有机样品和无机样品对光的吸收和随后的再辐射通常是公认的物理现象(被描述为荧光或磷光)的结果。通过荧光过程发出的光几乎与激发光的吸收同时发生,这是由于光子吸收和发射之间的时间延迟相对较短,通常持续时间不到一微秒。激发光熄灭后,如果发射持续较长时间,则该现象称为磷光。
英国科学家乔治·斯托克斯爵士(Sir George G. Stokes)于1852年首次描述了荧光,当他发现矿物萤石在被紫外线激发时会发出红光时,就创造了这个术语。斯托克斯指出,荧光发射总是在比激发光更长的波长下发生的。19世纪早期的研究表明,许多标本(包括矿物质,晶体,树脂,粗制药物,黄油,叶绿素,维生素和无机化合物)在受到紫外线照射后会发出荧光。但是,直到1930年代,才开始在生物学研究中使用荧光染料对组织成分,细菌和其他病原体进行染色。这些污渍中的几种具有高度特异性,并刺激了荧光显微镜的发展。
荧光显微镜技术已成为生物学和生物医学科学以及材料科学中的必不可少的工具,这是由于传统光学显微镜在其他对比模式下不易获得的属性。荧光染料阵列的应用使得在非荧光材料中以高度特异性鉴定细胞和亚显微细胞组分成为可能。实际上,荧光显微镜能够揭示单个分子的存在。通过使用多个荧光标记,不同的探针可以同时识别多个目标分子。尽管荧光显微镜无法提供低于特定标本特征衍射极限的空间分辨率,
多种标本在受到辐照时会表现出自发荧光(不使用荧光染料),这种现象已在植物学,岩石学和半导体工业领域得到了充分利用。相比之下,对动物组织和病原体的研究通常会伴随着极其微弱或明亮的非特异性自发荧光而变得复杂。对于后者的研究,更大的价值是添加了荧光染料(也称为荧光团),它们被特定波长的辐射光激发并发射出确定强度和有用强度的光。荧光染料是附着在可见或亚可见结构上的污渍,通常在附着目标上具有很高的特异性,并且具有显着的量子产率(光子吸收与发射之比)。荧光显微镜利用的广泛增长与具有已知的激发和发射强度分布的新型合成和天然荧光团以及众所周知的生物靶标的开发密切相关。
荧光显微镜的基本功能是用所需的特定波长波段照射标本,然后从激发光中分离出弱得多的发射荧光。在正确配置的显微镜中,只有发射光才应到达眼睛或检测器,以使产生的荧光结构在非常暗(或黑色)的背景下以高对比度叠加。检测极限通常由背景的暗度决定,激发光通常比发出的荧光亮几十万至一百万倍。
在示出的图1中图2是配备了透射和反射荧光显微镜的现代落射荧光显微镜的剖面图。在图中心的垂直照明器的光源位于一端(标记为镜面灯箱),而滤光片转塔位于另一端。该设计包括一个基本的反射光显微镜,其中反射光的波长比激发光的波长长。约翰·普隆(Johan S. Ploem)致力于反射光荧光显微镜的垂直照明器的开发。在荧光垂直照明器中,特定波长(或定义的波长带)的光通常在可见光谱的紫外线,蓝色或绿色区域中,激励滤波器。通过激发滤光片传送波长从表面反射二色性(也称为二向色)反射镜或分束器,通过显微镜物镜到浴强光试样。如果样品发荧光,则由物镜收集的发射光会通过二色镜返回,并随后由阻挡(或发射)滤光片过滤,该滤光片会阻挡不需要的激发波长。重要的是要注意,荧光是光学显微镜中的模式,在这种模式下,样品在激发后会产生自己的光。不管激发光源的方向如何,发射的光都在所有方向上球形地重新辐射。
落射荧光照明是现代显微镜中压倒性的技术选择,并且反射光垂直照明器介于观察观察管和容纳物镜的物镜之间。照明器旨在通过首先使激发光穿过显微镜物镜(在这种配置中,起聚光镜的作用)将光引导到样本上),然后再使用同一物镜捕获发射的荧光。这种类型的照明器具有几个优点。荧光显微镜的物镜首先用作校正良好的聚光镜,其次用作成像聚光器。物镜/聚光镜是一个组件,始终处于对准状态。到达样品的大部分激发光没有相互作用就通过,并远离物镜,并且照明区域仅限于通过目镜观察到的区域(在大多数情况下)。与某些对比度增强技术的情况不同,将显微镜正确配置为用于科勒照明时,可以使用物镜的整个数值孔径。最后
