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激光扫描共聚焦显微镜已被证明是一种有用的工具，可通过消除来自焦平面去除区域的光，以高对比度检查固定和染色的细胞、组织甚至整个生物体。然而，荧光蛋白在活细胞成像中的应用日益广泛，现在需要毫秒级的显微镜成像速度，以便解开许多生物过程中发生的复杂动态。不幸的是，传统的激光扫描共聚焦显微镜在采集速度方面受到振镜反射镜的限制，振镜反射镜由线性锯齿控制信号以每像素几微秒的速率驱动。这意味着扫描速率范围从 500 毫秒到 2 秒，具体取决于图像尺寸。为了在更快的时间尺度上获取图像，激光扫描共聚焦显微镜必须重新设计，以纳入先进的扫描方案，使光束能够以更高的速度在样品上进行光栅扫描。为了克服共聚焦显微镜固有的速度慢的问题，一些制造商推出了配备共振扫描镜的仪器，能够以每秒 30 帧或更高的速度收集图像。
在示出的图1是一个尼康 A1R激光共聚焦显微镜扫描装置配备了许多高级功能，包括基于高分辨率振镜的扫描仪（4,096 x 4,096 像素；非共振）和高速共振扫描仪、连续可变的六边形针孔、光谱成像容量、多个光输出端口和一对用于不同波长的多个激光器的输入端口。额外的自由空间光束引入端口包含在A1R MP（多光子模型）用于多光子成像所需的超快激光器。共振扫描系统能够以每秒 30 帧（512 x 512 像素）到每秒 420 帧（152 x 32 像素）的速率进行高速图像捕获，而非共振扫描仪的最大扫描速率为 4 帧每秒 512 x 512 像素。共振扫描仪的共聚焦变焦（从 1.5 倍到 8 倍）受限于每一步需要单独的 Ronchi 光栅图案（下面讨论），而非共振扫描仪具有 1 倍到 1000 倍的连续可变变焦范围。也许 A1R 扫描装置最先进的功能是能够同时使用两个扫描仪执行混合扫描. 在这种模式下，非共振扫描仪可用于样品选定区域的光活化或光漂白，然后使用共振扫描仪进行后续高速成像，以实时观察光活化物质的恢复或扩散。该仪器的真正强大之处在于其多种功能，既可以对固定样本进行高分辨率共聚焦成像，也可以使用荧光蛋白、光学荧光笔和笼状荧光团进行活细胞成像的可选光激活实时扫描。在预算有限的显微镜核心设施中，这种多功能性应该能够在单个仪器中容纳更广泛的用户群。
尽管相对复杂的共振检流计已经商业化使用了三十多年，但它们在激光扫描共聚焦显微镜中的应用尚未得到广泛应用。1990年代初期，第一批点扫描仪器是在希望对活细胞中的快速钙波成像的研究人员的实验室中制造的。在几份描述成功实验的研究报告出现后，其他研究人员开始开发更复杂的仪器，包括包含共振扫描仪的多光子共聚焦。共振扫描显微镜的构造由于高速共振扫描仪的余弦运动而变得复杂，这会产生像素时钟问题。然而，在过去的十年里，已经出现了几种可行的解决方案（基于硬件和软件），使仪器能够以视频速率执行正常的共聚焦功能，例如平移和缩放。这些仪器在未来几年应该会越来越受欢迎，并且毫无疑问将能够在速度和成像效率方面与旋转磁盘和线扫描仪竞争。
在传统的激光扫描共聚焦显微镜中，激发光束被扩展并被引导到一对振荡振镜扫描镜，后者对整个样品的聚焦光束进行光栅扫描。荧光发射通过相同的反射镜组进行反扫描，并在进入光电倍增管检测器之前通过共轭（共焦）针孔孔径以去除离焦光。在扫描和反扫描过程中，一个振镜沿快速水平轴扫描样品，而另一个反射镜扫描和跟踪较慢的垂直轴。扫描一直持续到收集完整的二维 (x-y) 图像，此过程可以重复以随着时间的推移生成一系列图像。或者，焦点可以沿着显微镜轴平面步进，以获取光学截面的三维（x、y 和 z）图像堆栈。扫描速度受快轴反射镜机械规格的限制，其扫描速度通常约为每像素 4 到 5 微秒。因此，对于在一秒钟内收集到的 512 x 512 像素图像，扫描点在每个像素上停留大约 4 微秒。以视频速率（每秒30帧）驱动标准检流计扫描仪来收集类似大小的图像是困难的，如果不是不可能的话，因为镜子必须快速加速，在扫描时保持恒定速度场，然后迅速减速，行进方向反转，对每条扫描线重复这个循环。以每秒30帧的速度尝试执行此类操作会造成可能导致过热和过早故障的情况。因此，非共振线性振镜所需的缓慢扫描速率限制了共聚焦显微镜观察发生在非常快的时间尺度上的事件的能力。
