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相差显微镜是由荷兰物理学家Frits Zernike于1934年首次描述的，它是一种增强对比度的光学技术，可用于产生透明标本的高对比度图像，例如活细胞（通常在培养物中），微生物，薄组织切片，光刻图案，纤维，乳胶分散液，玻璃碎片和亚细胞颗粒（包括原子核和其他细胞器）。
实际上，相差对比技术采用一种光学机制将相差的微小变化转化为相应的振幅变化，可以将其可视化为图像对比度的差异。相差显微镜的主要优点之一是可以在不对其进行杀死，固定和染色的情况下，以其自然状态检查活细胞。结果，可以观察到并记录正在进行的生物过程的动力学过程，并以高对比度清晰显示微小的样品细节。
示于图1是一种现代直立相差显微镜的剖切图，包括相差光学系的示意图。部分地由卤钨灯产生的相干照明，通过聚光透镜导引和聚焦上的专门环（标有聚光镜环定位在台下聚光前焦面）。穿过环形空间的波前照亮了样本，或者无偏移地通过，或者由于样本中存在的结构和相差梯度而被相差衍射和延迟。物镜收集的无衍射和衍射光通过相差板在后焦平面处分离并聚焦在中间图像平面上，以形成目镜中观察到的最终相差对比图像。
在相差技术发明之前，透射明场照明是光学显微镜中最常用的观察模式之一，特别是对于固定的，染色的样本或其他具有可见光自然吸收的样本。总的来说，容易在明场照明下成像的标本被称为振幅对象（或标本），因为当光穿过标本时，照明波前的振幅或强度会降低。
可以将相差光学附件添加到标准明场显微镜中，作为在透明样本中产生对比度增强效果的技术，使人联想到光学染色（见图2）。被样品衍射并移相的光波（称为相差对象）可以通过相差对比将其转换为在目镜中可以观察到的振幅差异。由于出现在这些物体边缘的衍射和散射现象，使用相差光学器件也可以轻松看到大型的扩展样本。现代相差显微镜的性能是如此精致，以至于当该技术与电子增强技术和采集后图像处理技术结合使用时，就可以检测出包含非常小的内部结构甚至只有几个蛋白质分子的标本。
在呈现图2是生活在既明和相差对比成像的照明培养物中细胞的比较。这些细胞是在含有氨基酸，维生素，矿物质盐和胎牛血清的营养培养基中浸润的单层培养物中生长的人类神经胶质脑组织。在明场照明（图2（a））中，细胞看起来是半透明的，只有可见的高折射区域（例如膜，细胞核和未附着的细胞（圆形或球形））可见。当使用相差光学附件观察时，相同的视野显示出更多的结构细节（图2（b））。蜂窝附件以及大部分内部结构也变得清晰可见。此外，对比度范围得到了显着改善。
泽尼克（Zernike）相差光学理论的发展就是一个很好的例子，证明了来自高度专业领域（在这种情况下为理论物理学）的研究成果如何在看似无关的学科（例如生物学和医学）中产生了创新的新进展。第二次世界大战期间，位于德国耶拿的蔡司光学工厂是第一家将实用的相差衬度光学元件集成到显微镜中的制造商。对生物学研究的直接影响是巨大的，该技术的广泛应用一直持续到今天。现代相差物镜由Nikon和其他光学制造商设计和生产的产品，能够与辅助对比度增强技术（例如微分干涉对比度，荧光和偏振光）结合使用。这些物镜可用于内部相板，这些内部相板具有变化程度的周围（未衍射）照明吸收和相差移，以产生宽范围的样品对比度和用于相差显微镜的背景强度选择。
照明光束中出现的入射波前在通过相差样本后被分成两个分量。主要成分是无偏移（或无衍射；零阶）的平面波前，通常称为环绕（S）波，该波穿过并围绕样品，但不与样品相互作用。另外，一个偏离或衍射的球面波前（D也会产生波，该波会分散在穿过物镜整个孔径的宽弧上（在许多方向上）。离开样品平面后，环绕和衍射光波进入物镜前透镜元件，然后聚焦在中间像平面上，在中间像面上，它们通过干涉结合在一起，从而产生最终的粒子波（通常称为P波）。相差显微镜中产生的各种光波之间的数学关系可以简单地描述为：
P = S + D
