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即使对于经验丰富的显微镜专家来说，在光学显微镜中获取准确的色彩平衡图像也是一项挑战，无论他们是使用传统的摄影胶片乳剂还是较新的固态数码相机系统。电子图像捕捉技术的利用依赖于与传统的基于胶片的显微照相术相同的熟悉的光特性，但执行白平衡调整以实现色彩平衡的能力是电子图像传感器的一项独特功能，这对于正在寻找的调查人员来说一点也不直观从显微镜捕获数字图像。
当捕获的数字图像与通过显微镜目镜观察到的图像或在计算机显示器上实时查看的图像进行严格比较时，颜色变化通常非常惊人，并且试图调和两者之间的差异可能会令人沮丧。造成这种差异的一个因素是，在成像过程中，人类视觉系统在潜意识中对成像条件的变化进行了相当大的调整，并且通常在记录图像和评估静态版本之前通常不会意识到色彩再现问题，通常在不同的观看环境。
在给出图1是一系列照明色温的变化的条件下记录在相同的显微镜视场的数字图像。该标本是贴壁的印度麂鹿皮肤成纤维细胞的单层培养物，在微分干涉对比 (DIC) 中以相对较低（波长的二十分之一）偏差延迟观察。在目镜中，当调整Nomarski棱镜以实现图 1 所示的光程差时，细胞培养物呈现中性灰色，并在光路中添加颜色转换滤光片以提高卤钨灯的色温灯从3200K到大约5500K（日光值）。
在没有颜色转换滤光片的情况下，图1中的 DIC 标本呈现中性灰色，但当通过显微镜目镜观察时，呈现出明显的全局黄色色调，这是白炽灯照明的特征。如果未激活数码相机白平衡功能并将其应用于当前的显微镜配置，则在这些条件下捕获的图像也似乎具有整体黄色偏色（图 1（a））。将颜色转换滤光片插入光路中会使图像在目镜中呈现轻微的蓝色调，而在未进行白平衡校正的情况下捕获的相应数字图像会保持或放大这种颜色偏移（图 1(c)））。将白平衡算法应用于使用钨丝灯或日光平衡照明捕获的图像可消除由于色温效应造成的阴影，如图 1(b) 所示。请注意，该算法使用不同的颜色校正值来平衡图像的色调质量，具体取决于照明色温。钨丝照明需要增加蓝色和减少红色的校正值，而日光照明则相反。
在使用与光学显微镜耦合的数码相机系统获得的图像中实现适当的色彩平衡取决于许多因素，从建立正确的照明条件和精确的显微镜光学对准开始，并在图像捕获阶段达到顶峰。白平衡调整在获得所需图像方面的作用尤为重要，该控制功能可用于捕捉最忠实的样本再现，或有意修改的样本表示，旨在纠正由准备工件。
从概念上讲，需要对白平衡进行粗调，以使图像传感器响应处于一般照明条件的适当范围内（类似于选择一类胶片），而精细修改则有点类似于在胶片中使用色彩补偿滤光片——基于摄影。即使当照明源和检测器响应匹配时，通过显微镜的光通常也会被样品和光路中的任何其他组件修改，有些不可预测。因此，获得的最终图像的色彩平衡可能与所需结果不同。了解不同的标本，也许是标本的局部区域，对成像光产生独特的影响，这一点至关重要。因此，如果需要准确的色彩平衡，则必须仔细控制白平衡调整等变量。
光学显微镜中的图像形成基于光的基本特性，包括产生视觉感知颜色的强度和光谱特性，以及相关的色温值。色温的属性可以相对于标准参考照明源精确定义，并且可以通过仪器进行测量，但在预测每个样本在给定成像情况下将如何呈现时并不可靠。此外，光源具有相同的色温可能具有显着不同的光谱成分，并在类似条件下观看时产生显着不同的图像。使这种情况更加复杂的是对比度增强辅助组件可以引入显微镜光学系统的效果的广泛变化。明场、暗场、相衬、DIC、偏振光、霍夫曼调制对比度和荧光照明都对色彩平衡校正有不同的表现，这通常必须通过单独考虑样本和照明条件来解决。