使用基于振镜的激光扫描共聚焦显微镜，最快的扫描方案包括使用线扫描通过快轴镜沿样品的单个轴获取一行像素，同时将慢轴镜降级为选择适当的扫描位置（图2）。在现代共聚焦仪器中，扫描线不受x- 轴，但可以在任何横向方向上定向以包括所有感兴趣的样本特征。结果通常绘制为一系列偏移的扫描，以实现荧光强度随时间变化的可视化。这种方法可以产生高速扫描，但其检测可能发生在样本其他区域的事件的能力有限。快速线扫描的另一个缺陷是每个像素的停留时间通常不足以激发所有可检测的荧光，尤其是对于目标丰度较差的样本。此外，共聚焦显微镜中使用的光电倍增管具有大约15%到40%的量子效率，因此随着扫描速度的提高，
示于图2是线扫描在活细胞共聚焦显微镜的示例。图2(a) 中显示的序列捕获了由合成指示剂 Fura Red 在心肌细胞中诱导的xt扫描系列钙火花。请注意在序列中的连续时间点期间出现在多个位置的高荧光强度区域。在图2(b) 中，显示了钙波图像使用荧光蛋白Cameleon生物传感器探针（包含 mCerulean 和 mVenus）穿过分离的 HeLa 细胞中的细胞质。获得高空间分辨率（例如 512 x 512 像素）的图像需要快速的x-y扫描并且必须使用可以在几毫秒内扫描整个视野的显微镜进行，例如以下段落中描述的仪器。使用配备线性振镜的共聚焦显微镜进行快速线扫描，可以在一维中记录钙波作为时间的函数，如下图所示。在图2(c) 中，沿着图2(b) 中的白色虚线进行扫描以捕获波的单个空间维度，该波在不到一秒的时间内穿过细胞。
快速图像采集的另一种策略是通过将照明光束塑造成一条线来增加像素驻留时间而不降低帧速率速度（在图 3(c) 中示意性说明）。这种扫描概念已在商用共焦仪器中实施，该仪器消除了快轴振荡振镜反射镜并使用线性 CCD 阵列（线 CCD）捕获荧光发射）。因此，线扫描共聚焦显微镜可以通过线形照明激发并通过共聚焦狭缝孔径收集荧光发射来实现视频帧速率。线扫描共焦仪器的实际限制是不对称分辨率，这是由于一个轴的分辨率由共焦扫描提供，而另一轴的分辨率受传统宽场光学器件的限制。此外，在不明显低于理论最佳值的分辨率下，生成一条狭窄的衍射极限聚焦光线与适当尺寸的检测狭缝相结合，在技术上是困难的。
商用狭缝共聚焦显微镜解决方案依赖于使用不同宽度的狭缝孔径（以改变共焦度），这些孔径是通过在光学玻璃上沉积不透明材料薄膜制成的。扫描照明是由柱面透镜元件形成的楔形光，以由物镜数值孔径确定的角度会聚在焦平面上。如上所述，狭缝扫描仪器能够以仅受轴向上像点扩散函数轻微退化的分辨率阻碍的高速图像采集。不利的一面是，狭缝扫描仪目前依赖于线性单像素CCD探测器，其量子效率和噪声特性与科学级CCD相似。这些探测器的灵敏度远低于电子倍增CCD EMCCDs），因此需要显着更高的激发能量来实现类似的信噪比。结果是活细胞成像中的快速光漂白和高水平的光毒性，这限制了在伪影开始掩盖实验结果之前可以获得的扫描次数。通过引入先进的互补金属氧化物半导体(CMOS)或EMCCD型线性电荷耦合器件图像传感器，线扫描共聚焦显微镜将得到显着改进。
一种更先进的高速共焦成像方法涉及使用由旋转Nipkow旋转盘形成的多个平行光束扫描样品，或通过扫描样品上的网格阵列以并行捕获所有图像点。设计后一种仪器的关键要素是创建一个网格图案，该图案能够在单次扫描运动中扫描整个场，同时将照明和检测针孔保持在足够大的间隔距离，以防止针孔之间的荧光发射串扰。尼康“LiveScan”扫场共聚焦显微镜是多点阵列扫描仪的一个很好的例子，它提供了具有不同针孔尺寸的可选网格的额外细化。图3(b))。在操作中，一个由32个照明点组成的网格使用快速检流计和压电元件组合扫过样本场，以控制镜子并以视频速率捕获图像。在狭缝扫描模式下，扫视场共聚焦显微镜能够以接近每秒1200帧的速度捕获图像。该仪器还能够使用声光可调滤光片 (AOTF) 激光控制、专用多波段二色镜和匹配滤光片组进行多色荧光成像。此外，该显微镜可以与高性能、低噪声的 EMCCD 相机系统相结合，使用尽可能低的激发能量对活体标本进行最有效的成像，从而最大限度地减少光漂白和光毒性。