样本图像的检测取决于粒子和环绕（P和S）波的相对强度差异，因此取决于振幅。如果在中间图像平面中粒子波和环绕波的幅度明显不同，则样本将获得可观的对比度，并且可以在显微镜目镜中轻松看到。否则，标本将保持透明，并在普通明场条件下（在没有相差对比或其他对比度增强技术的情况下）保持原样。
就样品与其周围介质之间的光程变化而言，入射光波前穿过样品（D波）但不穿过周围介质（S波）的部分会稍有延迟。对于相差显微镜中的论点，标本在改变穿过的波的光路长度（实际上是相对相移）中的作用至关重要。在经典光学中，通过物体或空间的光路长度（OPL）是折射率（n）与物体或中间介质的厚度（t）的乘积，关系如下：
光程长度（OPL）= n×t
当光从一种介质进入另一种介质时，速度与两种介质之间的折射率差成比例地变化。因此，当聚焦的显微镜灯丝发出的相干光波通过具有特定厚度（t）和折射率（n），则波的速度会增加或减少。如果样品的折射率大于周围介质的折射率，则该波在穿过样品时速度会降低，并且当从样品中出来时，其相对相差会延迟。相反，当周围介质的折射率超过样本的折射率时，波在离开样本时会同相传播。样本与周围介质之间出现的波前位置的差异称为相移（δ），以弧度定义为：
δ=2πΔ/λ
在上式中，术语D称为光程差，与光程长度相似：
光程差（OPD）=Δ=（n 2 -n 1）×t
其中n（2）是样本的折射率，n（1）是周围介质的折射率。光程差由两个项的乘积引起：样品的厚度及其与周围介质的折射率差。在许多情况下，即使样品的厚度很小，光程差也可能很大。另一方面，当样品的折射率等于周围介质的折射率时，不管样品厚度是大还是小，光程差都为零。
探索折射率和厚度的变化对光程长度的影响，并发现两个样本如何具有这些变量的不同组合，但仍显示相同的光程长度。
对于组织培养中的单个细胞，光程差相对较小。单层培养中的典型细胞的厚度约为5微米，折射率约为1.36。细胞被折射率为1.335的营养介质围绕，该营养介质产生的光程差为0.125微米，或约为（绿光的）四分之一波长。亚细胞结构产生的延迟要小得多。这些小的光程差会导致强度线性降低，直到相移增加（图像逐渐变暗），直到一个点（取决于相板配置），此后，样品图像通过反转对比度变得更亮。在相差显微镜下在整个厚度和折射率范围内，图像的强度与样本所产生的光程差并没有简单的线性关系。相反，强度取决于多种因素，包括在相差板上的吸收，在相差板上的相差超前或延迟的程度以及该相移的相对符号。
图3显示了在标本图像平面上样品区域中的环绕波，衍射波和粒子（S，D和P）波之间的相差关系，用于明场显微镜检查（没有相差光学附件）。环绕波和粒子波的相对振幅决定了样品对比度的大小，分别用红线和绿线表示。从未直接观察到的由样品衍射产生的波被描绘为振幅较低的蓝波。环绕波和衍射波通过干涉重新结合，从而在显微镜的像平面中生成最终的粒子波。图3所示的每个波的振幅 代表各个分量波的电矢量的总和。
相对于环绕波，衍射波具有较低的振幅（因为在像点处的衍射光少于环绕光子），并且通过与样品的相互作用，相差被延迟了大约90度（四分之一波长）。通常观察到的晶格中微小的细节（由衍射波和环绕波之间的干扰引起）所产生的粒子波所表现出的波长的1/20的轻微相移，这与光程长度差有关。由于环绕声和粒子波的振幅几乎相同，因此透明标本完全缺乏对比度，并且与明亮的背景叠加时几乎看不见。
可以使用极坐标系矢量地描述明场中单个波前与相差显微镜之间的关系。在此系统中，矢量长度表示特定波的幅度，而矢量相对于固定参考的旋转角度（角度相移）表示相差移的程度（请参见图3（b））。Frits Zernike引入了相差显微镜中波相互作用的矢量表示，后来由Robert Barer进行了详细开发。尽管今天很少使用这种描述性辅助工具，但过去几年中发表的许多文本和研究报告都依赖于对矢量图表示的波浪关系的讨论。