呈现在图2中是变化的照明的色温和对比度增强方法的条件下拍摄的多个数字图像。图 2(a)说明了在卤钨灯下伊红和苏木精染色的人类睾丸癌（精原细胞瘤）薄片。请注意与适当的色彩平衡图像相比，整个图像中弥漫的整体黄色色偏并使染色部分变色（如图 7(b) 所示））。当日光颜色转换滤光片未插入光路时，这是明场显微镜中发生的常见错误。将蓝色日光滤光片添加到光路而不校正数码相机的白平衡可能会导致数字图像整体偏蓝，如图 2(b) 所示。这张单层培养中的活 HeLa 细胞图像显示了当相机没有正确色彩平衡时发生的蓝色色偏。将白平衡算法应用于捕获软件将在显微镜目镜中观察到的灰度值中呈现图像。
当显微镜照明对于日光色温不平衡并且相机系统没有正确调整白平衡时，使用其他对比度增强技术获得的图像会产生类似的问题。在图 2(c)、2(d) 和 2(e) 中，分别使用微分干涉对比度 ( DIC )、偏振光和霍夫曼调制对比度捕获的图像的色彩平衡值都转移到更暖的（黄色）色调. 在 DIC 图像（图 2（c））中，特征显得浑浊，正常的灰度色调呈现为各种深浅不一的棕色和红色。同样，重结晶尿素的偏振光图像（图 2（d））显得太绿，而放射虫的霍夫曼调制对比图像（图 2(e) ) 具有明显的绿色背景（和亮点）。荧光图像（图 2(f)）通常不会受到色彩平衡问题的影响，主要是因为它们受小范围波长的支配。
色彩平衡或色彩再现的变化现象在日常活动中为大多数人所熟知，并且通常被认为是不需要任何干预的自然现象。例如，日落附近日光的金色质量是非常熟悉的，因为烛光与荧光办公室照明相比，颜色出现显着不同的事实也是如此。人类视觉系统的功能是将眼睛的感官反应与大脑对信号的解释相结合，以适应光线颜色和强度的变化。因此，在广泛变化的照明条件下，白色物体被解释为白色。通常，如果正确感知白色，其他颜色和色调也会适得其反。相比之下，图像传感器，无论是传统胶卷还是现代数码相机，对曝光时固定的照明产生响应。所生成图像的颜色质量将取决于设计在胶片中的颜色敏感层的特定响应，或固态传感器的各个颜色敏感元件（像素）的敏感度。无论采用哪种捕获方法，都可以通过在照明或成像光路中引入滤色器来修改图像的色彩平衡，但数字方法具有明显的额外优势，可以对传感器响应进行电子精确调整。或固态传感器的各个颜色感应元件（像素）的灵敏度。无论采用哪种捕获方法，都可以通过在照明或成像光路中引入滤色器来修改图像的色彩平衡，但数字方法具有明显的额外优势，可以对传感器响应进行电子精确调整。或固态传感器的各个颜色感应元件（像素）的灵敏度。无论采用哪种捕获方法，都可以通过在照明或成像光路中引入滤色器来修改图像的色彩平衡，但数字方法具有明显的额外优势，可以对传感器响应进行电子精确调整。
用于记录图像的传感器，无论是传统的摄影胶片还是数字成像设备，通常都经过设计或调整，以使其基线响应与广泛的一般照明类别相匹配。例如，最常见的摄影胶片分为两大类，适用于日光或钨丝照明光源，并通过使用适当的滤光片对关键应用的胶片响应进行微调。固态传感器，通常是电荷耦合器件 (CCD) 或互补金属氧化物半导体 (CMOS) 光电二极管检测器，能够通过电子方式进行调整，以使其响应特性与各种照明源相匹配。
CCD或CMOS 检测器的单个感光元件本质上是单色的，通过将入射光依次通过红色、绿色和蓝色滤光片到达整个传感器（为每种颜色生成单独的图像，随后将它们组合起来）来实现它们的颜色灵敏度)，或通过微型聚合物薄膜过滤器，这些过滤器以马赛克图案放置在阵列的每个像素上。最常见的过滤器排列是由红色、绿色和蓝色过滤器组成的有序马赛克阵列，它在整个传感器阵列上重复GRGB模式。这种排列称为拜耳滤波器模式（见图 3(a))，包含的绿色元素是红色或蓝色的两倍。额外的绿色传感器像素允许成像设备更接近于人类视觉系统的颜色响应，其在绿色光谱区域（大约 550 纳米波长；图 3（b））的灵敏度达到峰值，因此有助于输出具有视觉上可接受的色彩平衡的图像。从传感器阵列的相应像素（或单色图像）调整单独的红、绿、蓝信号幅度是通过白平衡控制功能实现的，以允许对获取的图像进行颜色平衡。一些相机系统通过软件而不是硬件控制来执行这些调整，或者除了硬件控制之外。
