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通过显微镜拍摄的照片会因各种意想不到的颜色变化和变化而变得复杂，这些变化会影响图像在胶片乳剂或数字电子图像捕获设备上的呈现方式。这些意外的成像结果是由多种因素造成的，从光源和胶片乳剂之间的颜色平衡不正确到像差和灯电压波动等光学伪影。
如果已仔细控制胶片乳剂和显微镜光源之间的色温差异，如我们对色温的讨论中所述，那么对显微镜光源的色彩平衡进行微调通常可以缓解色偏问题。在大多数情况下，产生不良色彩效果的原因非常清楚，或者可以通过仔细检查曝光条件轻松确定。在其他情况下，问题不是很明显，可能需要在发现原因之前进行详细调查。
在确定了彩色显微摄影问题的基础后，通过适当使用一种或另一种类型的滤光片通常很容易纠正。滤光片用于选择性地阻挡或降低选定波长的强度，同时传输所有其他部分。市场上有多种滤光片可帮助显微摄影师补偿光学和照明问题，以获得尽可能高质量的图像。许多显微摄影颜色偏移或色偏可以通过插入适当的柯达Wratten 颜色补偿来解决滤光片进入光路。其他滤光片，例如中性密度、对比度增强、紫外线吸收、热吸收、红外线和旨在帮助显示生物污渍细节的滤光片也很常用。下面将详细讨论这些滤光片。
滤光片通常以玻璃、塑料涂层玻璃、醋酸盐或明胶基质的形式提供，这些基质已经用从天然和合成来源获得的有机和无机染料进行了涂层、混合或浸渍。用于制造滤光片的玻璃或聚合物的质量很重要，应该是光学级的，并在整个显微镜视野中提供密度和颜色的均匀性。明胶滤光片是市售的具成本效益和光学上令人满意的滤光片，使其成为关键显微摄影的首选滤光片材料，尽管需要温和处理。光学玻璃滤光片也很出色，但它们无法满足显微镜的所有需求。醋酸纤维滤光片通常用于对质量和精度要求不重要的非图像形成系统。通常，醋酸纤维滤光片用于照片放大机和打印机。塑料涂层滤光片主要用于暗室中的安全灯应用，不适用于光学显微镜。不同制造商使用的术语可能会令人困惑，因为滤光片通常以产品编号或过滤性能的某些方面来指代。 过滤器命名法的行业标准很少。
色彩补偿滤光片- 柯达制造Wratten系列色彩补偿滤光片，设计用于广泛的实验室和工业应用。这些滤光片由胶体碳与合适的染料混合并分散在明胶中组成，以获得所需的光谱特性。颜色补偿滤光片与颜色平衡和转换滤光片的不同之处在于它们通过主要衰减可见光谱的红色、绿色和/或蓝色区域来控制颜色。他们被简化为前缀CC，为Ç的olor Ç补偿，然后是滤光片标称峰值密度，范围从大约 0.025 到 0.5 乘以 100，并以滤光片颜色的大写第一个字母结尾（例如M代表洋红色）。因此，标称峰值密度为 0.3 的黄色补偿滤光片的缩写将是：CC30Y。
该系列中的每个滤光片控制一种颜色的数量，同时传递其余两种颜色中的一种或两种。以这种方式，色彩补偿滤光片可以对光源的色彩平衡进行细微的改变，或者它们可以补偿光谱输出中的缺陷。一系列蓝色补偿滤光片（CC025B 到 CC50B）的可见吸收光谱如图 2 所示。该系列中所有滤光片的主要最小值出现在 380-490 纳米范围内，它们通过大部分蓝色波长并过滤绿色、黄色和红色波长放入显微镜的光路中。
颜色补偿滤光片标有数字（标称峰值密度），以表明它们吸收光的能力。常用的密度是 05、10、20、30、40 和 50，它们从较小 (05) 到较大 (50) 密度逐渐增加滤光片光密度。例如，30 号滤光片将其补色的水平降低 50%，或一个曝光步骤。CC30M 滤光片（洋红色）吸收 50% 的通过它的绿光。颜色补偿滤镜可以组合使用（例如，CC20Y（黄色）+ CC20M（品红色）= CC20R（红色）），但为了获得优良效果，只能使用单个滤镜。当两个滤光片组合在一起时，会产生略有不同的颜色，这种伪影可以掩盖显微照片中的颜色缺陷。