在相差对比矢量图中，相差延迟显示为顺时针旋转（参考任意方位角），而相差提前显示为逆时针旋转。在技术上是相量图的图3（b）中，环绕（S）和衍射（D）波前的矢量和产生了合成的粒子（P）波前。表示波关系的这种机制很方便，因为它有助于可视化衍射波的相移以及它们如何影响所得粒子波的相差（反之亦然）。在图3（b）的图中，衍射波相对于环绕波的相移 表示为Φ，其中：
Φ=±90°+Φ/ 2
在等式中，φ是环绕（S）和粒子（P）波矢量之间的相对相移（光程差的函数）。对于显示出可忽略的光程差（实际上，没有相移）的样品，方程的后一项等于零，Φ变为±90度。如在呈现图3（b）中，一个衍射（d）波具有与振幅被几乎等于环绕波的粒子波非常低的振幅和小的（或不存在）的相移结果。当环绕波和粒子波具有相似的振幅（或强度）时，就不会产生对比度，并且样本在明亮的背景上仍然不可见。
相差显微镜设计的最重要概念是将标本中出现的周围和衍射波阵面分离，这些波阵面被投影到物镜后焦平面的不同位置（衍射在物镜后孔的平面）另外，必须减小环绕（无偏移）光的振幅，并且使相差超前或延迟（四分之一波长），以使图像平面中样本和背景之间的强度差异最大。产生相对相差延迟的机制是一个两步过程，衍射波在样品上的相差被相差延迟了四分之一波长，而环绕波的相差则被定位在或非常接近的相差板上提前（或延迟了）。靠近物镜后焦平面。仅需两个专用附件即可将明场显微镜转换为相差观察仪。特别设计的环形隔膜
所述聚光镜环（示出在图1和图4中）通常被构造为具有透明环形圈的不透明平板黑色（吸光）板，该板位于聚光镜的前焦平面（孔径）中，因此可以通过散焦的平行光波前照亮样品环。显微镜聚光镜在无限远处成像环形光阑，而物镜在后焦平面（共轭相差板所处的位置，如下所述）产生图像。应当注意，许多文献将来自相差显微镜的聚光器的照明描述为中心暗的空心光锥。此概念对于描述配置很有用，但并非严格准确。聚光镜环取代或驻留在聚光镜前孔中的可调光圈膜片附近。当使用同时具有相差环和孔径光阑的聚光镜进行相差对比实验时，请检查以确保虹膜光阑的开口宽度大于相差环的外围。与微分干涉对比和霍夫曼调制对比不同，相差照明和检测的圆形几何形状使观察样品时无需依赖方向的伪影。相差对偏振和双折射效应也不敏感，这是检查塑料组织培养容器中生长的活细胞时的主要优势。与微分干涉对比和霍夫曼调制对比不同，相差照明和检测的圆形几何形状使观察样品时无需依赖方向的伪影。相差对偏振和双折射效应也不敏感，这是检查塑料组织培养容器中生长的活细胞时的主要优势。与微分干涉对比和霍夫曼调制对比不同，相差照明和检测的圆形几何形状使观察样品时无需依赖方向的伪影。相差对偏振和双折射效应也不敏感，这是检查塑料组织培养容器中生长的活细胞时的主要优势。
在柯勒照明条件下，不与样品相互作用的周围光波作为亮环聚焦在物镜的后焦平面（衍射平面）中。在这些条件下，物镜的后焦平面与聚光镜的前孔径平面共轭，因此未衍射（零级）的光波在物镜的后孔径处形成了聚光环的明亮图像（叠加在聚光镜的图像上）。相板）。样品衍射的球面波前（D）在整个物镜后孔径的各个位置穿过衍射平面。衍射光的分布（数量和位置）取决于样品中光散射物体的数量，大小和折射率差异。对于大多数标本，只有一小部分入射光波会发生衍射，并且大部分光会无偏移地通过，最终照亮整个像平面。
相反，环绕的平面波前在物镜后孔径中所占的比例较小，这对应于聚光环的共轭。因此，两个波前不会在很大程度上重叠，而是占据了物镜后焦平面的不同部分。因为直射，零阶光和衍射光在衍射平面上在空间上分开，所以可以有选择地操纵任何一个波分量（环绕的S或衍射的D）的相差，而不会互相干扰。
通过相差显微镜检查光路，并了解这些系统如何将入射的电磁波分解成周围（S），衍射（D）和所得粒子（P）分量。
将相差板安装在物镜的后焦平面中或附近（请参见图4和5），以便有选择地更改穿过样本的环绕（或无偏移）光的相差和幅度。在某些相差物镜中，薄相板包含一个刻蚀到玻璃中的环，该环的厚度减小了，以便有差别地推进环绕声的相差（S）波的四分之一波长。通常，该环还涂有部分吸收的金属膜，以将环绕光振幅降低60-90％。由于后焦平面通常位于内部镜头元件附近，因此某些相差对比物镜是通过实际蚀刻到镜头表面而产生的。无论物镜是如何制造的，要记住的最重要一点是，每个相差物镜都经过修改以包括相板，而所有其他显微镜物镜都没有此功能。
