
与传统光学显微镜相比,共聚焦显微镜具有多种优势,包括浅景深、消除离焦眩光以及能够从厚样品中收集连续光学切片。在生物医学科学中,共聚焦显微镜的主要应用涉及对通常用一种或多种荧光探针标记的固定或活细胞和组织进行成像。
当使用传统的宽场光学显微镜对荧光标本进行成像时,由标本发出的、远离感兴趣区域的二次荧光通常会干扰那些聚焦的特征的分辨率。对于厚度大于约 2 微米的样品,这种情况尤其成问题。共焦成像方法在轴向和横向分辨率方面提供了微小的改进,但仪器能够从图像中排除厚荧光标记标本中发生的“离焦”耀斑,这导致了最近的爆炸在技术的普及。目前大多数共聚焦显微镜都相对容易操作,并已成为许多多用户成像设施的基本仪器的一部分。LSCM) 比传统的宽视场光学显微镜要好一些,但仍远低于透射电子显微镜,它在某些方面弥合了两种更常用的技术之间的差距。图 1说明了基本共聚焦显微镜配置中的主要光路。
在传统的宽视场显微镜中,整个样本都沐浴在来自汞或氙气光源的光线下,图像可以直接用肉眼观察或直接投影到图像捕获设备或照相胶片上。相比之下,共聚焦显微镜中的图像形成方法根本不同。照明是通过扫描一束或多束聚焦光束来实现的,通常来自激光,穿过样品(图 2)。以这种方式扫描试样所产生的图像称为光学切片。该术语是指仪器收集图像的非侵入性方法,使用聚焦光而不是物理方法对标本进行切片。
共聚焦方法促进了更有用的活体标本成像,实现了三维(z 系列)数据的自动收集,并改进了使用多重标记获得的标本图像。图 3显示了常规落射荧光图像与用碘化丙啶染色的蝴蝶蛹翅上皮的整个安装的相似区域的共聚焦图像的比较。由于消除了离焦荧光耀斑,LSCM 图像中的原子核分辨率有了显着提高。
激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 是目前生物医学研究应用中使用最广泛的共聚焦变体。本介绍中重点放在 LSCM 上,因为它是新手用户最有可能遇到的设计。这些仪器的其他替代设计在生物成像领域的特定领域受到青睐。大多数样品制备协议都可以用于任何共焦仪器变体,以及用于生产光学切片的其他方法,如反卷积技术和多光子成像,稍加修改即可使用。
共聚焦显微镜的发明通常归功于 Marvin Minsky,他于 1955 年制造了一台工作显微镜。共聚焦方法的发展很大程度上是由对发生在活组织(体内)中的生物事件进行成像的愿望驱动的,而 Minsky目标是在活体大脑的未染色制剂中对神经网络进行成像。由明斯基提出并于 1957 年获得专利的共焦成像原理被用于所有现代共焦显微镜。图1说明了应用于落射荧光显微镜的共聚焦原理,它已成为用于荧光成像的大多数现代共聚焦系统的基本配置。明斯基的原始配置使用放置在锆弧光源前面的针孔作为点光源。
光点由物镜聚焦在样品中所需的焦平面上,穿过它的光由第二个物镜聚焦在与第一个针孔具有相同焦点的第二个针孔处(两者是共焦的) .任何通过第二个针孔的光线都会撞击一个低噪声光电倍增管,该光电倍增管会产生一个与来自样品的光线亮度相关的信号。第二个针孔防止来自样品焦平面上方或下方的光到达光电倍增管。在比焦平面厚的标本中,使用空间滤波消除离焦光或耀斑是共焦方法的关键。在明斯基'
为了使用共焦原理构建图像,必须以某种方式在样品上扫描聚焦光斑。在明斯基制造的原始仪器中,梁保持静止,而样品本身在振动台上移动。这种布置的优点是扫描光束固定在显微镜的光轴上,可以消除大多数会影响图像的镜头缺陷。然而,对于生物标本,标本的移动会导致摆动和失真,从而导致图像分辨率的损失。此外,当载物台和标本移动时,不可能对标本进行各种操作,例如荧光标记探针的显微注射。