基于 Nipkow 圆盘的旋转圆盘共聚焦显微镜为活体标本的快速扫描提供了绝佳的替代方案。这些仪器基于圆形旋转圆盘，其中包含一个或多个针孔阵列，这些针孔阵列以阿基米德螺线排列，旨在在单个圆盘旋转期间扫描整个样品平面（或在某些设计中更少）。旋转圆盘显微镜也可以使用狭缝而不是针孔操作，但会降低轴向分辨率。先进的旋转盘系统具有双盘，其中包含位于上盘针孔阵列上方的微透镜元件，用于将入射激发照明聚焦在下盘的相应针孔上，以显着增加光通量（如图 3（a）所示））。这种类型的仪器通常被称为宽视场扫描仪、线扫描仪或阵列扫描仪，因为它们在每个图像的采集过程中多次扫描场上的照明点或线阵列。旋转圆盘显微镜的最高成像速度接近每秒 2,000 帧，但由于圆盘的高旋转速度需要多次通过样品的同一部分上的每个照明点，因此仪器通常无法获得如此高的成像速度。用于捕获图像（至少以全帧或半帧大小）的数码相机所需的长积分时间也限制了采集速度。旋转圆盘显微镜通常使用激光器、发光二极管或弧光放电灯进行照明，但在配备适当波长的固态激光器以匹配荧光团激发峰时性能最佳。对于活细胞成像应用，旋转盘或其他阵列扫描共聚焦显微镜通常是首选仪器，尤其是在研究快速细胞动力学时。平行光束可减少光漂白和光毒性，从而实现更长的成像时间。
能够以视频速率对样本进行点扫描的其他技术（尽管没有商用）包括配备声光光束偏转器（AOD；图 3（d））、数字反射镜可编程阵列（DMD；图 4（b））），或旋转多边形镜（图 4（a））。AOD 利用超声波前在晶体中产生压力区，该压力区可以以随声频变化的角度衍射或偏转入射激光。这些固态设备受益于很少的移动机械部件和可忽略的惯性，能够生成具有几乎瞬时反激的高精度锯齿光栅扫描。此外，AOD 扫描仪可以产生用户定义的偏转以生成感兴趣的扫描区域。AOD 显微镜的缺点是基于这些设备的色散特性，它们仅适用于单色光的受控通道。因此，不能对宽带荧光发射进行反扫描，通常使用狭缝孔径进行共聚焦检测，导致轴向分辨率降低和对来自焦平面外区域的荧光的抑制降低。此外，柱面透镜是使激光束形状与晶体的矩形孔径相匹配的必要条件。虽然这些问题已经在一些实验仪器设计中得到解决，但使用 AOD 扫描仪的概念并没有受到显微镜制造商的欢迎。
可编程阵列显微镜 (PAM) 具有数字微镜设备，可作为图像平面中的空间光调制器，以生成用户定义的广泛照明和检测场景。这些仪器在选择能够在反射、透射和荧光模式下工作的光源方面具有很大的多功能性，具有光学切片和多个同时感兴趣的区域选择能力。PAM 仪器设计的核心是DMD 单元，它由微型（约 16 微米）方形反射镜元件组成，这些元件可以单独编程以相对于入射光和反射光旋转“开”或“关”（如图所示）图 4(b)）。DMD允许使用重复模式通过多路复用来增加光学吞吐量，并且它们比点扫描共聚焦显微镜中使用的检流计要快得多。原则上，PAM 仪器可以生成可以通过目镜观察的图像和光学截面，并且荧光发射可以被引导到科学级或电子倍增CCD相机系统。使用DMD设备的主要优点是它们可以由软件控制，没有移动部件（微型镜子除外），并且能够使用两个不同的镜子位置来引导光线通过不同的光路。在这方面，PAM 仪器比旋转圆盘和狭缝扫描显微镜具有更大的灵活性。然而，DMD显微镜在照明方面受到严重限制。照明光束必须扩展以覆盖DMD的整个表面，从而减少任何特定反射镜部分的可用光量，从而使激光照明源的应用具有挑战性。
使用旋转多面镜系统偏转光束是一项成熟的技术，它使用光学简单的非色散表面来创建具有类似于传统视频扫描的基本锯齿光栅的输出光束。多边形镜（图 4（a））已在过去的几个商业和实验共聚焦仪器中使用，但目前显微镜制造商尚未实施。在实践中，多面镜的使用需要相当复杂的光学组件设计，并且这些单元容易在反射率和相对于旋转轴的角度方面发生微小的变化。被称为金字塔错误，这些角度差异会产生必须进行光学校正的光束波动。由于多边形面的数量必须与光栅扫描线的总数成正比，因此通常必须制造专门的镜子以构建共焦仪器。具有 15、25 或 75 条边的多边形必须分别以每分钟 63,000、37,800 或 12,600 转的速度旋转，以便以每秒 15,750 行的速度生成视频扫描速率。这些高速度需要专门的轴承，使仪器设计进一步复杂化。由于这些原因，基于多面镜的共聚焦显微镜很少见，通常被归入特殊兴趣项目。