由于最终产生的粒子波仅由周围和衍射波前的干涉产生，因此到达像面的波前之间的干涉会产生一个粒子（P）波，其振幅现在比中性密度大得多涂层。最终效果是将样本引入的相对相差差转换为从像平面发出的光的振幅（强度）差。由于人眼将强度差异解释为对比度，因此现在可以在显微镜目镜中看到标本，并且还可以使用传统的相机系统或使用CCD或CMOS设备以数字方式将其捕获在胶片上。全部正面相差系统相对于球形衍射（D）波前的相差有选择地使线性环绕（S）波前的相差前进。可选地，相对于样本衍射的光波，负相差对比度会延迟环绕波前。
通常，折射率比周围介质高的标本在中性灰色背景下显得较暗，而折射率比沐浴介质低的标本比灰色背景亮。但是，并非总是如此，因为具有较高中性密度和较低延迟值（八分之一波长或更小的波长）的专用相差对比物镜可以在较厚的样品中产生对比度反转。最终结果是光程差很高的区域开始显得明亮。
为了在相差光学系统中修改空间分离的环绕和衍射波阵面的相差和幅度，引入了许多相板配置。由于相板位于物镜后焦平面（衍射平面）中或附近，因此所有通过显微镜的光必须穿过该组件。相板中聚光镜环面聚焦的部分称为共轭区域，其余区域统称为互补区域。共轭区域包含负责将周围（未衍射）光的相差改变为相对于衍射波前相差正负90度的材料。通常，相板共轭面积要比聚光环图像确定的区域宽（约25％），以便使散布到互补区域的环绕光量最小。
图5中显示了一系列典型的相差对比物镜，这些物镜的放大倍率不断提高，并且其相应的聚光镜环隙也随之增加。通常，当增加客观数值孔径和放大倍率时，相板宽度和直径均减小。相反，聚光镜环的大小随物镜放大而增加。在图5中也有说明图7是剖视图，显示了正负相板结构背后的基本概念。正相板产生暗对比度，并包含旨在减小环绕波前振幅的部分吸收膜。另外，该板包含相差延迟材料，该相差延迟材料设计为使衍射光的相差偏移（延迟）90度。负相板还包含相差延迟材料和部分吸收材料。但是，在这种情况下，两种材料都夹在相差板上，因此，唯一受影响的物种（相差衰减和延迟90度）是未衍射的环绕波前。
现代显微镜制造商提供的大多数相板都是通过将薄的介电膜和金属膜真空沉积在玻璃板上或直接沉积在显微镜物镜内的一个透镜表面上来生产的。介电薄膜的作用是移动光的相差，而金属膜则衰减未衍射的光强度。一些制造商将多种抗反射涂层与薄膜结合使用，以减少眩光和反射回光学系统的杂散光。如果不在透镜表面上形成相板，则通常将其固定在位于物镜后焦平面附近的连续透镜之间。电介质膜，金属膜和抗反射膜以及光学胶泥的厚度和折射率，仔细选择在相差板的互补和共轭区域之间产生必要的相移。在光学术语中，将围绕光相对于衍射光的相差改变90度（正或负）的相板称为四分之一波长板由于其对光程差的影响。
通过改变相板的特性来调节对比度，这些属性包括金属膜（或抗反射涂层）的吸收，相延迟材料的折射率以及相板的厚度。几家显微镜制造商提供了具有渐进对比度的各种相差物镜。例如，尼康产品阵容包括五种类型的相差物镜。的DL（黑暗低）系列的目标上产生浅灰色背景的暗图像轮廓。设计这些物镜的目的是在折射率与周围介质（例如组织培养细胞）有显着差异的标本中提供正对比度。对比度稍低的物镜DLL（Dark Low Low（暗低Low），在明场照明下比DL物镜产生更好的图像，并被用作在荧光，明场，暗场和微分干涉对比中进行组合观察的通用物镜。
尼康还生产了切趾相差物镜，该物镜在中央相环的两侧均包含一个次级中性密度环，该环旨在减少光晕伪像。具有非常小的相差差的标本是使用尼康DM（深色介质）正相差物镜成像的理想候选物，该物镜在中等灰色背景上产生深色图像轮廓。对于负相差，尼康提供了BM（明亮介质））物镜，特别适合视觉检查细菌鞭毛，原生动物，纤维蛋白纤维，小球和血细胞。明亮的中等相差对比物镜在中等灰色背景上产生明亮的图像。尼康还为某些倒置显微镜模型提供了一个外部相差模块，该模块允许用户使用高性能的非相差物镜进行相差成像。该模块允许在与物镜后孔径共轭的平面上插入相差环。
