极限以下，这对于对比度至关重要。
已为HCS系统中的某些物镜提供了校正支架，以实现物镜的光学性能潜力，即使是在样品中光学条件不断变化的特殊应用中也是如此。在设计物镜时，校正中要考虑到有关盖玻片和浸没介质的厚度和折射率的某些假设。
如果条件与这些假设不同，则会发生球差，从而导致对比度下降。可以通过计算得出的镜头组间距的变化来纠正此故障。可以更正以下内容：
·保护玻璃厚度与标称值的偏差（图6）
·不同的浸入介质
·浸没介质的温度偏差
·聚焦在表面以下时样品的折射率影响
图6：斯特列尔强度比与防护玻璃厚度的关系。在与标称值相差D = 0.01毫米的情况下，斯特雷尔强度已经下降到低于90％的极限值，该极限对于使用高光度干式和水浸式物镜时的对比度至关重要。ISO 8255-1标准防护玻璃[6]可能具有较高的公差。这意味着在紧急情况下需要校正支架。
图7：电生理物镜的典型机械设计示例。由于其纤细，尖锐的安装和较长的自由工作距离，因此物镜可自由接近样品。前端是惰性的，高度不超过20毫米。
在电生理学中，细胞是用微操纵器在温度受控的水溶液中处理的。例如，在恒定温度下测量神经细胞的小电流和电压。这对物镜的机械性能提出了特殊要求（图7），例如
·细长的安装座，具有尽可能大的进入角度
·整个前部均具有惰性，防刮擦的表面
·小的表面电导率
·小的导热率
光学设计还必须满足特殊要求：
·自由工作距离长
·400 – 1000 nm 的宽带APO校正
·DIC在NIR范围由于杂散在厚的样品的光效
·高UV -A透射率，用于荧光
·小的自发荧光
·共聚焦显微镜的适用性
为了满足该应用领域的特定需求，专门设计了一系列物镜。在这里，HCS系统也可以协调光学性能要求方面相互矛盾的极端情况。
我们已经在讨论了横向色差。在目镜中，它不会像物镜那样朝着像场的边缘线性增加（“区域行为”）。以前使用的目镜的子午和弧矢图像曲线也显示了类似的非线性行为。相反，物镜的相应场曲是“无区域的”。这种矛盾的行为很难协调，即，尽管熟练地与大图像场进行了协调，但仍保留了一定数量的散光。在HCS系统中，目镜从物镜获得了较大比例的曲率校正。这项任务导致了更复杂的目镜类型，具有更大的自由度，可用于校正像差和像散等剩余像差。因此，HC目镜可对场曲线进行“无区域”校正。
图8：在协调分量系统中，目镜接管了物镜的一部分曲率校正。
多年来，随着显微镜的发展，值得将显微镜视为一个系统。随着1998年HC系统的引入，Leica Microsystems进一步发展了这一愿景，直到今天仍然有效。其技术概念基于1992年随DELTA系统引入的光学和机械装配尺寸，用于焦距，物镜线和参考焦距。
HC系统构成了所涉及系统组件之间光学校正效果的协调。这使保留光学系统的通用应用潜力成为可能，同时设计可额外满足特定应用要求（例如荧光和共聚焦显微镜或电生理学）的物镜。