许多显微镜专家都熟悉用于通用应用的数码相机，并且越来越多地适用于显微镜的附件，作为专用研究级成像系统的经济替代品，尽管它们的功能通常更加有限。由于将数码相机用于传统用途所涉及的技术可能会扩展到了解显微镜应用中的白平衡调整等因素，因此首先考虑非技术情况是有用的。控制白平衡调整的基本概念对于一般摄影应用和显微镜成像是相同的。
传统的数码相机通常为用户提供许多不同的白平衡设置，这些设置可以作为“预设”进行选择。这些可能对应于广泛的照明类别，例如日光（晴天或阴天）、钨丝灯、荧光灯或各种其他照明场景。许多相机允许微调预设值以实现更精确的图像色彩平衡。某些相机具有通过参考白卡、墙壁或其他应显示为白色（如果包含在图像中）的对象来调整白平衡的附加功能。在实际操作中，摄像机的定位是使白色物体充满视野，通过开关设置或操作菜单中的选择（取决于具体摄像机）启动白平衡调整，
在图像采集期间采用的相同照明条件下，通过参考定义的白色物体进行调整，可以提供高度准确的色彩平衡校准。但是，如果照明发生变化，则必须重复该过程。高级摄影师通常选择通过使用白平衡设置而不是匹配照明的白平衡设置来修改他们的图像，以达到所需的美学效果。例如，与使用“正确”白平衡获取的图像相比，可以使图像在色调上显得更冷或更暖。当然，如果想要准确的场景再现，则此类效果会被视为错误，类似于在钨丝灯照明中使用日光平衡胶片，反之亦然。
一种流行的色彩平衡技术，通常在关键应用中应避免使用，在消费类相机中通常称为自动白平衡调整.此方法旨在应用于图像场，因为图像是通过评估整个视野，平均存在的关于色调的光值，并尝试平均或归零任何整体颜色偏差来获取和运行的。 . 自动平衡技术的缺点是任何视场中存在的颜色值代表色相的“平均”分布，这些分布被组合以产生中性灰色或白色。实际上，如果总像素响应与编程的（预期的）整体平均值不相似，则相机进行的白平衡调整将不会产生准确的色彩再现。
在显微镜下观察到的典型标本的颜色分布差异很大，并且通常表现出单一的主要颜色（尤其是在荧光中）。对主要呈现红色组织染色的样本进行自动白平衡调整可能会产生与应用于蓝色染色制剂的相同程序显着不同的颜色平衡。两者都不太可能产生准确的样本表示。相机电路尝试平衡检测器响应以输出平均的整体颜色值将在不同的样本上产生显着不同的结果，特别是如果给定的视场具有强烈的或主色。当然，有一些样本可以通过自动白平衡产生可接受的结果（最有可能是那些具有大量白色或灰色区域的样本），但该技术缺乏使其常规使用所需的可重复性。
在考虑为优化白平衡而讨论的不同方法时，很明显有些技术不适合光学显微镜的限制和要求。使用特定照明类型的预设值假设光源的特性是固定的，并且具有色温和其他光谱质量的标准值。当使用卤钨灯时，显微镜中的常见做法是改变灯电压以控制光强度或最大限度地减少热量的产生。这样做会导致照明色温发生变化，如果在数码相机上使用钨丝灯的标准预设值，则会导致不正确的色彩平衡。
对于日光（约5500K）色温区域良好平衡的光源也存在类似问题。不仅“日光”的色温可变，而且很少有人造光源能准确模拟日光光谱质量。从理论上讲，这些困难可以通过允许自动电路校正较小的照明波动来至少部分克服，但其他问题通常使这种方法不受欢迎。通过图像场的自动评估，局部样本变化可能会导致色彩平衡出现重大错误。一般来说，大多数显微镜应用的最佳方法是将白平衡评估限制在精心选择的图像区域或其他合适的目标上。