在大多数情况下，仅使环绕波前的相对相差前进不足以导致在显微镜中产生高对比度图像。发生这种情况是因为环绕波的幅度明显大于衍射波的幅度，并且抑制了仅来自总波数的一小部分由干扰产生的结果图像。为了将环绕波前的振幅减小到更接近衍射波的振幅（并在像平面上施加干涉），通过使用半透明金属（中性）来增加物镜中的相板的不透明度密度）涂层。根据相差显微镜的设计，周围的光波几乎只能穿过相板，
与正负相差对比图像的生成相关的相差板配置，波关系和矢量图如图6所示。另外，还示出了通过这些技术成像的样本的示例。如前所述，从样品平面射出的衍射光的球形波前相对于平面环绕（或未衍射）波前的相差被延迟了四分之一波长。在正相差光学配置（图6中的上排图像）中，环绕声（S）在穿过相差板以产生180度的净相移（一半波长）时，波前在相差上提前四分之一波长。现在，高级环绕波阵面能够对中间像平面处的衍射（D）波参与相消干涉。
正相差的概述在图6的上部给出。正相差板（图6的左侧）由于玻璃板上的蚀刻环而使环绕波前进了四分之一波长，从而减少了波通过高折射率板所采取的物理路径。因为衍射的样本射线（D当与样品相互作用时，四分之一波长的光被延迟了四分之一波长，从相板出射时，环绕波和衍射波之间的光程差为二分之一波长。最终结果是环绕波和衍射波之间存在180度的光程差，这将对像面处的高折射率样品造成相消干涉。用于正相差的相消干涉波的幅度曲线在图6的上部图中显示。产生的粒子（P）波的幅度低于环绕（S）波，导致物体看起来比背景暗，如Zygnema图像所示最右边的绿藻（标记为POS）。在图6的图像和图像之间出现了一个向量图，该图说明了环绕波前进四分之一波长，以正相差对比显示为逆时针旋转90度。
如图6的下部所示，也可能产生产生负相差的显微镜光学系统。在这种情况下，环绕（S）波相对于衍射（D）波被延迟（而不是前进）四分之一波长。结果是具有高折射率的样本在较深的灰色背景下显得明亮（请参见图6下部标记为NEG的图像））。在负相差中，物镜相差板包含一个高环，该环相对于衍射波的相差将零阶环绕波的相差延迟（而不是像正相差那样使相差提前）。因为在通过样品时衍射波已经被延迟了四分之一波长，所以消除了环绕波和衍射波之间的光程差，并且对于像面高折射率的样品会产生相长干涉。请注意，在负相差下，所产生的粒子（P）波在幅度上比环绕（S）波高（请参见图6的下图））。还显示了负相差对比的矢量图，其中环绕波矢量经历了90度的顺时针旋转。
本互动教程探讨了明场中的环绕声（S），衍射（D）和产生的粒子（P）波之间的关系，以及正负相差显微镜。
重要的是要注意，在物镜后焦平面处形成的衍射图样是样品在相差和所有其他形式的光学显微镜中偏离和散射的所有空间频率的傅立叶变换。因此，在中间像平面产生的图像和通过目镜观察到的最终图像（或由检测器记录的最终图像）表示在物镜后焦平面和视点（浮在目镜前透镜上方）形成的衍射图的傅里叶逆变换。）， 分别。相差显微镜利用这些光学共轭特性，通过修改显微镜的光圈功能以引入空间过滤来增强图像对比度特定图像信息。在物镜的后衍射平面中引入相差板（滤光片）可以将样品相差变化转换为可以在最终图像中观察到的强度变化。
当样品很薄且均匀分布在基质上时，相差显微镜产生的图像相对较容易解释（与在单层组织培养中生长的活细胞一样）。当使用正相差光学器件检查薄样品时，这是大多数制造商生产的传统形式，当样品的折射率超过介质的折射率时，它们会比周围的介质更暗。相差光学器件可差异地增强扩展标本周围边缘（例如细胞膜与沐浴营养介质之间的边界）附近的对比度，并产生可被粗略解释为密度图的整体高对比度图像。由于相差中的样本图像的振幅和强度与折射率和光程长度有关，因此可以将图像密度用作衡量各种结构之间关系的量规。实际上，一系列密度不断增加的内部细胞器（例如液泡，细胞质，相间核和核仁（或有丝分裂染色体））通常可视化为相对于固定参照物（例如背景）逐渐变暗的物体。还应该注意的是，所有相差对比图像中都存在大量的光学伪影，并且大尺寸的扩展样本通常会在对比度和图像强度上出现明显的波动。对称性也可能是确定相差显微镜中大小样本如何出现的重要因素。
