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微分干涉对比 (DIC) 光学组件的正确调整和对齐对成像性能至关重要，因此显微镜师必须识别未对齐和组件不匹配，并采取必要的步骤来纠正这些错误。本交互式程序检查 DIC显微镜中各种构型图案下的锥光和正视视场，并讨论了为获得满意的显微镜对准而推荐的许多重要方面。
本程序使用置于锥光观察模式（模拟虚拟相位望远镜或伯特兰透镜）的虚拟 DIC显微镜进行初始化，并且仅将偏振器和分析器（透射轴交叉）插入到光路中。此外，聚光光阑在初始化时已关闭至其最宽孔径尺寸的 80%。 要操作本程序，首先从位于视口左侧的一组成像模式单选按钮中选择一种 DIC 技术，诺马斯基或德塞纳蒙。接下来，从物镜放大下拉菜单中选择一个物镜（默认为 10 倍）。 请注意，选择一个新的目标时，在显微镜的视口的增加观察到的或成比例地减小聚光镜孔径光阑的尺寸。使用聚光镜膜片滑块以改变孔径光阑的开口尺寸。
要在光学系统中安装 诺马斯基 棱镜，请使用物镜棱镜或聚光棱镜单选按钮。当这些单选按钮之一被选择时，该视口显示一个单一的诺马斯基棱镜，这在取决于目的选择尺寸而变化的锥光图像。 如果已选择物镜棱镜，滑块将更改以显示文本：物镜棱镜平移，当显微镜处于 诺马斯基 模式时，或偏振器方向，当显微镜处于 德塞纳蒙 模式时。如果选择了聚光棱镜，当显微镜处于德塞纳蒙模式时，偏光器方向文本将出现，但当显微镜处于诺马斯基模式时，滑块将不活动。
在 诺马斯基或德塞纳蒙成像模式中，滑块可用于改变引入光学系统的偏置延迟。 在诺马斯基模式（仅当选择目标棱镜），该目标棱镜翻译滑块最初处于中心位置没有添加偏压。 将滑块向右平移会引入负偏差，而将滑块移动到中心左侧会产生正偏差。 本程序在 德塞纳蒙 模式下以相同的方式运行，不同之处在于可以选择任一棱镜，并且偏振器方向滑块还指示偏振器从中心位置旋转的度数。
要将两个棱镜（聚光镜和物镜）添加到虚拟 DIC 显微镜光学系统，请在诺马斯基或德塞纳蒙 成像模式下选择两个棱镜单选按钮。 然后可以使用物镜棱镜平移（诺马斯基模式）或偏振器方向（德塞纳蒙 模式）滑块来调整偏置。 为了一阶补偿板添加到光学路径，放置在补偿复选框复选标记。 在上面所讨论的所有情况下，虚拟DIC显微镜可以通过选择无畸变单选按钮被放置在无畸变模式。 然后，视口将显示当虚拟 Bertrand 透镜从光路中移除时场的显示方式。
在尝试配置显微镜以进行微分干涉对比观察之前，请检查仪器以确定是否存在所有必要的组件，并且没有棉绒、灰尘和碎屑。包含应力特征的物镜和聚光镜元件会降低 DIC 中的图像质量，也会使透镜表面变脏、划痕和光路中的异物污染。显微镜的正确对准对于获得最佳结果和产生显示伪三维和阴影投射效果的图像至关重要。以下过程中概述的许多步骤仅在首次将显微镜对准 DIC 时才需要，不需要重复进行日常观察。每次将显微镜用于 DIC调查时，应采取其他步骤。