不管通过何种方式将照明光束扫描穿过试样,都必须产生试样的图像。明斯基的原始设计中并没有形成真实的图像,而是将光电倍增管的输出转换为没有记录功能的军用剩余长余辉示波器屏幕上的图像。在他的发明首次亮相后,明斯基后来写道,他的显微镜的图像质量不是很令人印象深刻,因为示波器显示的质量,而不是因为显微镜本身的分辨率很差。现在很明显,明斯基在 1955 年无法使用该技术来充分展示共聚焦方法的潜力,尤其是在成像生物结构方面。他表示,这可能是共聚焦显微镜没有立即被生物界接受的原因,生物界过去和现在仍然是一个对图像质量要求很高的群体。当时,他们拥有具有出色光学性能的光学显微镜,可以轻松地在高分辨率彩色胶片上查看和拍摄染色明亮且色彩丰富的组织学组织切片。在今天的共聚焦显微镜中,图像是从光电倍增管的输出连续构建的,或者使用包含电荷耦合器件的数码相机拍摄的,在计算机成像系统中直接处理,在高分辨率视频监视器上显示,然后输出在硬拷贝设备上,具有出色的效果。现代激光扫描共聚焦显微镜中的信息流如图所示图4。
几十年来,光学显微镜的基本光学原理基本保持不变,因为仪器实现的最终分辨率受光的波长、物镜和样品本身的属性控制。在过去的 20 年中,用于为标本增加对比度的染料以及与光学显微镜方法相关的其他技术有了显着改进。共聚焦方法的发展和改进是光学显微镜复兴的直接结果,而现代技术的进步在很大程度上推动了光学显微镜的复兴。许多本来有利于明斯基共聚焦设计的重大技术进步已经逐渐为生物学家和其他显微镜学家提供(或更实惠)。
这些技术是独立开发的,自 1955 年以来,已逐渐纳入共聚焦成像系统。例如,伍兹霍尔海洋研究所的研究人员在 1980 年代初期首次有效地应用了数字图像处理技术。使用他们所谓的“视频增强显微镜”,他们能够对微管等细胞结构进行成像,这些结构刚好超出了光学显微镜的理论分辨率。分辨率的明显提高是通过对使用连接到数字图像处理器的低光级硅增强目标 (SIT) 摄像机捕获的图像进行数字增强来实现的。使用微分干涉对比(DIC)对细胞结构进行成像) 光学,并且使用数字处理方法进一步增强了图像。
共聚焦显微镜设计的分类通常是根据扫描标本的方法进行的。扫描的两种基本方式是扫描载物台或照明光束,光束扫描至少有两种根本不同的方法。明斯基最初的设计是一个由原始音叉设备驱动的舞台扫描系统,构建图像的速度相当慢。从原始概念演变而来的当前阶段扫描共聚焦设计主要用于材料科学应用,例如微芯片行业。基于这一原理的系统最近在涉及筛选微芯片上的 DNA 的生物医学应用中变得流行。
对于大多数生物系统成像来说,一个更实用的替代方法是在静止样本上扫描照明光束。这种方法是许多系统的基础,这些系统已经演变成当今流行的研究显微镜。本介绍不涉及共聚焦显微镜的技术细节,但基本上使用了两种根本不同的光束扫描方法;多光束扫描和单光束扫描。单光束扫描是目前最流行的,也是 LSCM 中使用的方法。在这里,光束的扫描通常是通过使用由电流计以每秒一帧的速度驱动的计算机控制的镜子来实现的。为了在接近视频帧率的情况下实现更快的扫描,一些系统使用声光设备或振荡镜。另一种方法是使用两束光束近乎实时地进行扫描,并且通常依赖于使用某种形式的旋转 Nipkow 盘。这种系统源自串联扫描显微镜(TSM),经过改进,使它们更有效地从荧光标记的标本中收集图像。图5说明了一个这样的改进系统,它采用双 Nipkow 盘和微透镜来增强对实时图像采集的低荧光水平的检测。