与点扫描共焦仪器相比，旋转盘、扫场和线扫描共焦系统都在光学切片性能方面受到影响。较差的性能是由于来自样本偏远区域的光可以通过空间串扰泄漏到检测器中，并且在对高荧光厚组织样本进行成像时变得更加严重。此外，一些市售的旋转圆盘仪器采用用户无法调节的固定针孔尺寸，因此这些显微镜仅限于与特定的物镜放大倍率兼容。对于市售的基于狭缝的旋转圆盘显微镜，这种情况要好一些，这些显微镜提供可互换的圆盘以匹配物镜分辨率和放大倍数。然而，上述段落中描述的大多数仪器为了速度而牺牲了最佳的衍射限制照明和检测，并且无法产生商业激光点扫描共聚焦显微镜上可用的平移或缩放功能。然而，这些显微镜能够以视频速率或更高的速度生成培养中的薄贴壁细胞的出色图像。
回顾传统的单点激光扫描共聚焦显微镜，通过使用振镜不断改变光线穿过物镜后焦平面的角度，在样品上扫描扩展的激光束。振镜策略性地彼此成 90 度角放置，以便扫描镜的旋转轴与其自身的表面以及显微镜的光轴重合在远心平面（与物镜后焦平面共轭） . 检流计反射镜的来回旋转将聚焦的激光光斑以光栅图案穿过样品，该光栅图案穿过场的横向尺寸。一面镜子的左右旋转 (x) 创建水平扫描线，而另一个反射镜 (y) 的上下旋转产生垂直偏转。现代共聚焦仪器配备了先进的扫描系统，可以为扫描的样本区域的形状和大小提供高度的灵活性。可以通过将x振镜信号的一部分重新分配到y振镜来旋转扫描角度，反之亦然。同样，可以通过改变振镜的角度扫描范围来实现共焦变焦功能。对于需要对不具有矩形几何形状的选定区域进行光活化或光漂白的实验，能够扫描样品的特定用户定义区域的能力特别有用。
激光扫描显微镜中使用的高性能伺服控制闭环振镜是一项工程奇迹，旨在在超过数十亿次循环的使用寿命内准确旋转连接的反射镜并极其精确地定位光束。检流计的构造类似于电动机，使用转子和定子来驱动定位执行器的运动，它包含整个组件并根据其扭矩惯性比做出响应。根据检流计设计，转子或定子是永磁体，与姊妹组件的线圈相互作用以产生驱动转子的力。机械挡块用于将转子运动限制在有限的旋转弧度内。在大多数共聚焦显微镜中，由于其紧凑的尺寸、高定位精度、优异的刚度和快速响应，移动磁铁致动器是首选。检流计镜面是沉积在硅、熔融石英或铍基板上的银或铝薄膜。振镜最重要的要求之一是它们重量轻且由刚性材料制成，具有不限制光进入物镜孔径的孔径尺寸，并具有高度抛光的表面，平坦至波长的一小部分。反射镜必须在很宽的波长范围内（大约 350 到 700 纳米）具有相同的反射性，并且反射面应以扫描装置的旋转轴为中心。
如上所述，伺服控制的线性检流计由于惯性而在其扫描速度方面受到限制，因此，只能以通常在标准帧尺寸下每秒 1 到 5 个图像的图像采集速率对样本进行光栅扫描。为了实现视频速率，用于水平线扫描的较慢的线性振镜可以用更快的共振扫描振镜代替，该振镜以固定频率振动，是音叉的旋转等效物。在共振检流计（也称为反向旋转扫描仪；CRS)，存储在扭力弹簧或杆组件中的能量用于以正弦方式振荡镜子。这些设备以 4 到 8 kHz 的谐振频率循环，通常接近国家电视系统委员会 ( NTSC ) 视频标准水平频率 15,750 行/秒的比例部分。当使用工作频率为 7,900 赫兹的谐振扫描仪采集 512 条双向逐步扫描的线（奇数线从左到右，偶数线从右到左）时，结果是单个线周期为大约 125 微秒和每秒 30 帧的图像捕获速率。
在给出图5是几个谐振电流计设计具有不同镜孔径（图5的（a）），以及示出的反射镜的振荡运动（的图图5（b）中）。高速（7.9 kHz）谐振振镜反射镜可以围绕中心轴在每个方向上旋转大约 12 度。入射激光激发光以由物理镜位置确定的角度从镜面反射（覆盖总范围为 24 度）。如果根据振荡周期的相位和速度来考虑反射镜运动，则反射镜从-2π（速度为零）到0（最大速度）的相位过渡到+2π（速度为零）。因此，如下文将更详细地描述的，速度在反射镜达到其最大角度的振荡循环结束时最小（或为零），而在反射镜角度为零的循环中心处最大。
共振检流计扫描仪的主要优点之一是它们随着振荡循环的进行而逐渐加速和减速，从而避免在每条扫描线的开始处需要复位信号。为了实现平稳运动，先进的扫描仪配备了两个摆动的质量平衡扭力杆，这些扭力杆经过机械调整以反相共振，以建立相等但相反的扭矩，在外壳连接位置取消。结果是一种无反应的机械振荡器，可消除摆动和外部振动。高速共振扫描仪上的反射镜孔径尺寸约为直径 5 毫米，由镀银或镀铝的光学级铍制成，具有出色的刚度重量比。这些检流计的扫描角度范围为 15 到 26 度，峰峰值。在振荡期间，如图所示从图5(b)和图6可以看出，谐振振镜的角速度呈余弦变化，在0度扫描角（扫描场中心）达到最大速度，在90度角（扫描场中心）达到最小速度。场的边缘），其中扫描方向发生变化。当使用共振扫描仪生成图像时，这些非线性变化在像素时钟方面存在重大问题。