对相差图像进行合理的解释需要仔细检查和检查，以确保不会将伪像错误地分配给重要的结构特征。例如，一些内部细胞器和组件通常具有比周围细胞质更低的折射率，而其他一些具有更高的折射率。由于这些众多的细胞内结构表现出不同的折射率，当在正相差显微镜中观察时，活细胞的内部可以显示出一系列强度，从非常明亮到非常暗。例如，存在于植物和单细胞原生动物中的胞饮小泡，脂质滴和气泡具有比细胞质更低的折射率，因此比其他组分显得更亮。相反，如上所述，具有高折射率的细胞器（细胞核，核糖体，线粒体和核仁）在显微镜下显得较暗。如果样品引入的相差延迟足够大（衍射波的相移大约为半个波长），则衍射波与周围波之间的干涉将变得相长，从而使这些样品比周围的背景明亮。
为了避免在相差图像中出现明暗对比方面的混淆，应仔细考虑样品制备中出现的光程差。如上所述，光程差是由折射率与样本（物体）厚度的乘积得出的，并且与样本波与背景（衍射和环绕）波之间的相对相移有关。没有关于分量的相对厚度的信息，就不可能在相差图像中区分高折射率分量和低折射率分量。例如，具有高折射率的小样本可以显示与具有较低折射率的大样本相同的光程差。通过相差光学系统观察时，两个样品的强度大致相同。在许多生物学实验中，产生细胞或细胞器收缩或肿胀的条件会导致明显的对比度变化。外部介质也可以替换为具有较高或较低折射率的介质，以产生样本图像对比度的变化。实际上，周围介质中折射率变化对图像对比度的影响形成了被称为外部介质也可以替换为具有较高或较低折射率的介质，以产生样本图像对比度的变化。实际上，周围介质中折射率变化对图像对比度的影响形成了被称为外部介质也可以替换为具有较高或较低折射率的介质，以产生样本图像对比度的变化。实际上，周围介质中折射率变化对图像对比度的影响形成了被称为浸没折光仪。
在给出图7是具有正的和负相差对比光学系统成像的几个半透明标本。图7（a）和7（b）以相对高的放大倍率（200x）以正相差（图7（a））和负相差（图7（b））示出了类鱼鳞。这些鳞片常见于大多数骨鱼类中（称为Teleostei））。每个秤的前部（或前部）通常藏在前一秤的后部后面。随着鱼的生长，鳞片也随之生长，从而导致同心生长“环”的模式，这种环的数量随鳞片尺寸的增加而增加，并且看起来类似于在树干横截面上发现的环。在某些情况下，类胡萝卜素鳞片的生长模式被用来估计鱼的年龄。在正相差下，生长环显得较暗，周围有较浅的灰色光晕区域（图7（a）），但在相较之下，生长环更轻，周围是带有负相差的暗槽（图7（b））。
当在生长培养基中沐浴时，中国仓鼠卵巢细胞的培养物在明场照明模式下看起来是透明的，并且这些细胞的折射率非常接近营养盐缓冲液。在正相差下（图7（c）），可以轻松地看到内部细胞的细节，包括细胞核和细胞器。然而，当在负相差照明下进行检查时，细胞轮廓变得难以区分，并且内部细节被大部分模糊，除了高折射率细胞器变得非常明亮之外（图7（d））。最后，人类红细胞显示为深灰色的扁圆形椭圆形，具有甜甜圈轮廓和正相差的明亮中心（图7（e）），但相同的单元格明亮，中心暗（图7（f）），在负相差下从背景中突出。
相差图像中的两个非常常见的效果是特征光晕和阴影对比图案，其中观察到的强度并不直接对应于样本与周围介质之间的光程差（折射率和厚度值）。尽管这些图案是相差光学系统的自然结果，但它们通常被称为相差伪像或图像失真。在所有形式的正相差中，明亮的光晕通常围绕大型标本特征和介质之间的边界。相同的光环看起来比带有负相差光学系统的样品更暗。光程差波动会进一步加重这些影响，这些波动会在正相差下将亮晕变暗，而在负相差下使暗晕变亮。