当使用数字捕获设备对光学显微镜中的彩色标本进行成像时，获得正确的色彩平衡以提供标本的真实表现通常是主要目标。故意偏离此策略通常只是为了纠正会产生不良色偏的样品制备问题。大多数科学级数码相机，包括专为显微镜设计的数码相机，都依赖于通过参考选定的颜色值来调整白平衡。在透射照明中，从样本场中选择一个适当的区域（通常是白色或中性灰色），或者仅在照明场上进行调整，将样本从光路中移除。为了在利用反射照明的显微镜中进行白平衡调整，可以在显微镜载物台上放置一张白色或中性灰色卡片（或纸片）来代替样品。随后通过测量从白卡表面反射的光来获取白平衡设置。
大多数专为显微镜设计的数码相机是通过驻留在主机上的软件控制的，并且通常配置为与许多显微镜功能交互。例如，尼康 DXM 1200 数码相机系统的软件界面在实现白平衡调整的方式方面代表了当前可用的商业产品。当在用户界面中激活白平衡调整窗口时，可以使用选项来选择视场中的区域以供相机系统进行白平衡评估。应仔细评估显示监视器上的实时图像是否有合适的白色或中性灰色区域作为图像传感器的参考点。如果显示器上显示的图像具有与显微镜目镜中观察到的颜色平衡不同的偏色，则必须针对白平衡调整相机系统，以呈现样品的准确图像。理想情况下，所显示的偏色将由照相机的颜色平衡电路时被选择用于白平衡调整适当的样品区域中移除。
可用于设置数码相机白平衡算法的几个典型样本区域示例如图 4 所示。标本是用微分干涉对比成像的成纤维细胞的活培养物（图 4（a）），明场照明下马铃薯组织中淀粉颗粒的四重染色薄片（图 4（b））和人红细胞相衬（图 4（c））。使用区域选择技术的每个图像上的区域以红色概述，而黄色箭头表示在选择单个像素时可能产生令人满意的白平衡校准的图像上的特定点。
数码相机上的白平衡和黑平衡设置可用于调整色彩平衡。
选择作为白平衡参考的区域应尽可能大，并且不受渗入封固剂的样品染色的影响。许多系统中的白平衡调整软件可以选择图像中的单个点（像素），或者可以通过鼠标光标的选取框选择指定的更大区域。通常通过选择最大的可能区域来获得更好的结果。如果选择单个点进行调整，结果可能会出现更广泛的变化，因为红色、绿色和蓝色像素强度的局部组合波动会影响白色的整体视觉效果。通过选择更大的区域，可以获得传感器阵列中更多像素的平均值，以提高实现可接受的色彩平衡的可能性。选择参考区域后，启动白平衡调整，相机系统利用算法或查找表（LUT ) 以设置产生中性或白色值的适当电子值（例如每个分量颜色的传感器增益）。
如前所述，数字图像的色彩平衡在很大程度上受 CCD 或 CMOS 图像传感器收集的波长光谱的影响，无论传感器是安装在相机、望远镜、激光工作台还是显微镜中。在采用这些固态设备的彩色数码相机中，通常需要进行一系列的平衡调整，以生成符合照明源色温的可接受的彩色图像。应考虑成功实现适当色彩平衡的几个准则：
CCD 图像传感器对红外光很敏感，只有滤除较长波长的红外光才能获得最可靠的可见光成像性能。某些系统可能会在相机内集成红外线阻挡元件，但如果确定不是这种情况，则应添加适当的过滤器以在这些波长到达图像传感器之前将其排除。
对于在样品图像、空白样品载玻片或反射光参考（例如白色表面）上进行白平衡调整的任何显微镜配置，显微镜应对齐光学系统以实现适当的科勒照明并准确聚焦在试样平面上。确保这些条件可以最大限度地减少因色差导致的视场中照明不均匀或颜色异常的问题。