由于共振扫描仪速度的非线性，荧光样本在中心区域以最高速度扫描，随着扫描到达边缘，速度逐渐降低。因此，当使用以恒定像素速率（假设光束是线性扫描的）计时的帧采集器获取来自共振扫描仪的图像数据流时，图像会在边缘处被拉伸。此外，激光激发强度的不均匀分布（在边缘处更大）会在扫描区域的边缘产生过度的光漂白（和潜在的光毒性），因为增加了对激光的暴露。补偿扫描非线性的最简单选择是将扫描范围限制在振镜速度几乎呈线性的振荡周期部分，这发生在跨越总扫描宽度约 70% 的区域上。不幸的是，这种解决方案减少了可以收集发射信号的时间，增加了再次收集信号之前的扫描周转时间，并且不能防止样本区域超出被记录区域的光漂白。然而，当使用振镜振荡的线性部分时，可以通过结合一个可调节的光圈来最大限度地减少光漂白效应，该光圈限制了样品暴露于照明的区域。这发生在跨越总扫描宽度约 70% 的区域上。不幸的是，这种解决方案减少了可以收集发射信号的时间，增加了再次收集信号之前的扫描周转时间，并且不能防止样本区域超出被记录区域的光漂白。然而，当使用振镜振荡的线性部分时，可以通过结合一个可调节的光圈来最大限度地减少光漂白效应，该光圈限制了样品暴露于照明的区域。这发生在跨越总扫描宽度约 70% 的区域上。不幸的是，这种解决方案减少了可以收集发射信号的时间，增加了再次收集信号之前的扫描周转时间，并且不能防止样本区域超出被记录区域的光漂白。然而，当使用振镜振荡的线性部分时，可以通过结合一个可调节的光圈来最大限度地减少光漂白效应，该光圈限制了样品暴露于照明的区域。t 防止在被记录区域之外的样本区域发生光漂白。然而，当使用振镜振荡的线性部分时，可以通过结合一个可调节的光圈来最大限度地减少光漂白效应，该光圈限制了样品暴露于照明的区域。t 防止在被记录区域之外的样本区域发生光漂白。然而，当使用振镜振荡的线性部分时，可以通过结合一个可调节的光圈来最大限度地减少光漂白效应，该光圈限制了样品暴露于照明的区域。
幸运的是，非线性谐振振镜扫描引起的图像失真是可以预测的，并且可以使用软件或硬件解决方案进行校正。不管产生图像所涉及的校正方案如何，最有效的扫描策略包括在检流计反射镜的向前和向后扫描期间收集数据。在正向扫描期间记录数据很简单，但由于反向扫描会反转像素记录的方向，因此必须使用专门的读写缓冲区或软件反转图像数据。实际上，图像以正常宽度的两倍（实际上，1024 像素，最终图像大小为 512 x 512 像素）和正常高度的一半（256 像素）收集。在每个前向x的末尾在谐振振镜镜的 - 轴扫描时，提供给线性 (y)振镜的垂直锯齿信号增加一行，反向 (x) 扫描开始。以这种方式，垂直扫描平稳进行 256 个周期，直到获得足够的图像数据。
共振扫描共聚焦显微镜的软件和硬件时钟解决方案都依赖于了解高频共振振镜的位置数据。在 7.9 kHz 设备上，该反射镜可以围绕中心轴在每个方向上旋转大约 12 度（总共旋转 24 度）。镜像角位置 (θ) 和相位或速度 (φ) 关系可以根据振荡周期的状态进行预测。在振荡周期开始时（镜面位置等于正负 12 度；见图 5 和图 6），镜面静止，速度为零。当反射镜向中点摆动时，角速度作为相位的余弦函数增加，并在反射镜角度为零时达到最大值。继续，当它接近正向扫描的末端时，镜子再次减速，直到它达到等于零的速度，因为它瞬间反转方向。当镜子沿相反方向旋转时，观察到角速度的相同变化。谐振检流计应考虑的另一个因素是，这些器件是高 Q 振荡器，并且由于相位和幅度的大响应变化，即使在自然检流计频率和外部频率之间发生最轻微的漂移时，也无法有效地与外部频率同步。驱动源。因此，谐振检流计本身应用作所有其他定时组件与之同步的主振荡器。