正如在介绍图1中,反射光垂直照明器包括在其后端(通常是汞或氙燃烧器)的电弧放电灯箱。激发光沿垂直于显微镜光轴的照明器传播,穿过收集器透镜和可变的,可居中的孔径光阑,然后穿过可变的,可居中的视场光阑(见图1)。)。然后,光入射到激发滤光片上,在该处发生期望频带的选择和有害波长的阻塞。选定的波长在通过激发滤光镜后到达双色分光镜,该镜是一种专门的干涉滤光镜,可以有效反射较短波长的光并有效地透射较长波长的光。双色分束器相对于入射的激发光成45度角倾斜,并以90度角直接通过物镜光学系统反射到样品上。物镜收集照明样品产生的荧光发射,该物镜现在具有其通常的图像形成功能。因为发射的光比激发照明的波长更长,
到达二色镜的大部分散射激发光被反射回光源,尽管微量的光经常通过镜框的内部涂层并被其吸收。在发出的荧光到达目镜或检测器之前,它必须首先穿过屏障或抑制滤镜。该滤光片阻挡(抑制)任何残留的激发光,并通过所需的更长的发射波长。在大多数反射光照明时,激发滤光片,二色镜,和屏障过滤器被结合到光学块(通常被称为一个立方体),如在示出的图2中。现代荧光显微镜能够容纳四个到六个荧光立方体(通常在旋转的转塔上或通过滑块机构;见图1),并允许用户轻松地安装替换的售后激发滤光片和光栅滤光片以及双色镜。
垂直照明器设计应使用户能够调整显微镜以进行柯勒照明,从而在整个视场中提供明亮均匀的照明光圈。光学系统的已校正聚光镜应确保可居中孔径光阑的图像与聚焦物镜的后孔径共轭。在现代照明器中,预聚焦的可居中光圈的图像与聚焦的标本和固定目镜光阑的平面共轭。
照明器灯箱通常装有红外抑制滤光片。灯箱本身不应泄漏有害的紫外线波长,并且,如果在操作过程中无意中打开了外壳,则灯箱本身最好包含一个开关,以自动关闭灯。灯箱应足够坚固,以在操作过程中承受可能的燃烧器(电弧放电灯)爆炸。在现代的灯箱中,灯座配有调节旋钮,可将弧光灯图像居中在物镜的后孔内(在科勒照明中,这些平面是共轭的)。在光路中的某个位置,通常更靠近灯箱并位于激发滤光片之前,理想的是具有遮光器,以在不使用检测器观察或成像样本时完全阻挡激发光。此外,应提供中性密度滤光片(在车轮,转塔或滑块上),以使用户能够降低激发照明的强度。
当电子从激发态弛豫回到基态时,振动能量会丢失。由于能量损失,与吸收或激发光谱相比,激发的荧光团的发射光谱通常会移至更长的波长(请注意,波长与辐射能成反比)。这种有据可查的现象称为斯托克斯定律或斯托克斯平移。随着斯托克斯位移值的增加,通过使用荧光滤光片组合将激发与发射光分开变得更加容易。
荧光团的发射(或吸收)强度峰值通常在波长和幅度上低于激发峰所显示的强度,并且发射光谱轮廓(曲线)通常是激发曲线的镜像(或近似如此),但偏移到更长的波长,如图3中Alexa Fluor 555所示,这是一种有用的探针,可吸收黄绿色区域中的光并产生橙黄色发射。为了获得最大的荧光强度,荧光团(通常称为染料通常在激发曲线附近或峰值处的波长处激发),并选择包括发射峰在内的最宽的发射波长范围进行检测。激发和发射波长的选择通常基于干涉滤光片(图2)。另外,显微镜光学系统的光谱响应还将取决于诸如玻璃透射效率(由于抗反射涂层),透镜和镜面元件的数量以及检测器系统的响应度等因素。
激发和发射波长的有效分离和检测在荧光显微镜通过的过滤器以阻止或在紫外线传递特定波长带,可见光和近红外光谱区的适当选择来实现。荧光垂直照明器的设计目的是通过将易于互换的滤光片(中性密度和干扰激发平衡器)插入光路中,再插入光路至样品与光路之间的路径来控制激发光。观察管或摄像机检测器系统。考虑到相对较低的荧光发射强度(请参见上面的讨论),也许是最重要的标准,