通常，图像传感器的性能在色温较高的区域是最佳的，这需要卤钨照明器在建议的数字成像电压调整范围的上限下运行。任何必要的照明强度降低都应该使用中性密度滤光片来实现，而不是通过降低照明灯的电压来实现。类似地，如果将通常用于日光平衡彩色胶片摄影的色彩平衡滤光片插入照明路径中，则数码相机最容易实现适当的色彩平衡。尼康将此滤镜称为NCB（中性色平衡），尽管其他制造商对具有相同用途的滤镜有不同的名称。
与选择非常亮的区域作为白色参考相比，在样本场中的中性灰色区域调整白平衡可能会产生更准确的结果。由于一种或多种分量 (RGB) 颜色过度饱和，完全“褪色”或超出传感器动态范围的区域可能会在图像中显示为白色。由色彩平衡电路对此类区域执行的增益补偿可能会产生不准确或不可再现的结果。灰色区域（具有中性密度）由红色、绿色和蓝色像素传感器（或单独的RGB彩色图像）的大致相等的信号电平产生。结果，更容易实现基于中性区域的准确色彩平衡。
有几个变量会影响显微镜中获取的图像的色彩平衡，了解它们之间的相互关系对于获得可接受的结果很重要。通过成像软件界面进行的曝光设置是通过图像传感器电路的增益调整进行的。由于白平衡调整也是通过 RGB 传感器的选择性增益补偿来实现的，因此在开始白平衡调整之前，应将曝光水平设置为近似正确的值。如果曝光时间改变，或者在设置白平衡校正后需要对增益和偏移进行其他更改，建议重复白平衡设置步骤，因为所有这些因素都会相互影响。同样，对影响光特性的显微镜组件所做的更改，
如果特定应用需要对选定组中的一个样本与另一个样本进行关键颜色判断或比较（其中样本已根据标准程序制备），重要的是不要对每个样本重复进行白平衡调整。在这种情况下，最好的程序是单独对照明进行初始白平衡校准（使用空白显微镜载玻片），然后获取单个样本的图像，进行任何必要的曝光调整。再次用空白载玻片替换样品后，应在照明场上重复白平衡程序，而不对曝光或显微镜配置进行任何更改。然后应在相同的白平衡、曝光等设置下对被比较的样本进行成像。如果需要更改曝光，则应将其保持在最低限度，以免影响色彩平衡。重申此类应用中的关键概念（其中为了测试或诊断目的比较样本之间的色彩再现），应单独对光源进行白平衡调整，而不是针对每个样本进行校正。因此，可以对每个样本赋予显微镜照明源的颜色效果进行比较。白平衡调整应单独对光源进行，而不是针对每个样本进行校正。因此，可以对每个样本赋予显微镜照明源的颜色效果进行比较。白平衡调整应单独对光源进行，而不是针对每个样本进行校正。因此，可以对每个样本赋予显微镜照明源的颜色效果进行比较。
光学显微镜中采用的某些照明和对比度增强技术在调整数字捕获系统的白平衡方面提出了额外的挑战。偏振光、暗场和荧光方法通常呈现的视场中，样本在深色背景上呈现为深度饱和的颜色，白色区域很少或没有。一些相机系统提供了一种机制来为这种类型的成像情况设置暗平衡或黑平衡，其中没有合适的白色或中性灰色区域可用。这种方法建立了传感器响应的基线设置，并可以提供令人满意的色彩平衡。
暗背景标本图像的另一种技术是在去除标本的情况下对照明场进行白平衡调整。然而，对于高度饱和、颜色深的标本，成像的适当曝光可能需要非常明亮的照明或相对较高的相机增益设置。如果在没有样本的情况下在明亮的照明场上进行白平衡调整，这可能会限制白平衡调整的准确性。为了使白平衡电路能够在与样本存在的亮度水平相似的亮度水平下评估照明（并在近似正确的曝光设置下），可以在白平衡调整期间将中性密度滤光片插入光路中，并且然后替换为样品进行实际成像。
经常会遇到在图像捕获期间无法通过遵循通常的协议来实现可接受的白平衡的情况。在这些情况下，有时可以使用非标准技术来有效地“欺骗”相机的白平衡功能以产生特定的色彩平衡，这可能被认为是正确的，也可能不被认为是正确的，但会达到预期的效果。如果即使这种策略也无法提供可接受的色彩再现，或者如果最初获取的现有图像色彩平衡不佳，则使用尼康NIS-Elements等软件对获取后的图像进行处理 可以提供一定程度的校正。