初步显微镜检查- 仔细检查显微镜，确保所有必要的 DIC 组件都已安装，或在必要时可用并准备好使用。拆下聚光镜，拆卸转塔，并检查 诺马斯基 或 沃拉斯顿 棱镜的状况。这些复合棱镜的表面应该干净，没有灰尘和碎屑。由于它们安装在聚光器转盘内，DIC 聚光棱镜很少被指纹污染，但灰尘和棉绒很容易流入转盘并落在其中一个平坦的石英表面上。要清洁受污染的棱镜表面，请使用橡胶气球去除松散的纤维和灰尘，和/或用镜头纸或湿软棉轻轻擦拭表面。小心不要刮伤表面。应给予物镜棱镜相同的处理，聚光镜和物镜外部透镜元件、显微镜目镜透镜和显微镜底部视场光阑端口处的物镜（或连接到倒置显微镜的支柱）。确保关键部件清洁后，重新组装显微镜，安装偏光器和分析器，然后将光学系统对准科勒照明。
安装偏光器和分析器- 拆开显微镜（聚光镜、DIC 棱镜和至少一个物镜移除），分别将偏振器和分析仪安装在聚光镜下方和物镜上方的位置。以类似于偏光显微镜的方式，偏光器和分析器的位置使它们的透射方位角彼此交叉成 90 度角（垂直）。安装在光源和聚光镜之间的偏光器传统上是面向东西方向的，或者当面对显微镜时从左到右。在某些情况下，偏光器和检偏器的位置由它们在安装框架中的固定位置预先确定，这些组件只能以单一方向插入显微镜光路中。通常，偏光器支架上的标记指示透射方向，但有些显微镜配备了以度为单位的旋转偏光器支架。分析器也可以用刻度旋钮旋转，和/或可以包含指示传输轴的标记。
当偏振器和分析器交叉时（透射轴以 90 度角定向），通过目镜观察时，视场显得非常暗。这种情况被称为最大灭绝.如果大量光线穿过显微镜并且视野不暗（或几乎是黑色），请检查以确保偏振器和分析器交叉。穿过偏光镜后，插入聚光镜和物镜，但不要安装物镜 诺马斯基 棱镜滑块（或固定安装座）。将聚光镜转盘旋转到明场位置（没有相位板或 DIC 棱镜的插槽）。视场应该保持黑暗，但如果这些组件（聚光镜或物镜）中的任何一个包含应变的透镜元件，一些光线可能会通过。在进行下一步之前，从光学系统（偏振器或分析器）中取出一个偏振元件。
建立科勒照明- 在进行 DIC 配置之前（安装偏光片后），应使用标准科勒技术对准显微镜光学系统以进行明场标本观察。正确配置后，光源（通常是卤钨灯）的图像应通过安装在灯箱中的聚光透镜或沿着显微镜框架底座内的光学系统投射到聚光器孔径光阑平面上。同时，聚光镜系统还将视场光阑的图像投影到样品共轭平面（在显微镜阶段）。在灯丝居中后（大多数现代灯箱都包含一个预先居中的灯），0或B位置）。将隔膜聚焦，使用 10 倍物镜叠加在聚焦标本上，然后打开虹膜叶，直到在视场的外围边缘只能看到一小部分隔膜。对所使用的每个物镜都采取类似的步骤，通过调整视场和孔径光阑，确保依次为每个物镜正确配置显微镜以进行科勒照明。在 DIC 的日常观察过程中，应定期检查显微镜以确保保持科勒照明。
检查物镜后孔径- 为柯勒照明配置显微镜后，插入偏振器和分析器，并用相位望远镜或伯特兰透镜（锥光观察模式）检查物镜后焦平面。如果偏振器和分析器的位置正确且显微镜完全对齐，则物镜孔径中将出现暗消光十字，如图 1(a) 所示。消光十字的臂应垂直和水平定向，在光圈的四个角出现少量光线（图 1（a））。十字或高双折射区域中的亮点会影响消光十字的完整性，是光学应变的指标。此外，在物镜后孔处观察时，位于共轭孔径焦平面（聚光镜或物镜）附近的灰尘和棉绒颗粒会显得很亮。如果存在双折射点，请检查另一个无应变物镜以确定第一个物镜或聚光镜系统是否应变。在进行下一步之前，清除物镜或聚光镜表面上的任何污染灰尘并更换紧张的光学组件（如果可能）。