特定荧光团吸收激发光的光子的效率是分子截面的函数,吸收的可能性称为消光系数。较大的消光系数表明,在给定波长范围内吸收光子(或量子)的可能性更大。量子产率表示发射的量子数量与吸收的数量之比(通常为0.1到1.0之间的值)。低于1的量子产率值是通过非辐射途径(例如热或光化学反应)而不是荧光的再辐射途径损失能量的结果。消光系数,量子产率,光源的平均发光强度以及荧光寿命都是影响荧光发射强度和效用的重要因素。
通常会发生各种各样的条件,这些条件最终会影响荧光发射的重新辐射,从而降低强度。降低荧光发射强度的总称是衰落,它是一种笼统的类别,通常进一步细分为淬灭和光漂白现象,以进行更精确的描述。光致漂白是激发态的荧光分子的不可逆分解,因为它们在发射前与分子氧相互作用。光漂白的发生是通过一种称为光漂白后的荧光恢复(FRAP)的技术来进行的。),这是研究生物大分子扩散和运动的非常有用的机制。该方法的基础是通过强烈的激光脉冲对样品的清晰区域进行光漂白,随后观察光漂白区域中荧光恢复的速率和模式。采用一种称为光漂白中的荧光损失(FLIP)的相关技术来监视与光漂白区域相邻的定义区域中荧光的减少。与FRAP相似,后一种技术可用于研究活细胞中的分子迁移率和动力学。
示于图4是光漂白(衰落)的典型例子在一系列在不同时间点对印度麂鹿表皮成纤维细胞的一个乘法-染色的培养捕获的数字图像的观察。细胞核用双苯并咪唑衍生物(Hoechst 33258;蓝色荧光)染色,线粒体和肌动蛋白细胞骨架分别用MitoTracker Red CMXRos(红色荧光)和与Alexa Fluor 488缀合的鬼笔环肽衍生物(绿色荧光)染色。使用荧光滤光片组合以两分钟的间隔获取时间点,并调整带宽以同时激发三个荧光团,同时还记录组合的发射信号。请注意,所有三种荧光团在图4(a),但Hoechst荧光团(蓝色)的强度在两分钟时开始迅速下降,在6-8分钟时几乎完全消失。线粒体和肌动蛋白染色剂对光漂白的抵抗力更强,但在定时序列过程中(10分钟),两者的强度均显着下降。
猝灭的激发态弛豫过程通过涉及非辐射能量损失的多种机理导致荧光强度降低,并且经常由于氧化剂或盐,重金属或卤素化合物的存在而发生。在某些情况下,猝灭是由于能量转移到另一个分子(称为受体)而发生的,该分子在物理上靠近激发的荧光团(供体),这种现象称为荧光共振能量转移(FRET)。这种特殊的机制已经成为有用的技术的基础,该技术涉及了远低于光学显微镜的横向分辨率的分子相互作用和缔合的研究。
在大多数荧光显微镜应用中低发射水平的不幸后果是到达眼睛或相机检测器的光子数量也非常低。在大多数情况下,光学显微镜的收集效率低于30%,并且光程中许多荧光团的浓度在微摩尔或纳摩尔区域内。为了产生足够的激发光强度以产生可检测到的发射,需要强大的紧凑型光源,例如高能短弧放电灯。最常见的灯是汞燃烧器,功率范围为50至200瓦,氙气燃烧器的功率范围为75至150瓦(请参见图5)。)。这些光源通常由外部直流电源供电,提供足够的启动功率,以通过气态蒸气的电离来点燃燃烧器,并保持燃烧时的闪烁最少。
显微镜弧光放电灯外部电源通常配有计时器,以跟踪燃烧器已工作的小时数。如果超过其额定寿命(200-300小时)使用,弧光灯会降低效率,并且更有可能破碎。汞燃烧器无法提供从紫外线到红外线的整个光谱强度,并且灯的大部分强度都消耗在近紫外线中。强度的突出峰出现在313、334、365、406、435、546和578纳米处。在可见光区域中的其他波长处,强度是稳定的,尽管不是那么亮(但仍可在大多数应用中使用)。在考虑照明效率时,仅灯功率不是主要考虑因素。相反,关键参数是必须考虑平均亮度
在过去的几年中,光学显微镜在激光光源,尤其是氩离子和氩-(离子)激光器的应用中经历了增长。这些激光器的优点是光源尺寸小,发散度低,接近单色和平均亮度高。它们已成为扫描共聚焦显微镜必不可少的技术,该技术已被证明是一种强大的工具,可通过拒绝从样品焦平面移走的非聚焦光来渲染非常清晰的荧光图像。共聚焦显微镜通过点或线扫描以及通过共轭孔径的同步成像来完成此任务。样本的光学部分可以存储在主机中,并重建为最终图像,然后将其显示在监视器上。