在相差显微镜中会出现光晕，因为位于物镜相差板上的圆形相差延迟（和中性密度）环还透射了样品产生的少量衍射光（它不仅限于单独通过环绕波）。由于电容器环投射到相差板上的零阶环绕波前的宽度小于相差板环的实际宽度，这一事实使问题更加复杂。相板环和环绕波阵面之间的宽度差异通常约为25％至40％，但由于光学设计的限制和要求而有必要。由于圆形相差改变环在物镜衍射平面中的空间位置，只有那些与样本衍射的低空间频率相对应的波前才穿过相板的环面。因此，穿过相差板的衍射标本波相对于零阶（无偏或环绕）光保持90度（四分之一波长）异相。产生的相差对比光晕伪像归因于样品相对于零阶环绕波前通过非常浅的角度对样品衍射的低空间频率信息的衰减。实际上，在样品衍射的低空间频率波阵面和未减弱的光波之间不存在破坏性干扰，会在样品周围产生局部的对比度反转（由光晕表现）。为了在图像中创建清晰的边缘，
探索阴影和光晕伪影，其中观察到的强度并不直接对应于样本和周围介质之间的光程差（折射率和厚度值）。
相差光晕在大型，低空间频率的物体（例如原子核，硅藻和整个细胞）周围尤为突出且引人注目。造成光晕伪影的另一个因素是光能在图像平面上的重新分布，从破坏性光的区域到具有破坏性的光区域。大的，高对比度的光环会为产生较大光程差的标本生成令人困惑的图像，例如红细胞，霉菌，原生动物，酵母细胞和细菌。另一方面，晕轮效应通常可以强调标本与其周围背景之间的对比度差异，并可以增加许多标本中细边和边框细节的可见性。该效果在负相差对比度方面特别有用，它会在低频图像细节周围产生暗晕。在许多情况下，可以减少相移和衍射的程度，从而减小样品周围的光晕尺寸。消除或减弱光晕强度的最简单方法是用较高折射率的成分（例如甘油，甘露醇，右旋糖酐或血清白蛋白）改变观察介质的折射率。在某些情况下，改变介质的折射率甚至可以产生图像对比度的反转，使变暗的样品特征变亮而不会显着干扰背景强度。例如甘油，甘露醇，右旋糖酐或血清白蛋白。在某些情况下，改变介质的折射率甚至可以产生图像对比度的反转，使变暗的样品特征变亮而不会显着干扰背景强度。例如甘油，甘露醇，右旋糖酐或血清白蛋白。在某些情况下，改变介质的折射率甚至可以产生图像对比度的反转，使变暗的样品特征变亮而不会显着干扰背景强度。
通过使用特殊设计的物镜，还可以显着降低光圈效应，该物镜包含一个小中性密度材料环，该物环围绕物镜后孔附近的中心相环材料。这些目标称为切趾相差物镜，使具有大相差差的相差对象的结构能够以出色的清晰度和细节清晰度进行观看和拍摄。在大多数情况下，可以将亚细胞特征（例如核仁）清楚地区分为具有变趾物镜的暗对比度，但是这些相同的特征具有明亮的光晕或使用常规相差光学器件成像为亮点。对于切趾光学器件，由于衍射光的振幅相对于穿过样本的直接光的振幅大，因此对比度发生了反转。
实际上，利用变迹光学系统减少光晕和增加样品对比度，可以通过利用位于后焦平面内物镜中的相板中与相膜相邻的选择性振幅滤波器来实现。这些幅度滤波器由应用于相膜周围的相板上的中性密度薄膜组成。经典相板中相移环的透射率约为25％，而切趾板中相移环周围的一对相邻环的中性密度为50％。两块板中相膜的宽度相同。这些值与相差显微镜中应用于标准板的相移薄膜的透射率值一致。
阴影是相差显微镜中另一种非常常见的光学伪影，通常在扩展阶段的大型标本中最容易观察到。通常可以预料，在直径上具有恒定光程长度的大相样品的图像在显微镜下会均匀地显得暗或亮。不幸的是，相差显微镜产生的图像强度并不总是与样品产生的光程差具有简单的线性关系。其他因素，例如在相板处的吸收以及相延迟或超前的量，以及相板和聚光镜环的相对重叠尺寸也起着关键作用。大的强度分布图 厚度均匀的正相差样品通常从边缘到中心逐渐增大，中心区域的光强度可以接近周围介质的光强度（负相样品则相反）。这种效应被称为遮蔽效应，在检查扩展的平面样本（例如材料平板（玻璃或云母），复制品，扁平组织培养细胞和大型细胞器）时经常观察到。