用于共振扫描共聚焦显微镜的基于软件的时钟方案涉及能够使用基于反射镜可预测运动的查找表进行像素数据线性化的算法。例如，一种流行的算法首先确定反射镜和图像采集卡的相位常数，然后定位最终图像的中心像素。该算法围绕中心对称平面运行，其中反射镜位置以高精度已知。当图像被传送到图像采集卡时，通过一次检查一条水平扫描线来处理图像。从扫描仪接收到的像素数据以最终图像宽度的两倍和最终高度的一半存储。该过程的第一步涉及从水平扫描线的后半部分反转数据点，然后在图像前半部分的数据线之间交错反转数据（图 6（b））。由于数据收集与触发采集的水平同步信号的启动之间存在滞后，因此可能无法确定图像的中点，因此软件通常需要将倒置扫描线偏移几个像素。在这种情况下，扫描线的右边缘将用作图像的参考点。该序列的下一步是为每个像素或相对于中心像素的相位位置应用校正因子。然后将该像素重新定位到最终图像中的正确位置（图 6（c））。在理想情况下，使用复杂的高速计算机，可以对传入的数据进行动态分析并实时记录到硬盘驱动器中。
由于谐振检流计会随着温度和振幅的变化而漂移，并且是其他难以控制的变量的宿主，因此设计硬件时钟机制的关键是在整个振荡周期中精确确定扫描镜的瞬时角位置. 目标是每当激光束在正向扫描时从左到右或在反向扫描时从右到左穿过均匀间隔的像素边界时生成时钟脉冲。这些时钟脉冲不会与谐振电流计在时间上均匀分布。如上所述，出现这种差异是因为角速度在扫描范围的中心最大，在那里时钟脉冲将更频繁（具有大约 70 纳秒的间隔）。在极端情况下，在振镜开始改变方向的地方，时钟脉冲将有更大的间隔（接近 160 纳秒）。在理想情况下，时钟脉冲用于触发光电倍增管输出的模数转换，每个像素在最终图像中将代表相等的空间位移。已经开发了几种方法来线性化共振扫描数据（称为扫描线性化）使用硬件，但两个最成功的策略是模拟像素时钟和实时测量反射镜位置的光栅。
像素时钟解决方案的一个示例利用压控振荡器 (VCO) 和相位检测器，以连续跟踪检流计的像素到像素和周期到周期的操作。一旦像素时钟锁定在扫描仪谐振频率上，振荡器就会为计数器提供时钟，该计数器访问存储有关像素位置与扫描速度的信息的存储芯片。存储器通过数模转换器发送存储的信息，该转换器在闭环中为 VCO 供电。VCO 接收到的控制电压用于校正时钟频率以匹配扫描仪余弦速度的变化。作为交叉检查，像素时钟将每个像素触发器的信号发送到相位检测器，该检测器将时序与扫描仪同步电子设备进行比较。检测到的相位误差会生成一个校正电压，该电压反馈到 VCO 以保持与扫描仪的周期到周期同步。VCO 输出用于为检测器处的像素提供时钟。谐振电流计制造商提供了几种先进的专有像素时钟，作为其控制电子设备的选项。然而，大多数生成基于查找表的信号，并且不允许由于机械漂移而发生的扫描模式的微小变化。
先进的基于硬件的像素时钟能够使用从直接跟踪反射镜运动的辅助反馈系统获得的光学数据，在整个扫描周期内直接跟踪反射镜的位置。也许最好的例子首先由 Roger Tsien 和 Brian Bacskai 描述，并作为第一个包含共振扫描仪的商用共聚焦显微镜的基础，尼康RCM-8000，于 1990 年代初推出。高性能尼康A1R 共焦镜头目前采用了类似的时钟系统显微镜系统。简而言之，尼康像素时钟基于使用辅助低功率红外激光系统从谐振振镜的反面反射定时光束。反射光束聚焦在由清晰和不透明条纹组成的光栅（称为Ronchi光栅）上，并与谐振扫描仪周期同步地沿光栅振荡。穿过光栅的光被记录为使用专用光电二极管的强度变化，该光电二极管将信息提供给数字化图像数据的电子元件。由于振镜的位置在振荡时被高精度检测，像素时钟非常准确。
在示出的图7是概述谐振扫描共聚焦显微镜中基于 Ronchi 光栅的可变像素时钟的光学系统组件的示意图。像素时钟中的主要光学和电子元件显示在图的左侧，包括一个低功率半导体近红外激光源、一个包含不同间距Ronchi光栅的可旋转圆盘、中间透镜以聚焦反射激光束照射到 Ronchi 光栅上，光电二极管传感器检测通过光栅的光脉冲。图中右侧显示了激发和成像光学系统中涉及的组件，但为简单起见，成像组件的数量已减少到最少。请注意，图 7 中连接到谐振电流计的镜子两侧具有高反射表面，以容纳成像和时钟激光器。
在操作中，由时钟二极管激光器发射的光被引导到谐振扫描仪反射镜的反射背面，而来自成像系统中涉及的激光器的光从同一反射镜的前侧反射。来自时钟激光器的反射光被一个会聚透镜聚焦，随着振镜的振荡运动同步扫过 Ronchi 光栅的表面。在光栅处，激光束在一系列交替的不透明线和等宽的透明空间上扫描。会聚透镜将时钟光束聚焦到小于光栅中线间距的尺寸，以确保光完全通过或部分被光栅阻挡，以取决于检流计反射镜的位置的交替方式。一个关键点是光栅表面水平的激光束光斑应明显小于光栅线宽，以消除衍射。由振荡电流计引起的光强波动由位于光栅正下方的光电二极管检测。