“强制”白平衡功能偏离其正常行为的基本技术是对白色以外的颜色执行白平衡。如果将非白色色调作为白色呈现给相机，则传感器增益电路将尝试将输出推向相反（或互补）颜色以补偿非白色色调。实际上，改变红色、绿色和蓝色通道的相对幅度以将颜色再现为白色，同时将图像中的其他颜色推向相同的互补色调。例如，通常可以通过校准红色参考目标来平衡具有无法被相机电路校正的偏红色调的图像。为了将红色目标再现为白色，传感器的蓝色和绿色像素输出都增加了，添加了补偿红色所需的互补青色色调。按照类似的逻辑，黄色目标上的色彩平衡会导致整个图像添加蓝色。这种色彩平衡技术的应用需要仔细分析，以确定可以有效地添加或减去哪种色调来纠正图像问题。
在给出图5是从色偏作为掩模或制备错误的结果遭受的标本数数字图像。图 5(a) 所示的集成电路（在反射光微分干涉对比中成像）在表面上包含一个氮化硅钝化层，其作用类似于黄色滤光片。从芯片表面反射的波前必须通过涂层才能到达物镜，许多较短的波长（蓝色和绿色）被阻挡。通过在图 5(a) 中黄色箭头指示的点上校准数码相机的白平衡，钝化层产生的黄色色偏在很大程度上被消除，从而产生具有出色色彩平衡的图像（图 5(b))。同样，图 5(c)中描绘的（美国椴木树）的过度染色的薄片可以以相同的方式进行校正。在没有组织的区域中选择一个像素进行白平衡校准（参见黄色箭头；图 5（c））产生具有干净、白色背景和很好饱和色彩的图像（图 5（d））。荧光样品制备通常可以将未结合的荧光团渗入周围的安装介质中，以产生类似的“过度染色”效果，如图 5(e) 所示的蕨类薄片。使用复染特征上的像素设置白平衡数码相机校准（图 5（e）中的黄色箭头）) 通常会减少最终图像中的背景荧光量（图 5(f)）。
为了应用上述技术，多种滤色器通常可用于透射光配置。专为彩色照相印刷设计的滤光片组适用于此目的。这些集包含每种原色的一系列密度，可以组合以产生所需的任何色调。对于反射光显微镜，非白平衡需要合适的反射颜色参考。目标没有必要符合任何颜色标准，通常需要进行实验才能产生所需的结果。可以使用任何有色的反射表面，但希望具有广泛的色调和饱和度变化范围。家庭中心或油漆店提供的油漆颜色样本卡非常适合此目的，因为它们几乎以所有可以想象的颜色变化提供。在某些情况下，样本本身的选定区域可用于设置离色白平衡校准。
无论是在透射光中使用过滤器还是在反射光中使用反射目标（例如油漆样品卡），操纵相机白平衡功能的概念都是相同的：非白色的白平衡校准将导致相机的电路移除目标颜色并将其渲染为更中性的灰色色调。在大多数情况下，只需要细微的变化，实验将确定目标的色调和饱和度，这将对整体图像平衡产生必要的变化。平衡淡蓝色会导致整体变暖效应，或向红色转变。相反，使用浅红色作为参考会产生向冷色平衡的蓝色转变。其他颜色校正遵循相同的一般逻辑。对任何给定颜色执行白平衡往往会导致相机的电路将颜色平衡移向补色。需要强调的是，这些非常规色彩平衡技术是在常用方法失败时（由于与特定样本制备、光源或成像设备相关的原因）实现预期结果的潜在机制。在这些情况下，仍然有可能通过偏移相机对样本调色板的响应来获取可接受的图像。需要强调的是，这些非常规色彩平衡技术是在常用方法失败时（由于与特定样本制备、光源或成像设备相关的原因）实现预期结果的潜在机制。在这些情况下，仍然有可能通过偏移相机对样本调色板的响应来获取可接受的图像。需要强调的是，这些非常规色彩平衡技术是在常用方法失败时（由于与特定样本制备、光源或成像设备相关的原因）实现预期结果的潜在机制。在这些情况下，仍然有可能通过偏移相机对样本调色板的响应来获取可接受的图像。
