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在尼康A1 si共聚焦显微镜中，进入检测器的荧光发射光首先通过专有的衍射效率增强系统（简称DEES），该系统使用偏振光将入射的非偏振发射光分成两个正交偏振光波前（称为p和s）。分束器。DEES系统的目的是通过用于将荧光发射分离成分量波长的光栅来提高光衍射效率。离开分束器后，p波前旋转 90 度（变成s-偏振波）使用棱镜系统，然后两个光束被三个可互换光栅之一衍射。衍射光栅可以精确控制以确保高水平的再现性，其波长分辨率为 2.5、6和10纳米。
本程序使用安装在光栅轮中的 2.5 纳米衍射光栅进行初始化，传入的非偏振光通过DEES偏振单元。偏振光被光栅衍射并通过双反射镜引导到 32 通道光电倍增管，双反射镜独立作用于每个光束，但会聚在检测器的光电阴极上。DEES 配置示意图正上方是增强型黄色荧光蛋白 (EYFP) 的全分辨率光谱，并由仪器以衍射光栅指示的波长增量进行检测。为了操作程序，使用按钮选择衍射光栅并观察 EYFP 光谱和检测带宽的变化。该放大按钮产生移动通过分束器和偏振旋转器的波前的特写视图。
用于光谱成像的最通用的共聚焦显微镜配置可以通过利用多通道光电倍增管在使用衍射光栅分散后收集有限大小的荧光发射波段来显着提高收集 lambda 堆栈的采集速度。这种采集策略适用于尼康C2+和A1 HD25/A1R HD25 共聚焦仪器，它们都能够通过单次扫描进行高速光谱采集。多通道光电倍增管（通常称为多阳极这些仪器中的光电倍增管）包含一个内置于单个单元中的单个10纳米检测通道的线性阵列，这使得多个发射带能够并行成像，从而严重限制了样品的光漂白和光毒性。尼康光谱检测单元具有多个采样增量为 2.5、5（或6）和10纳米的衍射光栅，这些光栅可以单独旋转到光路中以调整lambda部分的光谱带宽。然后将分散的发射传递到 32通道多阳极光电倍增管中精确定义的通道，以从每个通道生成单独的图像。荧光发射的总带宽由衍射光栅采样增量决定：2.5 纳米采样产生 80纳米带宽，5纳米光栅产生 160纳米带宽，而6纳米光栅产生192纳米带宽，10纳米光栅产生320纳米波段。在尼康仪器中，光谱成像检测器使用激光屏蔽机制来消除来自激发源的反射激光，并且可以倾斜衍射光栅以选择任何子采样带宽。
高性能光谱成像共聚焦显微镜的先进功能包括尼康独特的专有衍射效率增强系统 (DEES)，该系统旨在消除偏振伪影、减少光栅的波长损失并捕获最大量的荧光发射。DEES系统通过使非偏振荧光发射通过偏振双分束器光学元件来产生两个分量波前，称为p和s，它们分别平行于和垂直于入射平面。最熟练的衍射效率是用s偏振光观察到的，因此偏振旋转器位于p的路径中-偏振光产生s-偏振光，极大地提高了光栅系统的效率。如图 1(a) 所示，p偏振光的衍射效率在450到 675 纳米的波长范围内超过90%。相比之下，s的效率- 偏振光在450纳米时为 80%，在675 纳米时几乎线性下降到大约45%。因此，尼康 DEES 系统可以显着提高光谱检测单元的光通量，从而提高灵敏度。在必须调整光谱宽度的情况下，可以进行额外的样本扫描，或者可以组合相邻的检测器通道（称为分档）以将检测带的宽度增加一倍、三倍或四倍。
尽管基于狭缝的光谱成像共焦仪器能够以高分辨率对发射光谱进行成像，但与配备多阳极光电倍增管的显微镜相比，它们的速度相对较慢。即使是那些具有镜像狭缝以将一部分带宽反射到第二或第三光电倍增管的仪器，在活细胞成像所需的时间尺度上仍然缺乏成像速度。在许多情况下，在基于狭缝的系统中测量超过 200 纳米的光谱可能需要几分钟或更长时间，从而阻碍了在整个成像期间经历时间运动的样本的光谱成像。提高光谱成像显微镜性能的先进功能之一是基于多阳极的显微镜中的灵敏度校正（见图 1(b)）。这些仪器使用发射线和基于可追踪光源的光度调整针对每个单独通道的波长精度进行校正。此外，光纤元件的末端和探测器表面都涂有专有的抗反射剂，以减少信号损失并实现高光传输。最后，先进的双积分信号处理（DISP) 技术已添加到图像处理电路中，以提高电气效率，防止在数字化仪处理像素数据和重置时出现信号丢失。因此，在整个像素驻留时间内监控信号，从而显着提高信噪比。事实上，这些组合技术能够以每秒24帧的速度进行 32 通道光谱成像（512 x 512 像素），速度足以满足各种活细胞成像应用的需求。
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