由于不同制造商用于识别其滤光片的各种缩写和代码的结果,应用于荧光显微镜滤光片组合的通用术语变得令人困惑。基本上,过滤器分为三大类:激发(通常称为激励器),阻挡(发射))和双色分束镜(或二向色镜)。荧光滤光片以前几乎完全由夹在两个玻璃板之间的染色玻璃或明胶制成。但是,当前的趋势是制造具有干涉光学器件的高分辨率滤光片,以用于激发滤光片以高特异性和高透射率通过或拒绝光的波长。双色分束器是专用的干涉滤光片,设计用于当以45度角放置在光路中时反射或通过特定波长的光(请参见图1和2)。屏障过滤器是用有色玻璃或干涉涂层(或两者的组合)制造的。
制造商用来标识其激励滤波器的特性的缩写包括:UG(紫外线玻璃)和BG(蓝色玻璃)。短通滤波器通常表示为KP(K是kurz的缩写,在德语中表示“ short”)或简称为SP。现在有几家制造商用IF标记其干扰滤波器。如果斯托克斯位移很小,则窄带激励干扰滤波器特别有用。
屏障过滤器的缩写或缩写包括:长通过滤器的LP或L,黄色或凝胶玻璃(德国)的Y或GG,红色玻璃的R或RG,橙色玻璃的OG或O,kante的K语(边缘的德语术语) (过滤器),BA用于屏障过滤器。当滤光片类型也与数字(例如BA515)相关联时,该名称是指最大透射率的50%处的波长(纳米)。
双色分束器也用许多缩写来描述,包括用于彩色分束器的CBS,用于二向色镜的DM,用于“ teiler kante”的TK,用于边缘分离器的德语,用于“ farf teiler”(用于分色器的德国)的FT和RKP。反射短传。所有这些术语应被认为是可以互换的,并且现代的二色分束镜总是在光学玻璃上(与有机或金属染料相对)制造有干涉涂层的。干涉薄膜被设计为对于较短的波长产生高反射率,而对于较长的波长产生高透射率。双色分束器与激发光通过反射光荧光照明器进入光学模块的路径成45度角。它们的主要功能是将选定的激发(较短)波长重新定向通过物镜并到达样品。这些专用滤光片还具有将更长波长的荧光发射传递到屏障滤光片的附加功能
图6展示了现代显微镜中使用的典型荧光滤光片组合的透射曲线。激发滤光片光谱(红色曲线)在450到490纳米之间具有中心波长(CWL)的高透射率(大约75%))470纳米。双色镜(黄色曲线)反射激发光谱区域中的波长,同时以相对较高的效率通过较高和较低的波长。请注意,双色镜面曲线上的零透射率对应于100%的反射率。在450到500纳米之间的透射曲线中的明显下降代表反射率的峰值,用于反射从激发滤光器以90度角进入样品的波长带。光学系统中的最后一个组件,即发射滤光片或阻挡滤光片(白色曲线),透射绿色可见光区域中的波长,范围在520到560纳米之间。将各种叠加光谱的透射和反射波长带之间的边界设计得尽可能陡,以确保反射和透射波长几乎完全分离。在双色镜光谱中出现的正弦上升和下降尖峰的模式是薄膜沉积过程的常见效应,称为响了。该滤光片组合的性能非常出色,清楚地证明了薄膜干涉滤光片技术的快速发展。
尼康采用的滤镜命名法可追溯到1990年代初。当时,所有尼康互补滤镜组合都是使用硬涂层溅射技术生产的,但是许多当前可用的滤镜都利用了较新的较软的镀膜方法。尽管软涂层对湿气和热的降解更敏感,并且比硬涂层滤光片必须更小心地进行处理,但它们显示出更高的阻隔值光学密度,并且更易于微调特定的波长带。了解尼康滤镜组合代码的命名法提供了一种机制,可以快速确定特定集合对于特定的荧光团是否可以充分发挥作用。