在谐振电流计的水平扫描周期内，时钟光电二极管记录由 Ronchi 光栅散射的激光脉冲，该脉冲可以电子转换为具有可变频率的像素时钟。当检流计反射镜处于其振荡周期的中心部分时，这些光脉冲会更频繁地出现，但当反射镜到达扫描结束并反转方向时，它们会减慢。光电二极管检测器的要求之一是处理可变脉冲频率（就带宽而言）的能力，并且它必须足够大以检测整个线扫描。检测器连接到跨导放大器，该放大器将光电二极管电流脉冲转换为放大电压，然后将其馈送到一个倍频器电路，该电路将每行的像素数量加倍。光电二极管和相关电子设备每行提供256个脉冲，倍频电路将此输出转换为每行512个脉冲，这些脉冲由图像采集卡采集并用于构建图像。
示于图8是光栅耦合到光电二极管检测器作为可变像素时钟的使用伦奇的背后的基本概念的说明图。为清楚起见，图 8(a)中所示的光栅仅包含八个等宽的间距，叠加有来自谐振电流计的一个完整的余弦运动周期随时间变化（红色曲线；125 微秒）。实际光栅有 256 行间距，并且在线性尺寸上更加紧凑，因为像素时钟激光器实际上在运行中在光栅表面上回扫单条线（垂直于不透明线）（图 8（b）））。当光束进入和离开 Ronchi 光栅的清晰区域时，光电二极管检测到的透射光强度随振镜运动同步上升和下降（图 8（c））。光电二极管检测到的光强度的每个转变（在这种情况下，从暗到亮）用于生成像素时钟（图 8（d）），从而触发显微镜的图像捕获。尽管图 8(d)中所示的时钟脉冲在时间上间隔不均匀（范围从大约 70 到 160 纳秒），但它们仍然对应于图像空间中的相等间隔。
为了以相等的空间间隔（而不是相等的时间增量）获取像素样本，来自主显微镜成像系统的光电倍增管信号通过具有可变增益和偏移的传统放大器，然后由触发的模数转换器进行数字化由 Ronchi 光栅脉冲产生的像素时钟。然而，由于谐振电流计在两个方向上扫描，一半的图像信息被反转。为了在构建图像之前纠正这种双向扫描伪影，首先将数字像素输出传输到先进先出(FIFO) 或后进先出 (LIFO))，缓冲取决于像素是从左到右还是从右到左获取的。因此，在振镜的水平扫描期间，在扫描的前半部分（62.5 微秒的时间段）获取的图像像素被馈送到 FIFO 缓冲区，而在反向扫描期间获取的像素被馈送到 LIFO 缓冲区。FIFO 缓冲区在每个水平线采集开始时被读取并重置为零，而 LIFO 缓冲区在输入数据的存储期间向上计数，在随后的读出期间向下计数，以确保反向扫描期间获取的像素被反转。
与旋转圆盘、扫场和旋转多边形显微镜的情况不同，共振扫描激光共聚焦显微镜能够通过使用多功能共焦变焦功能改变放大倍率而无需改变物镜。变焦控制的物理基础包括改变水平共振振镜扫描镜和垂直线性振镜的旋转角度。较小的扫掠角减少了被扫描样本的面积，同时保持相同的像素数，以有效地提供所选样本细节的放大图像。调用共焦缩放功能需要更改用于可变像素时钟的 Ronchi 光栅中的行间距。图7中的磁盘包含四种尺寸的 Ronchi 光栅，每一种都可以旋转到像素时钟光学系统中以改变缩放系数。当 Ronchi 光栅中的线尺寸和间距尺寸减少一半时（保持相同的总线数），缩放系数增加两倍。同样，将光栅线尺寸尺寸减小 4 倍可将缩放因子增加到 4 倍。可能的缩放设置的数量取决于可变像素时钟可用的 Ronchi 光栅尺寸的数量。尼康 A1R 激光共聚焦显微镜能够进行 7 级变焦，范围从 1 倍到 8 倍。互换光栅需要减小谐振振镜的扫描角，
共振扫描振镜动力学为成像采集速率提供了广泛的选择余地，只需改变所采集图像的尺寸，这与旋转圆盘显微镜中面阵检测器的像素合并非常相似。虽然水平线的扫描速率由振镜的共振周期固定，但可以减少每幅图像使用的线数以产生更快的成像速率。因此，在 512 x 512 像素的图像尺寸下，尼康 A1R 显微镜以每秒 30 帧的速率生成图像。如果收集一半数量的垂直线来获取尺寸为 512 x 256 像素的图像，则帧速率理论上会翻倍，达到每秒 60 帧。请注意，由于重新定位线性（y) 高速下的检流计。对于尼康 A1R 显微镜，共振扫描模式下可实现的最高扫描速率为 420 帧/秒，图像尺寸为 512 x 32 像素。对于许多应用，例如活细胞中的快速钙波成像，减少的垂直图像尺寸是增加速度的可接受的牺牲。