物镜 DIC 棱镜对准- 通过插入滑块或限制在固定安装座上的棱镜来安装物镜棱镜（对于利用 德塞纳蒙 偏置延迟的系统）。一旦棱镜就位，用相位望远镜或伯特兰透镜再次检查物镜后焦平面。视场现在应该看起来非常明亮，但没有特征，有一条暗干涉条纹沿着剪切轴以 45 度角（见图 1（b））延伸穿过孔径的直径. 根据显微镜是直立还是倒置，干涉条纹将在东北-西南（直立）或西北-东南（倒置）方向上穿过物镜后孔。在任何一种情况下，干涉条纹都应该被很好地定义，如图 1(b) 所示，并位于孔径的中心。
在某些 DIC 显微镜设计中，物镜棱镜是固定的（德塞纳蒙补偿），而在其他设计中，棱镜可以通过滑块框架中的定位螺钉机构在光轴上来回平移。在后一种情况下，在通过望远镜或伯特兰透镜观察物镜后焦平面的同时，慢慢转动调节旋钮。转动旋钮时，干涉条纹应远离其中心位置移动到明亮后孔的上半部分或下半部分。或者，转动 德塞纳蒙 补偿器中的偏光器将产生相同的效果。
聚光镜DIC 棱镜对准- 从光学系统中取出物镜棱镜，并通过旋转聚光镜转台将最低孔径的聚光镜棱镜（用于 10 倍物镜）摆动到位。合适的位置通常用炮塔上的红色或白色10设置（或类似的代码，如L）。重新聚焦相位望远镜或伯特兰透镜，观察出现在物镜后焦平面上的干涉条纹。再一次，单个条纹应该与物镜棱镜产生的条纹具有相同的方向（正置显微镜的东北-西南或倒置显微镜的西北-东南）。聚光镜和物镜棱镜的干涉条纹应该看起来几乎相同，并且沿着剪切轴具有相同的方向。
为了使用专为油浸设计的高数值孔径聚光镜清楚地观察聚光镜棱镜干涉条纹，可能需要使用摆动镜头控制杆卸下前镜头组件。如果出现在物镜孔径中的条纹位置不正确，则可能需要调整聚光棱镜的方向或对准。在大多数情况下，聚光镜棱镜组装在带有凹槽或销（或锁定螺钉）的保护性圆形铝制框架中，以确保在聚光镜转盘内正确定位。有时，聚光棱镜可能会在没有正确对准的情况下被迫进入转塔，这在检查干涉条纹时会很明显。如果聚光棱镜看起来没有对齐，
标本观察- 将显微镜对准科勒照明，将偏振器和分析器交叉，并安装两个棱镜（物镜和聚光镜），在载物台上放置一个薄的透明样品（例如颊上皮细胞制剂）。调整显微镜以获得最大消光，并在通过目镜以正视模式（无伯特兰透镜或相位望远镜）观察过程的同时聚焦样品。在视场中观察到的图像应该看起来非常深灰色，几乎是黑色，在最大消光处，在具有清晰定义的厚度或折射率梯度的区域（例如，细胞膜和细胞核；参见图 2（b））具有明亮的高光。具有高折射率的球形样品，例如浸油滴，甚至可以充当微小的透镜，
在观察聚焦标本图像时，使用滑块旋钮平移物镜 DIC 棱镜或在配备 德塞纳蒙 补偿的显微镜中旋转偏振器（或分析器）。这个动作被称为引入偏置延迟，并将沿剪切轴平移将试样平分的干涉条纹，并对试样外观产生相应的变化。将棱镜向一个方向移动（正偏置）将使一侧边缘的样品特征变亮，同时使另一边缘的相同特征变暗，同时使背景变亮（见图 2（a））。一般而言，试样呈现伪三维外观，具有与剪切轴方向相同的阴影投射效果。将棱镜移动到显微镜光轴的另一侧（负偏压）将反转亮暗样品区域（比较图 2(a) 与图 2(c)）。