尼康专有的字母数字滤波器名称代码中的第一个字母表示波长激发光谱区域(例如UV,V,B和G,分别是紫外线,紫罗兰,蓝色和绿色的简单缩写)。激励代码后的数字与激励滤波器的通带宽度有关:1表示窄带激励,2表示中频带和宽带激励,3表示非常宽带的激励。最后,激励带通大小数字后面的一个或多个字母标识了屏障滤波器的特性。代号字母A表示截止波长最低的标准长通屏障滤光片,而B表示长通发射滤光片的截止波长值较高。带通发射滤波器用字母E标识(指术语“增强型”),以表示它们在消除交叉方面的优越性能。在E / C过滤器是设计为与特定的探针,如DAPI,FITC,TRITC,和德克萨斯红最佳性能软涂层干扰的组合。
在典型的荧光显微镜中,光通量的估计有助于勾勒出在产生数字图像或在目测样品过程中会遇到的限制。在本练习中,假定激发源是标准的75瓦氙弧放电灯,其平均光通量密度约为每平方mm400坎德拉(其他光源,请参见表1)。当收集灯泡输出并通过490纳米干涉滤光片(具有10纳米带宽和75%的透射率)时,大约2毫瓦的光会通过。在90%的高效双色镜反射后,1.8毫瓦的光束作为激发光束进入显微镜物镜的后孔。
假设一个100x物镜的数值孔径为1.4,假设直径为40微米的圆形视场,被照样品的面积将为12 x 10×E(-6)平方厘米。样品上的光通量约为每平方厘米150瓦,相当于每平方厘米3.6 x 10×E(20)光子的光通量密度。因此,样品的照度比晴天入射到地球表面的照度高约1000倍。
由上述光通量引起的荧光发射取决于荧光团的吸收和发射特性,其在样品中的浓度以及样品的光程长度。用数学术语来说,产生的荧光(F)由下式给出:
F =σ×Q×I
其中σ是分子吸收截面,Q是量子产率,I是入射光通量(如上所述)。假设荧光素是荧光团,则每个分子的吸收截面(σ)为3 x 10×E(-16)平方厘米,Q等于0.99,得出F的值每个分子每秒100,000个光子。如果染料浓度为每升1微摩尔,并均匀分布在直径为10微米(体积等于12皮升)的40微米直径圆盘中,则大约有1.2 x 10×E(-17)摩尔染料或光路上有720万个分子。如果所有分子同时被激发,则荧光发射速率将为每秒7.2 x 10×E(11)个光子(给定F与染料分子数量的乘积)。感兴趣的问题是将检测到多少个发射光子,并且该发射速率可以持续多长时间?
灯 | 电流 (安培) | 光通量 (流明) | 平均发光 密度(cd / mm2) | 弧度 (H xW) (mm) |
---|---|---|---|---|
汞灯 (100瓦) | 5 | 2200 | 1700 | 0.25 x 0.25 |
氙灯 (75瓦) | 5.4 | 850 | 400 | 0.25 x 0.50 |
氙灯 (500瓦) | 30 | 9000 | 3500 | 0.30 x 0.30 |
卤钨灯 | 8 | 2800 | 45 | 4.2 x 2.3 |
检测效率是光学收集效率和检测器量子效率的函数。具有100%透射率(不切实际的条件)的1.4数值孔径的物镜具有最大的收集效率,受限于约30%的接收角。双色镜的透射效率为85%,势垒滤光片的透射效率为80%。这样,总体收集效率约为每秒20%或1400亿光子。如果检测器是传统的电荷耦合器件(CCD),绿色荧光素发射(在525纳米处)的量子效率约为50%,因此检测到的信号将为每秒700亿光子,约占发射荧光的10%。即使使用检测器(100%量子效率),也只能检测到约20%的荧光发射光子。
荧光发射的持续时间取决于由于光漂白导致的荧光团破坏的速率。对于含氧盐溶液中的荧光素,测量表明,每个分子在被破坏之前只能发出约36,000个光子。在脱氧的环境中,光毁灭的速度降低约十倍,因此每个荧光素分子产生360,000个光子。然后,在此示例中,整个染料库(720万个分子)将能够产生最少2.6 x 10×E(11)和最多2.6 x 10×E(12)的光子。假设以上计算的每个分子每秒100,000个光子的发射速率,则在光解之前荧光只能持续0.3到3秒。在检测到光子通量的10%的情况下,信号为7。