图9中说明的是在活细胞中使用光学荧光笔荧光蛋白的光转换和光活化实验，这显着受益于串联扫描和如此配备的共振扫描共聚焦显微镜的高速能力的组合。图 9(a) 到 9(c)展示了用 mEos2（一种红到绿光可转换荧光蛋白）与连接蛋白 43 间隙连接组分融合标记的间隙连接中的光转换，并在活的 HeLa 细胞中表达。选择一个小区域进行光转换，线性振镜耦合到 405 纳米激光器（图 9（a）），然后用 488 纳米激光器成像（图 9（b）和 9（c））。图9(d)至9(f)显示了与人β-肌动蛋白融合的PA-GFP在肾细胞中的光活化。与图 9(a)类似，感兴趣区域用 405 纳米激光照射，然后在 488 纳米成像。最后，图9(g)至9(i)中呈现了使用发红光点燃荧光蛋白( KFP1 )与线粒体靶向信号的融合的线粒体光开关。图 9(g) 中标记的线粒体在荧光和微分干涉对比 ( DIC ) 模式下使用 561 纳米激光成像. 在用 488 纳米照明完全“关闭”标记的嵌合体后，线粒体看起来没有荧光（图 9（h）），可以通过再次在 561 纳米成像来重新激活（图 9（i））。使用光学荧光笔的研究可以通过共振扫描共聚焦显微镜以必要的成像速度进行，以阐明各种时间尺度上的细胞内动力学。
这些成像技术是由尼康 A1R 扫描仪（见图 1）中的超选择器实现的，它将用于光激活的 405 纳米光子转移到振镜扫描仪，让共振扫描仪自由地同时获取光激活产品的高速图像. 振镜扫描仪可以缩放以限制刺激区域的大小（可以显着加速光激活）。尼康 A1R-MP 多光子显微镜能够在 405 纳米光激活同时使用共振扫描仪采集图像。
传统的激光扫描共聚焦显微镜虽然分辨率高，并且在抑制从焦平面去除的荧光区域产生的光方面具有优势，但其主要缺点是图像采集速度相对较慢。共聚焦技术的主要技术限制是需要快速水平 ( x-axis) 扫描镜，能够实时生成每帧 500 条或更多条线。然而，即使在那些配备标准线性振镜的点扫描共聚焦显微镜的扫描速率相当慢的情况下，构成单个像素的光束停留时间也非常短，并限制了可以收集的信号量。随着提高共焦扫描速度的新技术（例如共振振镜）的引入，争论仍然存在，即继续提高点扫描共焦显微镜速度只会导致信号量减少，直到它最终以最高速度耗尽。这种压倒性的，
与预期相反，有几份报告表明，配备共振扫描仪的高速点扫描共聚焦显微镜可能能够提高信号水平并减少预期的光漂白。这一意想不到的结果很可能源于合成荧光团、量子点和基因编码荧光蛋白的极其复杂的光物理行为，所有这些似乎都能够通过广泛的光谱进行不同程度的光激活、光转换和光切换。无法解释的机制。关于共振扫描共聚焦显微镜，增加的荧光信号可能来自激发照明剂量依赖性响应，该响应由快速扫描调制以产生增加的信号水平。通常，这种响应应取决于聚焦激光光斑的直径和光束扫描样品的速度。结果模拟了荧光团的脉冲照明。因为脉冲照明可以将荧光团转变为黑暗或“关闭”光开关状态，在这种状态下它们避免进入三重态，荧光发射水平增加，而光漂白率有所降低。这些报告尚未得到广泛的实验验证，但在检查活体和固定样本的快速共聚焦成像结果时应牢记这些报告。
共振扫描共聚焦显微镜是一项仍在开发和完善的技术，应该被证明是一种有用的方法，可以在视频速率成像对实验至关重要的条件下，使用细胞、组织和完整生物体来检查大量生物问题。同时利用谐振和线性检流计进行高速成像与特定感兴趣区域的光激活或以优异的光学截面分辨率进行光漂白的能力是其他技术无法轻易实现的额外好处。最先进的仪器能够使用专门的探测器将视频速率共焦扫描与光谱成像相结合，以进一步增强这些显微镜的实用性。例如，使用荧光蛋白 FRET 生物传感器对钙波进行成像需要非常快的采集速度，因为该波可以在不到一秒的时间内穿过细胞。使用传统的共聚焦显微镜，钙成像几乎是不可能的，但使用尼康 A1R 等仪器，可以实时捕获波，并且可以使用光谱检测器解开两种荧光团对 FRET 发射光谱的贡献。这种类型的实验以及无数其他实验将在未来受益于共振扫描激光共聚焦显微镜的检查。可以实时捕获波，并且可以使用光谱检测器分析两种荧光团对 FRET 发射光谱的贡献。这种类型的实验以及无数其他实验将在未来受益于共振扫描激光共聚焦显微镜的检查。可以实时捕获波，并且可以使用光谱检测器分析两种荧光团对 FRET 发射光谱的贡献。这种类型的实验以及无数其他实验将在未来受益于共振扫描激光共聚焦显微镜的检查。
