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反射光荧光显微镜-Java教程
在用于荧光显微镜的反射光Köhler照明中，光源的图像被集光透镜聚焦到位于垂直照明器中的光圈光阑上。该光圈与物镜的后孔径和灯弧或灯丝共享共轭平面，因此确定了照明视野孔径的大小。光源，垂直照明器孔径光阑和物镜后焦平面（瞳孔）共同形成共轭平面的照明组。打开或关闭孔径光阑可用于控制杂散光并调节照明强度（数值孔径），而无需更改照明场的大小。在图像中，调整光圈值会影响亮度和对比度。本互动教程探讨了反射光（落射）荧光显微镜中的光路。
本教程以出现在窗口中的反射光荧光显微镜的剖面示意图初始化。单击“ 外部”按钮会将图像还原为显微镜的外部视图（并将按钮更改为“ Inside”）。为了操作本教程，请使用“ 视场光阑”和“ 光圈光阑”滑块分别调整显微镜照明的视场大小和数值孔径。“ 照明强度”滑块可在25％到100％的任意值之间改变虚拟灯箱的输出。可以使用“ 滤光镜立方体”更换位于垂直照明器转塔中的荧光滤光镜块滑块。本教程中可用的激发波长为350、450、550、600和650纳米。随着滤光片块旋转进入光路，照明颜色会发生变化，以匹配各个滤光片组的激发和荧光发射波长。
反射光Köhler照明中共轭平面的成像或场集由视场光阑，样本表面和中间像平面组成。因此，当视场光阑在样本平面上聚焦时，光源的图像会明显地从聚焦中移开，以提供均匀的照明场。视场光阑控制照明场的大小，而不会影响被观察区域的照明强度。在实践中，视场光阑的开口尺寸应尽可能小，以增加图像对比度并减少未直接观察到的区域的光致漂白程度。尽管大多数电弧放电和基于灯丝的光源产生的照明强度不均匀，但科勒照明仍可对标本场产生均匀的照明。正确配置显微镜后，物镜的后焦平面将被完全照亮，从而提供一个从一个边缘到另一个边缘均匀明亮的场。在理想情况下，Köhler照明使用一组会聚的波前来沐浴样本，每个波前都是由成像到聚光镜孔径的光源上的各个点产生的。在正确配置的荧光显微镜中，结果是最佳的图像对比度和分辨率。在理想情况下，用一组会聚的波前对样本进行沐浴，每个波前都是由成像到聚光镜孔径的光源上的各个点产生的。在正确配置的荧光显微镜中，结果是最佳的图像对比度和分辨率。在理想情况下，用一组会聚的波前对样本进行沐浴，每个波前都是由成像到聚光镜孔径的光源上的各个点产生的。在正确配置的荧光显微镜中，结果是最佳的图像对比度和分辨率。
绝大多数情况下，反射光荧光显微镜是使用非相干光源以及使用激光扫描共聚焦和多光子仪器进行的宽视野研究的首选方法。荧光显微镜的这种流行模式也被称为入射光荧光，落射荧光或简称落射荧光。图1显示了一种典型的现代反射光荧光显微镜，该显微镜还配备了各种对比度增强模式的透射光观察功能。该显微镜包含一个三目观察头，该观察头与一个电荷耦合器件（CCD）耦合。）摄像头系统，并具有两个照明源，一个用于透射光，另一个用于镜面观察（分别是钨卤素灯和汞弧放电灯）。这种设计的显微镜可以将反射的荧光与透射光的相位对比，微分干涉对比（DIC），偏振光或霍夫曼调制对比观察结合或交替使用。
任何荧光显微镜的本质特征是提供一种通过选择性过滤的照明激发样本，然后使用第二个过滤器隔离弱得多的荧光发射的机制，从而能够以最大的灵敏度在深色背景上形成图像。在许多实验中，生物样本中的局部探针浓度非常低，以至于激发光中只有一小部分被荧光物质吸收。此外，在能够吸收一定量照明的那些荧光团中，将发射二次荧光的百分比甚至更低。所产生的荧光发射亮度水平将比照明的亮度水平小三到六个数量级。从而，荧光显微镜的基本问题是对样品进行高效照明，同时捕获微弱的荧光发射，该荧光发射已与强度更高的照明带有效分离。在现代荧光仪器中，通过组合滤光片可以满足这些条件，滤光片可以根据双色分束器的作用和特性来协调激发和发射要求。