图8显示了假设的扩展相样品的正相和负相对比中的晕影和阴影伪影的影响，该样品具有矩形几何形状且折射率高于周围介质（图8（a））。记录在样品的中心区域上的强度分布在图8（b）中示出。在正相差下（图8（c）），样品图像表现出鲜明的光晕并显示出显着的阴影效果，当从样品的边缘到中心区域移动时，强度会逐渐增加（见图8（d）中的强度分布）。晕圈和阴影效应使强度在负相差下反转（图8（e）和8（f））。当用负相差光学元件观察时，样本图像周围有暗色的光晕（图8（e）），阴影过渡的范围从边缘的明亮到中心的较暗的灰度级。此外，强度分布图（图8（f））与以正相差观察到的强度分布图相反。
遮挡现象通常也称为作用区效应，因为样品中厚度均匀的中心区域与边缘和边界处的高折射区域的衍射光不同。与边缘相比，在样品的中心区域，相对角度和衍射光量均显着降低。由于源自中心样本区域的衍射波前与零阶无偏移环绕波前仅存在边际空间偏差（但相差仍被延迟四分之一波长），因此它们被物镜后方的相板捕获焦平面以及环绕光。结果，中央样本区域的强度基本上与背景强度相同。在相对平坦的平面样本区域中阴影效应的出现，
晕影和阴影伪影取决于相板和被检样品的几何和光学特性。特别地，相板材料的宽度和透射率在控制这些效果方面起着至关重要的作用（相板宽度通常约为物镜总孔径的十分之一）。具有减小的透射率的较宽的相板倾向于产生较高强度的光晕和阴影，而环直径对这些效果的影响较小。对于特定的相差物镜（正或负），光程差以及样本尺寸，形状和结构都会对光晕和遮蔽效应的严重程度产生重大影响。此外，这些效果在很大程度上受物镜放大率的影响，较低的放大率会产生更好的图像。
相差法是一种增强薄而透明的样品的对比度而又不降低分辨率的极好方法，并且已被证明是研究活细胞动态事件的有价值的工具。在引入相差光学系统之前，通过人工染色技术使细胞和其他半透明标本在明场显微镜下可见。尽管可以在暗场和倾斜照明下观察或记录这些标本，或通过散焦明场显微镜观察和记录这些标本，但这种方法已证明在提供有关细胞结构和功能的关键信息方面并不可靠。
相差技术被广泛应用于生物学和医学研究，特别是在细胞学和组织学领域。这样，该方法用于检查在明场照明下透明的活细胞，组织和微生物。相差使内部细胞成分（例如膜，细胞核，线粒体，纺锤体，有丝分裂装置，染色体，高尔基体以及来自植物和动物细胞及组织的细胞质颗粒）易于可视化。另外，相差显微镜被广泛用于诊断肿瘤细胞以及培养物中多种活细胞的生长，动力学和行为。已经开发出用于组织培养研究的倒置显微镜专用的长工作距离相差光学系统。受益于相差观察的生物领域的其他领域是血液学，病毒学，细菌学，寄生虫学，古生物学和海洋生物学。
相差的工业和化学应用包括矿物学，晶体学和聚合物形态研究。通常使用相差显微镜可以很容易地观察到无色微晶，粉末，颗粒状固体和结晶聚合物，它们的折射率仅与周围浸没液体的折射率略有不同。实际上，定量折光法通常用于获得折射率值并用于识别目的。通过相差光学技术检查的其他商业产品包括粘土，脂肪，油，肥皂，油漆，颜料，食品，药品，纺织品和其他纤维。
入射光相差显微镜虽然已被微分干涉对比技术所取代，但可用于检查表面，包括集成电路，晶体位错，缺陷和光刻。一个很好的例子是硅外延晶片中的堆叠缺陷，这对半导体工业具有重大意义。在反射光相差系统中，照明环的图像被投影到物镜的后焦平面，物镜通常位于该后焦平面。另外，相板未定位在物镜内，而是后焦平面的图像由辅助透镜系统形成，该辅助透镜系统避免了相板产生的反射和散射。应该注意的是，在反射光相差显微镜下，
减少光晕和阴影伪影仍然是相差显微镜的主要关注点。切趾相板可用于降低光晕的严重程度，并且可以对专用可变相差衬度系统进行微调以控制这些效果，以优化图像质量和通过该技术获得的信息的保真度。先进的相差对比系统的开发也引起了极大的兴趣，该系统可提供具有大光程差的相差样本的精确测量，以及与其他对比增强技术的结合观察。特别地，相差通常与荧光成像一起用于确定荧光团的位置，并显示出在扫描光学显微镜中增强对比度的希望。
