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自上世纪中叶以来，荧光显微镜已发展成为一种生物科学工具，对我们对生活的理解影响最大。在当今几乎所有生命科学学科中，借助荧光分子观察细胞和蛋白质都是一种标准方法。这种广泛的应用范围可以追溯到一些研究人员的技术工作，他们希望改善和简化荧光显微镜的工作。参与这一发展的一个人是荷兰军医约翰·塞巴斯蒂安·普隆（Johann Sebastiaan Ploem）。
约翰·塞巴斯蒂安·普隆（Johann Sebastiaan Ploem）于1927年出生于苏门答腊的萨瓦伦托，是荷兰煤矿工程师的儿子。在他的童年时代，他与父母一起返回荷兰，在那里他将绘画定为他的爱好之一。高中毕业后，他发现了另一个引人入胜的色彩领域，以后我们将学习。普隆决定研究医学，并在乌得勒支，哈佛和阿姆斯特丹接受了教育。在此之后的一段学术生涯中，他在迈阿密大学和阿姆斯特丹大学工作，之后被提升为荷兰莱顿医学系的教授。
在研究活动中，他发现荧光显微镜是一种强大的工具。在1960年代，一种特殊类型的标本照明开始流行，事实上，1924年Policard和Paillot已经知道并描述了这种标本，他们对蚕的自发荧光事件很感兴趣（Policard and Paillot，1925）。一些研究人员重新启动了这两位法国科学家的项目，将荧光照明和样品检测放在显微镜的同一侧。使用入射光的这一原理称为“ 落射照明””与透射显微镜形成对比。使用这种技术进行荧光显微镜检查的一大优势是可以避免检测到光源发出的发射光（图1）。另一个优点是具有更高的机械特性：在透射照明中，聚光镜和物镜有两个独立的光轴，必须仔细对齐。在落射照明中，物镜既是：聚光镜又是聚光镜。这样，可以避免对准问题。
图1：落射照明在荧光显微镜下的优点：在透射照明（左）的情况下，光源和图像检测位于物镜的相对侧。通过这种设置，一个明显的局限性是不需要检测激发光（浅蓝色）。相反，落射照明（右）将物镜用于照明以及图像检测。对于荧光显微镜，这意味着用户不会暴露在激发光下。
几年前，两名来自苏联的研究人员为荧光落射照明显微镜提供了非常重要的输入。Brumberg和Krylova开发了一种所谓的二向色分束器，用于用入射光激发紫外线（Brumberg和Krylova，1952年）。二向色性材料能够使特定波长范围的光通过，而其他波长的光则被反射（图2）。
由于激发光必须以某种方式融合到显微镜的光路中，因此该原理对于荧光落射照明必不可少（图3）。更精确地，二向色分束器对于来自光源的期望的激发光的波长是不可穿透的，并且将激发光反射到样品。来自样品的荧光又可以通过二向色分束器到达检测侧。
图2：透射图说明了二向色分束器的功能。反射较短波长的光（蓝色箭头），而较长波长的光（红色箭头）可以通过滤镜。
图3：荧光落射照明需要一个二向色镜（灰色），该反射镜能够将激发光（蓝色）反射到样品，并将发射光（绿色）传递到检测侧。激发光的波长可以用相应的滤光片（橙色）预先选择。面向检测侧（紫色）的滤光片仅允许荧光团的波长通过，并从激发中排除残留的杂散光。
不幸的是，由于缺乏跨铁幕的信息交换，普隆不了解俄罗斯的事态发展。尽管如此，他还是亲自开始使用二向色分束器。在Ploem的特例中，他与著名的特种玻璃制造商Schott（美因茨）共同开发了一种分束器，该玻璃反射蓝光和绿光（Ploem，1965年）。随后，当他用Leitz公司提供的中性分束器改装“ Opak”落射照明器时，通过引入带有四个不同二向色分束器的滑块，他可以在UV，紫罗兰色，蓝色和绿色（Ploem，1967年）（图4）。
图4：荧光多波长落射照明器，在滑块中安装了四个二向色分束器，用于紫外线，紫罗兰色，蓝色和绿色激发光的入射照明。在阿姆斯特丹大学建造（普隆，1965年）。
二向色分束器的发展以产生具有离散波长的激发光具有重要的优势。当时，紫外线光谱（〜100 nm – 380 nm）中的激发非常普遍，但具有令人讨厌的副作用：自发荧光。紫外线会激发许多组织物质，导致微弱的背景发光（图5）。通过将二向色镜的反射波长设置为绿色或蓝色范围，Ploem能够达到两种荧光染料FITC（494 nm）和TRITC（541 nm）的激发最大值，这两种荧光染料在当时非常普遍，产生自发荧光。FITC（荧光素异硫氰酸酯）和TRITC（四甲基罗丹明5-（和6）-异硫氰酸酯）可以与抗体偶联，并且仍用于免疫荧光显微镜检查。通过在一个很小的范围内达到其激发最大值，组织标本的对比度显着增强（图5）。用Ploem二向色分束器产生的激发光束非常有效地拟合到FITC的激发最大值，以至于甚至可以使用发射光谱很差的光源。
图5：左：标记有免疫标签（FITC）的组织细胞被宽带紫外线激发照射。注意组织结构具有蓝色自发荧光。右图：使用FITC标签使用窄带蓝色（490 nm）光通过落射照明照亮的相同组织和相同免疫染色。注意增加的图像对比度（Ploem，1967）。
考虑到这些事实，现在有可能通过使用由普通高压汞弧灯供电的蓝色和绿色窄带激发来利用落射照明的优势。这种增强满足了生命科学和医学领域对荧光显微术的需求。
根据Ploem的发明，Leitz设计了一种新型的多波长荧光落射照明器，该照明器带有四个旋转的二向色分束器，它们可以激发UV，紫罗兰色，蓝光和绿光范围内的样本：Leitz PLOEMOPAK。
Leitz员工W. Kraft取得了进一步的成就，他将二向色分束器与适当的激发和发射滤光片组合在一个工件上，即所谓的滤光块或滤光块（Kraft，1969年，Kraft，1972年）（图6）。他的研究结果导致了落射照明器的设计，其中有几套四个激发块仍然是当今几乎所有多波长荧光显微镜的基础。
图6：左图：1970年左右，Leitz员工W. Kraft将激发滤光片（橙色），二向色分束器（灰色）和发射滤光片（紫色）放在一个工件中，即激发块。中：激发块的工程图。右图：在现代显微镜下，荧光激发块可轻松点击和退出。研究人员甚至可以根据需要修改具有不同滤镜和二向色分束器的立方体。
有了Ploem及其同时代人和后继者建立的技术基础，我们今天有幸观看到无数种不同的荧光团，并在落射照明器中放入了足够的激发块（图7）。研究人员甚至可以建立自己的立方体，以根据需要自定义激发和发射参数。
由于现代研究显微镜的自动化，在实验过程中切换过滤器立方体仅需单击一下按钮。科学家们可以在一秒钟内在不同的荧光团之间切换，从而甚至可以观看荧光标记有不同报道分子的活体标本。
图7：荧光显微镜的演变。左：透射光荧光显微镜的基本问题是激发光的检测。中：这就是为什么人们利用落射照明并将光源移动到显微镜的检测侧的原因。该方法需要二向色分束器。右图：将激发滤光片，发射滤光片和二向色分束器放到一个块中，有助于快速切换专用于某些荧光团的不同块。
