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体视显微镜中的暗场观察需要一个包含反射镜和遮光板的专用支架，以将倒置的空心锥形照明以斜角导向样品。体视显微镜和更传统的复式显微镜的暗场照明的主要元素是相同的，它们通常配备复杂的多透镜聚光镜系统或聚光镜，聚光镜具有专门的内部反射镜，其中包含以特定几何形状定向的反射表面。
图1 - 暗场体视显微镜配置
暗场显微镜是一种简单而流行的方法，可以使未染色和透明的标本清晰可见。暗场观察的良好候选者通常具有与周围环境非常接近的折射率，并且难以用传统的明场技术成像。例如，组织培养中的小型水生生物、卵母细胞和细胞的折射率范围为 1.2 到 1.4，导致与周围水性介质的光学差异可以忽略不计（折射率为 1.3）。这些和类似的标本是使用暗场照明技术进行观察的理想选择。
图1 中显示的配置说明了配备先进支架的尼康SMZ1500体视显微镜，该支架包含通过安装在支架顶部的透明玻璃载物台提供明场和暗场照明的规定。还描绘了一个数字互联网相机系统（尼康 Dn100），能够将显微镜收集的图像传输给远程观察者。下面讨论暗场照明机制的细节。许多当前的尼康体视显微镜也与暗场照明兼容。
暗场照明标本需要阻挡沿显微镜光轴的中央光线，这些光线通常穿过和围绕（围绕）标本。阻挡这些光线只允许那些以大角度发出的斜光线照射放置在显微镜载物台上的样品。在配备简单聚光器系统的复式显微镜中，聚光器（阿贝式）顶部透镜为球面凹面，使光线从所有方位的表面发出，形成倒置的空心照明锥，其顶点位于样品平面的中心. 如果载物台上没有样品，并且聚光镜的数值孔径大于物镜的数值孔径，则斜光线会由于倾斜而交叉并错过进入物镜前透镜。
图2 - Nikon Diascopic 暗场和明场照明支架
图1所示的体视显微镜使用专门设计的七面环形镜（图 2）产生斜锥照明，大大减少了进入大型公共主物镜前透镜的杂散光。环形反射镜以类似于高数值孔径反射暗场聚光镜的方式工作，该聚光镜配备有具有各种曲率几何形状的内镜面。
互动程序 -环形反射镜
探索镜面形状如何影响暗场体视显微镜中进入物镜的光量。本程序演示了传统反射镜和环形反射镜之间的光路差异。
最流行的暗场聚光镜设计之一，在相衬出现之前大量用于高倍率复式显微镜，是抛物面聚光镜，它具有弯曲的镜像心形内表面。照明光穿过聚光镜并从由抛物面制成的单个表面反射，该抛物面被垂直于聚光镜和显微镜光轴的光阑截断。该系统没有球面像差、色差和彗形像差，并为样品从所有方位角产生清晰聚焦的锥形照明。尽管图 2 和图 3所示的体视显微镜环形镜设计不像抛物面聚光镜那样精密和精确，它在暗场照明样品方面比具有圆柱形几何形状的传统反射镜更有效。图 3 中的图表将环形镜设计与大多数体视显微镜中使用的更传统的柱面镜进行了比较。除了从所有方位提供更均匀的照明外，环形聚光镜设计大大减少了进入物镜前透镜的杂散光量，从而显着增强了样品和背景之间的对比度。
图3 - 环形和传统暗场聚光镜
当将透明样品置于玻璃显微镜载物台上并在暗场照明下观察时，斜光线穿过样品并被光学不连续性（如细胞膜、细胞核和内部细胞器）衍射、反射和/或折射让这些微弱的光线进入物镜。标本然后在黑色背景上显得明亮。在傅立叶光学方面，暗场照明从物镜后焦平面处形成的衍射图案中去除零级（未散射光）。这导致仅由样品散射的高阶衍射强度形成的图像，并且也是暗场观察的主要限制的原因。因为图像完全由来自样本的散射光组成，
图4中的数字图像说明了暗场和明场照明对使用加拿大香脂和显微镜载玻片和盖玻片制备的整个安装标本中的纤维的影响。图4(a)和4(b)比较了尼龙纤维在明场(图4(a))和暗场(图4(b))条件下的对比) 照明。用明场成像的纤维严重缺乏对比度，在白色背景下难以区分细微的细节。相比之下，当使用暗场技术（带环形反射镜照明器的尼康 SMZ1500）对光纤进行照明时，内部光纤细节的可辨别程度更高，景深强调变得更加明显。图 4(c) 中显示了一种纤维在明场对比度过大的情况，菠萝纤维在明场照明下可视化时不透明且几乎不透明。用暗场照明观察相同的菠萝纤维标本会发现更复杂的细节（图 4（d）) 并暴露在明场图像中不明显的纤维中的纵向分裂。