颜色补偿滤光片的主要用途之一是克服批次内或不同批次之间胶片乳剂的变化。彩色胶片的制造是一个复杂的过程，包括在聚合物基材上涂上许多仅几微米厚的感光乳剂。乳剂厚度的波动会影响色彩平衡，可能会出现在一张或多张单独的显微照片、整卷胶片或部分批次中。制造商允许的波动容限相当于 CC10 滤光片的效果，这种变化已被证明可以为大多数用户接受。
重要的显微摄影要求使用颜色补偿滤光片来仔细控制颜色偏移，颜色偏移可能在六种原色中的任何一种中有所不同：红色、绿色、蓝色、青色、品红色和黄色。大多数情况下，在观察新显微照片上的背景颜色时，胶片批次变化首先会很明显。这种颜色应该是中性的浅灰色或白色，颜色偏移通常在发生时非常明显。通过使用与背景中存在的颜色偏移互补的滤光片，使用颜色补偿滤光片校正颜色平衡是一件简单的事情。使用彩色胶卷进行大量显微摄影时，购买每卷上具有相同乳剂编号的胶卷，并将多余的胶卷存放在冰箱或冰柜中。然后可以使用测试卷来确定颜色补偿和平衡变量，这些变量应该在其余的胶片批次中保持不变。推荐的程序是曝光一个没有补偿滤镜的单帧，然后是通过每个 CC10 系列滤镜（CC10R、CC10G、CC10B、CC10C、CC10M 和 CC10Y）曝光的帧。在 5000 K 光台上对齐所有七张显微照片后，显示干净白色或非常浅灰色背景的背景是经过正确过滤的背景。
图 3 中所示的显微照片展示了使用伊红/苏木精染色的人十二指肠组织的薄切片的显微照片进行的色彩校正滤光片测试。图 3(d) 显示了没有添加颜色校正滤光片的基线颜色平衡。图像的整体黄色偏色表明 CC10G 滤镜（图 3(f)）是用于色彩校正的合适滤镜。事实上，图 3(f) 中的背景是图 3 中所有图像中最干净、最纯净的，代表了色彩校正的选择。其他滤光片（图 3（a、c、e、f、g））在显微照片中产生背景，让人联想到补偿滤光片颜色。在光路中放置一个 CC10Y 滤光片（图 3（b））只会增加黄色背景的强度。
在许多情况下，低密度颜色补偿滤光片可以有效地用于增强被各种染料染色的组织薄片的颜色再现。每个样本都必须在反复试验的基础上进行评估，因为过度使用颜色补偿滤光片会导致互补染色颜色的退化，并可能使背景呈现色调。在尝试使用颜色补偿滤光片增强染色颜色时，通常建议将颜色补偿滤光片的密度限制在 CC20 以下。
正如John G. Delly所建议的那样，对于预算有限的显微镜师，或者当这些滤光片不可用时，柯达 Wratten 滤光片有更便宜的替代品。柯达还制造了一个彩色打印查看滤光片套件，其中包含一组透明滤光片，对于六种颜色（红色、绿色、蓝色、青色、品红色、黄色）中的每一种，该滤光片的密度值为 0.10、0.20 和 0.40。这些滤光片可以放置在显微镜光端口上，以提供快速简便的色彩校正。尽管没有按照与 Wratten 或彩色印刷滤光片相同的临界公差制造，但如果观察滤光片在表面上没有严重的瑕疵，则通常可以替换它们。柯达还提供一套醋酸纤维彩色印刷滤光片（Color Printing Filter Set)，它有 75 × 75 平方毫米，包含足够的滤光片以匹配 Wratten 滤光片提供的大多数密度。
使用下面的链接导航到包含各个颜色补偿滤光片规格数据的页面：
颜色补偿滤光片数据- 为 Kodak Wratten 系列颜色补偿滤光片系列提供了包含主要最大值波长的可见吸收光谱和表格。
