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在基于荧光的典型光谱成像实验中，样本中通常存在多种荧光团，每个荧光团标记不同的结构。在该标本的整个图像中，根据荧光团在目标细胞器或大分子中的空间分布，可以单独或作为混合物找到它们。线性分解分析的目的是确定每个荧光团对图像每个像素的相对贡献。本程序探讨了如何在三重标记样本的复杂混合物中识别单个荧光团。
本程序使用出现在窗口图中的复杂光谱数据集和位于右上角的三重染色样本的图像进行初始化。为了操作程序，在样本图像窗口中单击并将靶心光标拖动到感兴趣的点。当光标在图像上平移时，各种探针的光谱图会发生变化以反映它们在该特定区域的浓度（由程序窗口下部的进度条表示。白色曲线是添加的光谱，而红色曲线代表 EGFP，绿色曲线代表 Alexa Fluor 488，蓝色曲线代表 Alexa Fluor 514。点击红色的Auto按钮以将光标重新定位到包含 100% 该荧光团的样本区域。
线性解混计算的基本概念相对简单。光谱图像中的每个像素被归类为代表荧光团信号（强度）的混合物时所测量的光谱（I(λ)）可被去卷积成比例，重量或浓度(C)的当值相加时每个单独的荧光团参考光谱 (R(λ))。因此，纯荧光团的每个参考光谱都被描述为Ri(λ)，其中 i = 1,2,3.....n 表示荧光团的指数 (C1)。对于特定数量的荧光团 (n)，这种关系可以表示为：
I(λ) = C1•R1(λ) + C2•R2(λ) + C3•R3(λ) + ........ + Cn•Rn(λ)
或者更简单：
I(λ) = ∑i Ci•Ri(λ)
实际上，每个像素的信号强度（I) 光谱图像中的 λ 堆栈的采集过程中被确定和记录，已知荧光团的参考光谱是在单独的控制样本中独立测量的，这些样本仅用单个荧光团标记，使用相同的样品制备技术和仪器设置。然后可以通过计算它们对测量光谱中每个点的单独贡献，将样本中各种荧光团的总体光谱贡献确定为简单的线性代数矩阵练习，如上述等式中所述。对于许多市售的线性解混软件包，通过输入参考光谱轮廓并使用逆最小二乘拟合方法来最小化测量光谱和计算光谱之间的平方差来获得解决方案。
为了确保在应用线性分解算法时获得成功结果的最佳机会，必须满足几个实验标准。最重要的考虑因素之一是确保光谱检测通道的数量至少等于样本中存在的荧光团的数量。不满足此规范可能会导致光谱分离计算的多种解决方案，并且可能无法获得唯一的结果。线性分离的另一个关键要求是，在计算中必须考虑样本中存在的所有荧光团，否则结果可能会偏向主要（最集中）的荧光团，而牺牲了较低浓度的物种。讽刺地，在计算中包括与 lambda 堆栈中的任何荧光团都不匹配的光谱不会影响线性分离结果（零贡献将分配给缺失的荧光团）。最后，自发荧光和/或高背景水平也应在光谱上定义（如果可能）并作为额外的荧光团处理，以获得最佳结果。可选地，还可以计算误差项并将其输出为误差残差图像。
对于两种不同但高度重叠的假设荧光团的混合物，添加荧光团光谱所涉及的线性如图 1 所示，它们的发射最大值位于橙黄色（荧光团 1）和橙红色（荧光团 2）光谱区域。图 1(a) 到 1(c) 中的黑色曲线代表两种荧光团在不同浓度下的总光谱：图 1(a) 1 到 1；图 1(b) 0.5 比 1；和图 1(c) 1 到 0.5。尽管图 1 中显示的光谱仅代表三种荧光团组合的示例，但只需将强度作为浓度的函数相加，就可以轻松预测这两种荧光团的每种可能组合的总光谱。请注意，总光谱的峰值随组分荧光团的比例而变化，因此图 1(a) 中的最大值为 594 纳米，图 1(b) 中为 598 纳米，图 1(c) 中为 589 纳米。应该强调的是，线性分解利用了整个光谱曲线，而不仅仅是峰值位置。强大的算法，例如用于光谱核型分析和共聚焦显微镜的算法，还可以通过复杂的曲线分析和校正来处理微小的光谱偏移。
在分析标有两个荧光团的样本的光谱内容时，与图 1 中的类似，最简单的方法是将来自任何特定像素的总光谱与位于光谱参考库中的所有可能总和组合相匹配。例如，如果测得的总光谱与图 1(a) 中的黑色曲线非常接近，则表明该像素包含来自每个荧光团的 50% 的贡献，并且它们均匀地混合在样本（至少对于那个像素）。类似地，如果总光谱与图 1(b) 中的黑色曲线相匹配，则可以假设该像素包含 66% 的荧光团 2 和 33% 的荧光团 1。因此，可以总结出，线性分解是通过将表示图像中测量的总光谱的矩阵与根据软件应用的最佳拟合参数的预测光谱参考库进行比较来进行的。一旦确定了每个荧光团的光谱贡献，就可以将 lambda 堆栈分离为每个荧光团的单独图像。制造商最常使用点扫描共聚焦显微镜来实现光谱成像，包括尼康的A1 HD25/A1R HD25和C2+系统。
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