图4 - 明场和暗场照明中的光纤
具有光滑反射表面的样品会产生暗场图像，这主要是由于光反射到物镜中。在样品折射率与周围介质不同或出现折射率梯度（如在膜的边缘）的情况下，光会被样品折射。反射和折射两种情况都会在光的方向上产生相对较小的角度变化，从而使一些光线能够进入物镜。相比之下，一些撞击样品的光也被衍射，产生穿过物镜整个数值孔径范围的 180 度光弧。物镜的分辨率在暗场照明下与在明场条件下实现的分辨率相同，但图像的光学特性（如上所述）没有那么准确地再现。
在暗场显微镜中，通过在黑暗背景上叠加明亮的样本，对比度大大增强。通过不透明光阑阻挡零级光线，只能使更高阶的光线用照明照射样品。高度倾斜的光线，被样品衍射并在物镜的后焦平面上产生一阶、二阶和更高的衍射级，进入图像平面，在那里它们相互干扰以产生样品的图像。
如果使用 Bertrand 透镜或目镜望远镜观察在暗场照明下操作的体视显微镜中的物镜后部，它会显得充满光。微弱的衍射光在目镜光阑平面上重组为可见图像，其对比度反转以在暗背景上产生明亮的图像。由于暗场显微镜消除了明亮的、未衍射的零级光，这种形式的照明非常浪费光，因此需要高强度的照明源。为暗场照明配备的体视显微镜照明支架考虑到了这一因素，并提供了高强度卤钨灯泡，以产生足够的光通量。
图5 - 光纤环形光暗场照明器
目前有许多售后产品可用于改装具有透射暗场照明的体视显微镜。此外，许多显微镜制造商提供照明附件，可方便地利用这些附件为他们的立体系统实现暗场条件。典型的售后暗场照明器如图 5 和图 6 所示。图 5所示的设计利用光纤环形灯为特制的舞台提供照明，该舞台包含一个内部镜子系统和一个不透明的光挡。来自环形灯照明器的光从内部柱面镜反射，中心（零级）光线被光阑阻挡，形成倒锥形照明。样品直接放置在舞台光圈上方的玻璃板上，然后可以用暗场照明进行可视化。环形灯配备外部光源，其中包含电源和高强度卤钨灯。另一种暗场聚光镜设计，也包含明场照明的规定，如图 6 所示.该聚光器系统利用滑块在明场和暗场照明之间旋转，还包含一个通过光纤束耦合到聚光器的光源。
体视显微镜中暗场照明的理想候选对象包括微小的活水生生物、硅藻、小昆虫、骨骼、纤维、头发、未染色的细菌、酵母和原生动物。非生物样本包括矿物质、化学晶体、胶体颗粒、玻璃、陶瓷、聚合物薄片和折射率梯度中的夹杂物和孔隙。在准备暗场显微镜标本时应小心，因为位于焦平面上方和下方的特征，尤其是指纹、灰尘、纤维和清洁残留物，也会散射光并导致图像质量下降。样品厚度和显微镜载玻片厚度也非常重要，一般来说，薄样品是可取的，以消除可能干扰图像形成的衍射伪影的可能性。
图6 - 明场/暗场显微镜照明器
在暗场照明的适当条件下成像的标本在外观上非常壮观（例如，尝试一滴新鲜血液）。通常，明场显微镜中固有对比度非常低的标本在暗场中很容易观察到，这种类型的照明非常适合揭示轮廓、边缘、边界和折射率梯度。不幸的是，暗场照明对于揭示内部细节不太有用。其他类型的标本，包括许多被染料染色的标本，在暗场条件下也对光照反应良好。这些包括植物和树木的薄切片（染色和未染色）、硅藻、放射虫、化石、骨骼切片、胚胎和头发（人和动物）。
在20世纪上半叶，暗场显微镜（复式式和立体式）拥有非常强大的追随者，并且在优化暗场聚光镜系统和照明器方面花费了大量精力。随着相位对比、微分干涉对比和霍夫曼调制对比等更先进的对比度增强技术的出现，这种强烈的兴趣慢慢开始消退。最近，正在引入新的体视显微镜照明技术，例如尼康的倾斜相干对比度，可显着增加透明标本的对比度，并且最终可能会取代暗场体视显微镜的大量兴趣。然而，
暗场显微镜仍然是生物学和医学研究的绝佳工具。该技术可以有效地用于查看广泛的生物医学和工业标本，并且通常可以揭示其他照明方法不可见的细节。