中性密度滤光片- 在显微镜照明显得太亮而无法舒适观察和显微摄影的情况下，应使用中性密度滤光片降低光强度，通常称为ND滤光片。这些滤光片颜色为中性灰色，旨在在部分或整个波长范围内均匀地降低透射光强度，而不会引起色温的显着变化。中性密度滤光片非常适合控制彩色显微照片曝光时间，而无需调整灯电压。它们在光学显微镜中的主要用途是在灯强度如此之大以至于显微照相设备允许的最短曝光超过正确捕获图像所需的时间的情况下延长曝光时间。
有两类中性密度滤光片：吸收滤光片和反射滤光片，它们通过吸收或反射选定的波段来工作。图 4 所示为一系列常见中性密度滤光片的可见光吸收光谱。从图中可以看出，这些滤光片在整个可见光（400 到 700 纳米）范围内显示出相对恒定的消光系数。图 4 中从 ND-0.3 到 ND-70 的每个中性密度滤光片增量都有一个逐渐变大的消光系数，它们共同提供了一系列统一的用于调节照明的滤光片。
中性密度滤光片使用明胶、聚合物或玻璃基材制造，这些基材已浸渍或溶解材料以降低光学透明度。柯达Wratten 中性密度滤光片非常受欢迎，由专有的明胶薄膜制成。将含有选定的有机染料补充物的胶体碳悬浮液与液体明胶混合，直到达到所需的中性密度。然后将这种组合涂覆到支撑玻璃基板上，直到它形成厚度均匀的非常薄的薄膜。干燥后，将薄膜从基材上剥离并涂上漆以进行保护。请注意，即使中性密度、颜色补偿和其他 Wratten 滤光片受到漆面保护，它们仍然容易损坏（尤其是划痕），只能在边缘或角落处处理。另一种方法是将明胶 Wratten 滤光片放在一个简单的金属框架中，也由柯达销售。切勿将滤光片长时间暴露在超过 50 摄氏度的温度下。同样重要的是，这些滤光片不要放置得太靠近显微镜的卤钨光源，以避免因灯产生的热量而造成损坏。
表 1 列出了常用的中性密度滤光片的规格。每个中性密度滤光片都由字母数字代码ND-XX 指定，其中XX是滤光片的平均透射光百分比。因此，ND-60 滤光片透射（或通过）来自光源的入射光的 60%，而 ND-0.1 滤光片透射 0.1% 的入射光。根据下式，中性密度滤光片的光密度定义为吸光度（透射率的倒数）的对数（以 10 为底）：
光密度 (D) = log(A)
在哪里：
A（吸光度）或不透明度 = 1/T（透射率）
并且，因此：
D = log（1/T）
其中T是透过滤光片的光的百分比，D是光密度，A是吸光度。大多数显微镜专家在使用中性密度滤光片时指的是密度而不是不透明度（互易透射率）。这可能更合适，因为人眼在对数尺度上感知光强度差异。
中性密度滤光片可以堆叠在一起以获得没有滤光片的密度值。堆叠这些滤光片是附加的，因此将 ND-50（密度 = 0.3）和 ND-60（密度 = 0.2）滤光片放入光路相当于放置 ND-30（密度 = 0.5）滤光片。密度为 0.30 的滤光片具有 50% 的透光率（ND-50，表 1），因此可用于将显微镜灯强度降低两倍。同样，密度为 0.6（ND-25，表 1）的滤光片的透射率为 25%（将灯强度降低四倍），密度为 1.0（ND-2.0，表 1）的滤光片可以将灯强度降低 10 倍（透射率为 10%）。
如前所述，在显微摄影中调整曝光是使用中性密度滤光片的主要目的之一。许多现代显微镜都有带 LCD 显示屏的曝光监视器，可在高达百分之一秒的快门速度下通知操作员曝光时间。这些监视器通常还允许以 1/3 到 1/2 光圈增量进行曝光调整。在某些情况下，尤其是在使用高能卤钨灯的明场照明时，显示器推荐的曝光时间小于 0.05 秒。这是一个非常短的时间，可能导致图像曝光不足和渐晕。在光路中添加 ND-50 中性密度滤光片会将必要的曝光时间加倍至 0.1 秒，而 ND-25 滤光片会将曝光时间增加至舒适的 0.2 秒。
中性密度滤光片规格
| 指定 | 密度 | 传输 （百分比） |
|---|---|---|
| ND-80 | 0.1 | 80 % |