虽然最初获取具有适当色彩平衡的图像总是更可取的，但通过图像编辑软件应用后处理操作，在获取后可以进行一定程度的校正。这些程序不能替代适当的相机内白平衡，必须谨慎使用以避免样本再现中出现不可接受的变化。色彩平衡的一般改变会影响图像的所有区域，但这有时是可以接受的折衷方案，因为微小的变化会产生相对较大的背景色调变化，而对颜色更深的样本特征的影响较小。
根据所需的控制级别，在图像编辑程序中对色彩平衡进行的调整可以采用不同的形式。可以通过改变每个通道的输入和输出值之间的关系直接对红色、绿色和蓝色通道进行操作，或者可以对组合的 RGB 信号进行修改。采集后色彩平衡过程的细节可能因方法和所采用的特定软件而异。下面针对流行的软件包 Adobe Photoshop 描述了几种用于图像调整的技术，尽管可以使用提供类似功能的任何图像处理程序。
许多图像编辑程序提供了多功能性，并且可以对色调平衡、饱和度和其他特性进行高度控制。在许多情况下，快速简单地更改色彩平衡足以纠正小问题，并且可以通过图像调整菜单的色阶或曲线窗口访问 Photoshop 。在任一窗口中，三个吸管图标出现，可以通过鼠标单击单独选择。选择吸管工具后，鼠标光标可用于通过单击图像区域来采样图像像素的颜色值。左右滴管建立白色和黑色图像值，而中央滴管工具控制图像的中间色调（灰度）值。中间调灰度选择器为快速校正色彩平衡问题提供了最直接的方法。
图 6 显示了使用Photoshop 中的色阶功能对显微镜中捕获的几个数字图像进行的色彩平衡调整。图 6(a) 中的成纤维细胞是使用卤钨照明记录的，光路中没有日光过滤器，因此整体呈淡黄色。在没有细胞结构的区域（图 6(a) 中的黄色箭头）上使用中间色调滴管设置，可以有效地从处理后的图像中去除色偏（图 6（b））。或者，白色水平滴管设置可以消除由卤钨照明在染色薄切片中产生的黄色色偏（图 6(c)和 6(d)）)，而黑电平设置用于降低荧光图像上的过度染色水平（图 6(e) 和 6(f)）。在后一个示例中，滴管工具可用于在具有不同程度红色背景水平的像素之间进行选择，以最大限度地减少不需要的荧光。
与色阶功能类似，Photoshop软件中的曲线调整选项提供了一种通过在图像区域中选择来指定白色、黑色和灰色值的简单直接方法，以及启用图像伽玛的交互式调整。如上所述，还可以通过“级别”选项以类似方式执行色彩平衡调整。打开要修改的图片文件后，在菜单栏中选择Image/Adjust/Curves，打开Curves调整窗口。通过单击鼠标光标选择中间的吸管按钮，然后评估图像以确定应呈现为中性灰色调的区域。单击此区域应使图像达到大致正确的色彩平衡。
使用“级别”或“曲线”Photoshop 工具时，请确保预览复选框被选中，这样更改会立即反映在图像中进行评估。通过反复点击图像中的不同区域，通常可以找到合适的灰度值，从而产生可接受的色彩平衡。在某些情况下，图像中不存在适当的灰度或中间色调值，在这种情况下，黑色或白色级别的吸管选择器可能会产生更好的结果。这些以类似于中间调平衡操作的方式使用。在选择图像中的黑色或深色区域之前，应先单击左侧滴管按钮（在软件中出现一半充满黑色墨水），而单击右侧滴管则可以在图像上进行平衡。图像中的白色区域。通过实验，
在调整色彩平衡之后，可以通过操纵伽马曲线特性来修改图像亮度和对比度。在图形区域曲线窗口使曲线可以通过在拖动时单击并按住鼠标光标来重新形成任何形状。通过对组合的 RGB 曲线进行操作，最容易产生图像亮度和对比度的整体变化，这对色彩平衡（预先调整）的影响最小。但是，可以通过从下拉菜单中选择每个通道并通过拖动鼠标光标来重塑该通道的曲线来更改各个红色、绿色和蓝色通道的伽玛值。当然，对各个颜色通道的这些调整会对相对颜色值产生影响，并提供另一种技术来微调和评估颜色平衡变化。
