各种环境因素都会影响荧光激发,包括荧光团与周围溶剂分子之间的相互作用(由溶剂极性决定),其他溶解的无机和有机化合物,温度,pH值以及荧光物质的局部浓度。这些参数的影响在一个荧光团与另一个荧光团之间差异很大,但是吸收和激发光谱以及量子产率会受到环境变量的严重影响。实际上,荧光的高度敏感性主要归因于在激发态寿命期间在局部环境中发生的相互作用。本交互式程序探讨了弛豫效应和与溶剂极性有关的相关光谱偏移。
本程序以出现在窗口左侧的Jablonski能量图和一个假设的荧光团初始化,该荧光团由一对相对分子吸收和激发强度随波长变化的光谱图上方的溶剂分子限制。荧光团和溶剂分子的偶极矩由叠加在椭圆分子上的黄色箭头指示。溶剂偶极箭头的长度表示极性特征的相对程度(较长的箭头表示更多极性的溶剂)。默认设置是没有偶极矩的非极性溶剂。为了操作本程序,请单击“开始”。按钮以启动激发和激发序列,该序列导致分子激发为弗朗克-康登激发态,然后溶剂松弛,并且激发光谱根据溶剂的极性向更长的波长移动。可以使用“溶剂极性”滑块(在上下限的任意范围之间)更改溶剂极性的程度。注意,增加溶剂极性会降低与溶剂无关的S(1)的能级,并增加相对于处于激发态的荧光团偶极的溶剂重新取向。程序中事件的相对速度可以通过“程序速度”滑块控制。
在溶液中,基态荧光团周围的溶剂分子具有偶极矩,该偶极矩可以与荧光团的偶极矩相互作用,从而在荧光团周围产生溶剂分子的有序分布。荧光团中基态和激发态之间的能级差会导致分子偶极矩发生变化,引起周围溶剂分子的重排。结果,在激发事件和溶剂化荧光团周围的溶剂分子重新排序之间存在时间延迟(如图1所示),通常在激发态时其偶极矩比在基态时大得多
在荧光团被激发到第一激发单重态的较高振动水平(S(1))之后,过量的振动能量迅速损失到周围的溶剂分子中,因为荧光团缓慢地松弛到低振动能级(在皮秒内发生)规模)。溶剂分子通过重新定向(称为溶剂弛豫)有助于稳定并进一步降低激发态的能级)围绕激发的荧光团,速度较慢,需要10到100皮秒之间的时间。这具有减少基态和激发态之间的能量分离的效果,这导致荧光激发的红移(到更长的波长)。溶剂极性的增加会相应地引起激发态能级的更大降低,而溶剂极性的降低会降低溶剂对激发态能级的影响。荧光团的极性还决定了激发态对溶剂效应的敏感性。极性和带电的荧光团比非极性的荧光团表现出更强的作用。
溶剂对荧光的弛豫作用可能对斯托克斯位移的大小产生显着影响。例如,氨基酸色氨酸的杂环吲哚部分通常位于蛋白质的疏水内部,其中周围介质的相对极性较低。通过加热或化学试剂使典型宿主蛋白变性后,随着吲哚环出现在周围的水溶液中,色氨酸残基的环境从非极性变为高极性。荧光激发的波长从大约330nm增加到365nm,由于溶剂效应,偏移了35nm。因此,内在和外在荧光探针的发射光谱都可以用来探测溶剂的极性效应,分子缔合以及极性和非极性小分子与大分子的复合物形成。
荧光定量研究应经常进行监测,以扫描激发图谱中的潜在变化,即使它们既不是预期的也不是预期的。在可以建立均一浓度的简单系统中,应观察到激发强度随着荧光团浓度的增加而逐渐增加,反之亦然。但是,在复杂的生物系统中,荧光探针的浓度可能会在很宽的范围内局部变化,并且强度波动或光谱偏移通常是pH值,钙离子浓度,能量转移或存在淬灭剂而不是荧光团的结果化学计量。在评估实验程序的结果时,应始终考虑到意外溶剂或其他环境影响的可能性。