目前有两种用于生产光学切片的共焦显微镜替代方法:解卷积和多光子成像。它们在技术上有所不同,但与共聚焦方法一样,都是基于传统的光学显微镜。去卷积使用基于计算机的算法来计算和去除荧光图像中的离焦信息。由于更高效的算法和更快的微型计算机,这种技术已成为成像的实用选择。多光子显微镜使用与 LSCM 相同的扫描系统,但不需要检测器处的针孔孔径。针孔是不必要的,因为激光仅在焦点处激发荧光染料标签,消除了离焦发射。
传统的光学显微镜构成了构建 LSCM 的基础。用激光代替钨灯或汞灯作为光源,并结合灵敏的光电倍增管(PMT)检测器和计算机控制扫描镜或其他扫描装置,便于采集和显示图片。采集后,图像被存储在数字媒体上,并且可以通过使用显微镜系统计算机或第二台计算机可用的众多图像处理软件包中的任何一个进行分析。
通过 LSCM 的设计,照明和检测仅限于样品中的单个衍射极限点。这个照明点由物镜聚焦在样品中,并在计算机控制下使用某种扫描设备扫描它。来自样品的光点序列由光电倍增管通过针孔(或在某些情况下,狭缝)检测,PMT 的输出被构建到图像中并由计算机显示。尽管可以使用从样品反射回来的光来观察未染色的样品,但它们通常用一种或多种荧光探针进行标记。
在 1990 年左右的文献中报道了商业上更成功的 LSCM 之一,它是为响应发育生物学家遇到的一个令人困惑的基本问题而设计的。免疫荧光标记胚胎内的许多结构和特定大分子在双细胞阶段后无法使用传统的落射荧光显微镜成像,因为随着细胞数量的增加,胚胎的总体积保持大致相同。这意味着随着细胞越来越紧密,任何给定的感兴趣的焦平面外的细胞发出的荧光增加会干扰图像分辨率。
一组研究这个问题的研究人员发现,当时可用的共聚焦系统都不能满足他们的需求。当时的技术包括产生图像太慢的载物台扫描显微镜,一张图像大约需要 10 秒,以及多光束扫描仪器,这在当时的发展中并不适用于荧光成像。LSCM 的设计适用于传统的落射荧光显微镜,并与在同一时期开发的其他几种仪器一起,成为生物医学界现在可以从几个商业供应商处获得的精密仪器的先驱。尼康的第一个共聚焦系统 PCM 2000,在Eclipse E1000 正置显微镜上进行了说明图6。尼康目前的激光扫描共聚焦显微镜包括A1 HD25/A1R HD25和C2+系列。
在开发的专用仪器中,可以通过调整光电探测器前面的针孔直径来改变光学部分的厚度。与使用固定针孔尺寸的其他一些设计相比,这种光学变化对于生物结构成像非常灵活。通过减小样本中扫描区域的面积,并将扫描信息放入相同大小的数字阵列中进行存储或显示(类似于在扫描电子显微镜中改变放大倍数的方式),可以在不损失分辨率的情况下放大图像)。这样做的能力为一个物镜提供了一系列放大倍数,并且在对可能遗漏的罕见或瞬态事件或必须更换镜头时丢失的位置进行成像时非常有用。
由于现在商业供应商提供的 LSCM 的复杂性和灵活性,近年来共聚焦显微镜的普及出现了巨大的爆炸式增长,许多多用户实验室购买这些仪器而不是电子显微镜。共聚焦显微镜的优势在于可以相对容易地从为传统光学显微镜制备的标本中获得极高品质的图像,并且在当前研究兴趣的许多领域有大量应用。
第一代 LSCM 对固定标本效果很好,但在使用来自激光的光能方面极其浪费,并且往往会杀死活标本,除非在成像时非常小心地保持它们的生存能力。尽管存在局限性,但显微镜产生的固定材料的图像非常好,以至于生物成像专家完全接受了共聚焦方法。在后续几代仪器中,成像过程的各个方面都进行了技术改进。此外,新型仪器的人体工程学和可用性得到了很大改进,因此现在通常由软件控制的校准、更改滤光片组合和调整激光功率都变得更加容易且耗时更少。现在最多可以同时对三种荧光染料成像,而且可以顺序成像。由于改进的、更可靠的软件以及具有更多磁盘存储空间和更多、更便宜的随机存取存储器的速度更快的计算机,图像处理阶段也得到了更高度的发展。