按照此示例的论点,如果检测器是1000 x 1000像素CCD摄像机,则该信号将分布在100万个传感器上,每个传感器大约有72,000个电子。对于具有9微米方形传感器的科学级CCD,其完整的阱存储容量约为80,000电子,读出噪声小于10电子。信噪比将主要由光子统计噪声决定,该光子统计噪声等于信号的平方根,大约为268。在几乎所有情况下,这种高信号电平只能在光毁坏发生之前持续很短的时间。大多数显微学家用来延长观察周期的折衷办法是降低入射光通量强度,从而使染料池中只有一部分荧光团分子被激发并发生光解。因此,信噪比很少等于理论最大值,在荧光显微镜中通常在10到20之间。
在理想条件下,只要光学背景和检测器噪声足够低,通常可以检测单个分子的荧光发射。如上所述,单个荧光素分子在被光致漂白破坏之前可以发射多达300,000个光子。假设收集和检测效率为20%,则将检测到约60,000个光子。使用雪崩光电二极管或电子倍增CCD探测器进行这些实验,研究人员已经能够在数秒甚至数分钟内监视单个分子的行为。主要问题是充分抑制光学背景噪声。由于用于构造显微镜透镜和滤光片的许多材料都显示出一定程度的自发荧光,最初的努力是针对制造非常低的荧光成分。但是,很快就发现利用全内反射的荧光显微镜技术(TIR)提供了低背景和高激发光束的理想组合。
全内反射荧光显微镜(TIRFM)利用了van逝波,当光线在具有不同折射率的两种介质之间的界面处被全内反射时,会产生e逝波。图7(a)说明了使用外部光源的原理。在这种技术中,光束(通常是扩展的激光束)穿过高折射率的棱镜,例如玻璃或蓝宝石,与玻璃或水溶液的低折射率介质邻接。如果光线以高于临界角的角度进入棱镜,则光束将在界面处被全内反射。反射现象通过产生电磁场而在界面处产生an逝波,该电磁场渗透到低折射率空间中约200纳米或更小。e逝波中的光强度足够高,可以激发其中的荧光团,但是由于其浅深度,激发的体积非常小。
全内反射荧光显微镜也可以通过对宽场技术中所使用的落射照明的修改来进行(如图7(b)所示)。该方法需要非常高的数值孔径物镜(至少为1.4,但最好为1.45至1.6),并且需要通过较小的运动从一侧对显微镜视场进行部分照明,或者通过细的环空对照明镜进行更均匀的照明。尼康提供60倍和100倍TIRF物镜,数值孔径为1.49。需要高折射率的镜头浸没介质和显微镜盖玻片才能达到照明角度,从而导致全内反射。正如在介绍图7(b)中,以小于临界角(在图7(b)中表示为A(1))的角度离开物镜前透镜的光线从显微镜传输出去。当角度增加到或超过临界角时(在图7(b)中表示为角度A(2)),将产生全内反射。
其他流行的高级荧光技术,例如荧光共振能量转移(FRET)和光致漂白后的荧光恢复(FRAP)以及光谱学,通常与全内反射相结合以获得更多信息,如尼康Ti2-LAPP可能的那样。模块化照明系统。该结果是研究单个荧光团和荧光标记分子的强大工具。对单分子性质的研究所产生的优点才刚刚开始被人们所认识。因此,目前光学显微镜的范围从单个分子扩展到整个动物。
现代荧光显微镜将高性能光学组件的强大功能与仪器的计算机控制和数字图像采集功能相结合,可实现远远超过人眼简单观察的复杂程度。显微镜现在在很大程度上取决于电子成像,以在低光照水平或视觉上无法检测到的波长下快速获取信息。这些技术改进不仅是橱窗装饰,而且是光学显微镜作为系统的基本组成部分。
光学显微镜纯粹是描述性仪器或智力玩具的时代已经过去。目前,光学成像只是迈向数据分析的第一步。显微镜结合电子检测器,图像处理器和显示设备(可以看作是成像系统的扩展)完成了第一步。焦点,载物台位置,光学元件,快门,滤光片和检测器的计算机控制得到了广泛使用,并实现了机械显微镜无法实现的实验操作。电光学在荧光显微镜中的日益增长的应用导致了能够操纵亚细胞结构或颗粒,单个分子成像以及各种复杂光谱应用的光镊的发展。