| ND-70 | 0.15 | 70 % |
| ND-60 | 0.2 | 60 % |
| ND-50 | 0.3 | 50 % |
| ND-40 | 0.4 | 40 % |
| ND-30 | 0.5 | 30 % |
| ND-25 | 0.6 | 25 % |
| ND-20 | 0.7 | 20 % |
| ND-16 | 0.8 | 16 % |
| ND-13 | 0.9 | 13 % |
| ND-10 | 1.0 | 10 % |
| ND-1 | 2.0 | 1 % |
| ND-0.1 | 3.0 | 0.1 % |
| ND-0.01 | 4.0 | 0.01 % |
使用中性密度滤镜调整曝光的能力对于具有固定快门速度（这些速度范围从大约 1/500 秒到几秒）的相机尤其重要，其中每个连续速度将曝光增加两倍。例如，对于最大速度限制为 1/250 秒的快门，曝光表可能会推荐 1/1000 秒的快门速度。通过在光路中放置 ND-25 中性密度滤光片，灯强度有效降低了四倍，将推荐的曝光时间增加到 1/250 秒。要获得更舒适的快门速度，请使用 ND-2.0 滤镜将曝光时间提高到 0.1 秒。
中性密度滤镜对于介于两种快门速度之间的曝光也很有用。在 1/125 秒的快门速度太短但 1/60 秒太长的情况下，可以在光路中放置中性密度滤光片以调整照明以适应这两个值之间的曝光。ND-60、ND-70 或 ND-80 滤镜与 1/125 秒的快门速度一起使用会增加 1/3 到 2/3 的 f-stop 曝光时间，从而允许更多的曝光宽容度。实际曝光必须通过反复试验确定，但应常规使用中性密度滤镜来调整固定快门速度相机的曝光时间。小心不要通过使用中性密度滤镜引入很长时间的曝光，因为这会导致互易失败和相关的色彩平衡伪影。
较旧的中性密度滤光片可能会随着时间的推移而略带淡黄色，一些较便宜的滤光片也有一定程度的背景色。如果在光学通路中引入中性密度滤光片导致经过仔细校准的显微镜的色彩平衡不正确，请使用色彩补偿滤光片将显微镜光源恢复到适当的平衡。其他光学因素，例如内部散射和反射，会影响中性密度滤光片的有效密度，导致它们与测得的密度不同。出于这个原因，校准关键显微摄影的中性密度滤光片很重要。
染色标本滤光片- 生物组织的薄切片通常用一种或多种有机染料染色，以选择性地提高标本中各种特征的可见度。大多数生物组织污渍产生的强度和色调在彩色胶片上都能很好地再现，但有些污渍往往会显得褪色或颜色发生变化，尤其是在多种污渍混合物中。在许多情况下，颜色补偿滤光片可以帮助恢复大部分或全部丢失的颜色，但过多的过滤会影响相邻染色特征和背景的颜色。这个问题出现在流行的染色剂伊红、品红和亚甲蓝上，它们在大多数彩色胶片上都不能很好地再现。通常，用这些染料染色的组织，无论是单独还是混合，都会显得浑浊且缺乏色彩饱和度。
为了抵消这种影响，显微镜专家采用了二钕滤光片，其中包含溶解在玻璃中的稀土元素的组合。镝滤光片去除了一部分可见光谱的橙色区域，这种效果会增加样本中棕色、蓝色和红色染色特征的颜色饱和度强度。镝滤光片在 580 到 590 纳米之间的消光系数高，允许滤光片去除大部分橙色和黄色，这些橙色和黄色往往会使染色薄片中的红色和蓝色色调变暗。
图 5 所示为同一标本的两张显微照片，人类胰腺的薄切片被伊红和苏木精的混合物染色。左侧的显微照片（图 5（a））是在没有使用色彩补偿滤光片或双镲滤光片的情况下拍摄的。右侧（图 5(b)）是同一视场的图像，这次是在光路中插入了二镱滤光片。请注意此显微照片中红色和蓝色色调的颜色饱和度显着增加。