当达到适当的色彩平衡时，在曲线调整窗口（或其他图像调整功能）关闭之前，已应用的校正可以保存以供其他图像使用（例如，可能在类似条件下获得的图像）状况）。即使这些图像没有合适的中性或白色区域，这种技术对于应用于具有相似色彩平衡缺陷的一系列图像也很有价值。如果一系列图像中的一个图像具有适合平衡的灰度值，或者可以通过曲线操作进行初始校正，则相同的校正通常适用于相似的图像。要应用保存的校正，打开目标图像，并从曲线（或色阶）) 调整窗口，加载保存的文件。一旦应用了校正因子，就可以评估图像以确定是否需要额外的曲线调整。
一系列使用 Photoshop曲线功能校正的数字图像如图 7 所示。图 7(a) 中染色的人体组织具有黄色偏色，通常出现在伊红和苏木精染色的标本中。使用白电平吸管工具选择一个背景区域（图 7(a) 中的黄色箭头），以类似于双镨滤镜和传统胶片的方式呈现具有适当色彩平衡的图像（图 7（b））。在光路中用日光滤光片记录的相衬图像中存在的蓝色调（图 7（c））可以去除（图 7（d））) 通过使用中间调滴管选择曲线调整的背景区域。最后，放射虫骨骼的霍夫曼调制对比图像中的绿色背景（图 7（e））可以使用中间色调滴管工具轻松去除（图 7（f））。
一种称为近似颜色一致性的现象使个人能够在精神上纠正照明的变化，使“已知”为白色的物体看起来是白色的。发生这种色彩再现适应的程度取决于视场中是否存在参考光源。在日常情况下，当观看者沉浸在主光源中或被主光源包围时，可以很容易地进行调节。例如，一张白色的纸在户外阳光下看是白色的，如果带进室内在昏暗的钨丝灯下看，它仍然是白色的。尽管在白炽灯下观察时纸张反射的长波长黄光和红光要多得多，但这种潜意识的调整还是会发生。在观看彩色照片或电视时通常不会进行色彩平衡调节，因为作为参考的其他光源存在于周围环境中。一般来说，物理现实和感知之间存在许多可能的差异，了解这些因素对于在显微镜中捕获的图像进行正确的色彩平衡很重要。
因此，在评估和调整色彩平衡时，最后要考虑的是观看环境对色彩感知的影响。如果在计算机显示器上查看图像，应仔细校准显示器的显示参数，无论是在计算机软件中还是在显示器硬件的亮度、对比度等调整方面。如果使用多个监视器，这些变量就特别重要，例如，如果一个显示器专用于显微镜上的数码相机，而另一个显示器用于打印机或替代输出设备，则可能会出现这种情况。当通过比较涉及不同的显示方法或在不同的光照条件下进行颜色判断时，必须考虑这些因素。例如，在监视器上查看捕获的图像可能会产生不同的色彩平衡印象，具体取决于监视器是在黑暗的房间中使用，而不是在充满日光或明亮荧光灯的房间中使用。类似地，对显微镜载玻片的整体色偏进行视觉评估，例如因染色渗入封固剂而导致的色偏，将其置于窗口时与使用钨灯观察时的外观完全不同。在光学显微镜中获取正确的色彩平衡图像最终涉及确定在捕获过程中如何记录样本颜色以及在捕获前后如何感知样本颜色的相互作用组件。
总之，显微镜照明源和胶片乳剂或图像传感器校准之间缺乏适当的色温平衡是显微摄影和数字成像中意外颜色偏移的最常见原因。如果光源的色温对于胶片或传感器特性来说太低，则所得显微照片和数字图像将整体偏黄或偏红，并且会显得温暖. 另一方面，当光源的色温过高时，产生的图像会偏蓝，看起来很冷。不匹配的程度将决定这些颜色偏移的程度，较大的差异会导致颜色变化的极端情况。固态数码相机系统会出现相同的效果。尽管这些颜色偏移看起来有问题，但通过正确使用转换和光平衡过滤器，或者通过正确校准数码相机的白平衡电路，它们总是很容易纠正的。