在所有 DIC 组件正确安装和对齐的情况下，当使用相位望远镜或伯特兰透镜（图 1（c））观察时，在最大消光度时，物镜后孔径呈现深灰色（几乎黑色）并且相对均匀。在大多数情况下，后光圈的中心区域呈现出漆黑的外观，而外围的四个象限中则出现了一些光线迹象。消光十字通常看起来与单独使用交叉偏振器观察到的非常相似，但通常更暗，并覆盖物镜后孔的更大区域。外围的明亮区域 (图 1(c)) 是由聚光镜和物镜中偏振器和透镜元件表面的光的部分去偏振引起的伪影产生的。
通过掩盖物镜后孔中消光十字周边的明亮区域，可以显着改善微分干涉对比度图像。这是通过减小聚光器孔径光阑的尺寸以消除亮边来实现的。一般来说，物镜后孔径尺寸应随光圈减小到全孔径的大约 75% 或 80%。当光学系统完全对准时，消光十字出现直立（见图 1），可以观察到由两条宽干涉条纹组成，每条干涉条纹呈直角并在物镜后孔的中心相遇（条纹也可以在较低质量的显微镜中以正视模式进行可视化）。在某些显微镜下，可以调整聚光镜和物镜棱镜的位置，以产生更均匀的条纹图案，从而使孔径的中心区域显得更暗、更均匀。这个任务是通过松开和旋转（或升高或降低）聚光棱镜或通过将偏振器和分析器分开几度来完成的。有时显微镜包含固定螺丝，可以调整聚光镜和物镜棱镜，但配备这种设备的型号变得越来越少。作为对显微镜对准的最后检查，调整聚光镜聚焦旋钮，同时检查物镜后孔中的消光模式，以确定是否可以改进。
通过平移物镜棱镜或在德塞纳蒙 配置中旋转偏振器来调整偏置延迟，显着改善了图像外观（在最大消光时观察到的）并增加了对比度。这种操作对于微分干涉对比中的样品成像至关重要，并且代表了显微镜光学系统调整的最后一步。在许多情况下，观察 DIC 图像时，整个视野都会出现光梯度。除了在样品的相对边缘存在明暗强度之外，还会发生这种情况，这是由于光学系统产生的宽且模糊的场条纹伪影。具有匹配良好的光学元件的显微镜可最大限度地扩大场条纹的尺寸，它可以变得如此广泛和均匀分布，以至于整个领域都呈现出均匀的中灰色。然而，在大多数情况下，边缘的一些证据仍然存在，并且视场显示出从一个外围边缘到另一个外围边缘的浅梯度光强度（中等至浅灰色或深灰色阴影）。这种伪影是特定光学配置所固有的，在观察和收集 DIC 标本的图像时应忽略。
还可以通过在 DIC 显微镜的光路中引入延迟板（或补偿器）来增加样品对比度。通常，全波（也称为一阶补偿器）板插入物镜棱镜和分析器之间的中间管中，尽管该板也可以位于偏振器之后但在聚光器棱镜之前。这些板在绿色区域（通常接近 550 纳米）的指定值处表现出整个波长的延迟水平，并导致样品沿折射率和厚度梯度显示黄色和蓝色牛顿干涉色。由于从白光中减去绿色波长，背景呈现为洋红色。
在 德塞纳蒙 或标准（可平移）诺马斯基 棱镜 DIC 显微镜配置中，当物镜棱镜与消光干涉条纹位于光路中心时，在物镜后焦平面（假设聚光棱镜从光路中移除）。如果然后将全波延迟板放置在物镜棱镜和分析器之间，则图 3(a) 中所示的干涉图案显示了牛顿干涉色的光谱，出现在物镜后焦平面上。从光路中取出物镜棱镜并插入聚光棱镜产生图 3(c) 中所示的图案。
在德塞纳蒙补偿器配置中平移物镜诺马斯基棱镜或旋转偏振器将改变图 3(b) 中所示的牛顿干涉图案颜色。引入负偏差会将牛顿颜色转换为减色值（黄色），而将棱镜转换为正偏差值将导致加色（蓝色）。样品梯度产生的颜色可以与 Michel-Levy 参考图进行比较，以确定光程差异的大小。