Didymium 滤光片由非常薄的玻璃部分制成，厚度在 1 到 2 毫米之间，因为滤光片吸收的光量取决于滤光片厚度。较厚的双镨滤光片会引入伪影，例如彩色背景和其他染色颜色的退化。大多数主要的显微镜制造商都提供适当尺寸的双镱滤光片作为可选附件。
在某些情况下，生物标本的背景在染色过程中可能会变得浅色，这是一种不受欢迎的伪影。为了避免这种情况，可以使用颜色补偿滤镜来减去背景颜色，前提是背景颜色不太饱和。染色薄切片的另一个问题是安装介质的着色。加拿大香脂是一种流行的制备薄片的介质，通常会随着时间的推移或在整个镶嵌标本中变成淡黄色。蓝色补偿滤光片 (CC10-20B) 通常可以解决这个问题，除非样品是一个非常厚的整体安装。在这种情况下，可能无法完全中和黄色调。
紫外线滤光片- 钨显微镜灯不会发出大量紫外线，但除汞灯和氙气灯外，一些较新的卤钨灯会产生大量 300-400 纳米范围的紫外线。紫外线辐射可以使许多彩色胶片中的蓝色敏感乳剂层曝光，从而导致整个显微照片具有蓝色偏色。这主要是荧光显微镜的问题，但它可能发生在任何使用高强度卤钨灯、汞灯或氙气灯的显微镜中。要减少紫外线，请使用 Kodak Wratten 2B或2E分别吸收 390 和 415 纳米以下紫外线辐射的滤光片。2B 滤光片将基本上去除所有紫外线波长，只留下可见光照亮样品。2E 滤光片具有更大的阻挡波长光谱，还会去除一些紫光和较短波长的蓝光，因此这种滤光片不太适合彩色显微摄影。
紫外线对彩色显微摄影的影响如图 6 所示。左侧的图像（图 6(a)）显示了人类结肠上皮中分泌粘液的管状腺体的伊红-苏木精染色薄片。显微照片整体呈蓝色，遍及大多数标本特征和背景。将 Kodak Wratten 2B 滤光片放入显微镜光路后，获得了右侧的图像（图 6(b)）。请注意，这张显微照片显示出更好的色彩饱和度和更清晰的背景，消除了蓝色色偏。
闪光灯管也可能产生大量的紫外线，并且可能需要使用滤光片来去除不需要的波长。许多为日光照明而色彩平衡的现代透明薄膜包含紫外线吸收掩模作为薄膜层之一。在这种情况下，可能不需要使用滤光片。阅读制造商关于每种新薄膜类型的规格表，以确定它是否受到紫外线阻挡层的保护。
吸热滤光片- 钨灯或卤钨灯发出的几乎 90% 的辐射以红外线波长的形式出现，这与热量的产生有关。汞灯和氙弧灯也会产生大量热量。吸热滤光片可以添加到显微镜光路，靠近照明器，以去除不需要的红外波长并保护显微镜光学组件、滤光片和样品免受热损坏。事实上，大多数主要显微镜制造商都提供吸热滤光片作为标准设备，有些甚至将这些滤光片集成到照明器中。如果您怀疑您的显微镜照明器可能有内置吸热滤光片，请查阅用户手册或联系您的仪器经销商。
一些吸热滤光片由一种特殊类型的 Pyrex 玻璃制成，称为Aklo，吸收红外线热射线，呈绿色或蓝绿色。用 Aklo 制作的滤光片可能会在显微照片中引入色彩平衡偏差。这种副作用可以通过与吸热滤光片颜色互补的色彩补偿滤光片进行校正。如果可以从灯罩上拆下热滤光片，请这样做并在 5500 K 灯台上检查。浅绿色热滤光片可以通过 CC10M 或 CC20M 洋红色补偿滤光片进行补偿，蓝绿色热滤光片可以通过浅红色（CC10R 或 CC20R）滤光片进行补偿。将互补滤光片放在热滤光片的顶部，直到找到一个与热滤光片上的色调完全平衡并将颜色变为中性的滤光片。当插入显微镜光路时，此补偿滤光片应减轻色彩平衡问题。一些较新的显微镜具有二向色干涉滤光片，旨在将热量反射回灯箱。二向色滤光片在阻挡热量方面比石英或玻璃吸热滤光片有效得多，并且在吸收大量热量时不会破裂或破裂。
为了在彩色显微摄影中充分发挥滤光片的潜力，显微镜师必须全面了解滤光片、可见光和胶片乳剂之间相互作用的技术方面。当正确应用滤镜以解决色偏和平衡问题时，彩色显微照片的质量会大大提高。
