- 您好，欢迎您访问成贯仪器官方网站！
显微镜物镜的分辨能力来捕获偏离的光线从标本取决于两者的数值孔径和介质通过光的传播。
数值孔径是有关通过方程成像介质：
其中μ是二分之一的物镜的孔径角和n是物镜前透镜和标本盖玻片之间的介质的折射率。
如从上面的数值孔径方程明显，物镜的数值孔径正比于盖玻片和前透镜之间的成像介质的折射率（n），并且还向二分之一的角孔径的sin物镜。 因为sin μ不能大于90度，最大可能数值孔径是由液浸介质的折射率确定。大多数显微镜物镜使用空气作为通过它的光线必须盖玻片保护样品和物镜的前透镜之间传递的介质。 因为它们是没有液体的成像介质中使用的这种类型的物镜被称为干的物镜。 空气具有1.0003的折射率，非常接近真空的，并大大低于大多数液体，包括水（N = 1.33），甘油（N = 1.470）和一般的显微镜浸油（n平均= 1.515）。 在实践中，干式物镜系统的最大数值孔径限制为0.95，并且只能使用设计用于浸没介质光学来实现更大的值。
油浸的原理是体现在图1中，其中个别的光线穿过样品跟踪，要么通入物镜或在其他方向上被折射。 图1（a）示出了具有示出穿过该覆盖有盖玻片的样品5的光线（通过5标为1）一个干物镜的情况下。 这些射线被在盖玻片 - 空气界面和仅最靠近光轴的两条光线（光线1和2）在显微镜的具有适当的角度进入物镜前透镜折射。 第三光线以约30度至盖玻片的角度折射，并且不进入物镜。 最后两个射线（4和5）在内部反射回通过盖玻片，并与第三光线沿，在倾向于劣化的图像分辨率玻璃表面向光的内部反射。 当空气由相同的折射率的玻璃，在图1中所示的油代替（b）中，光线现在直接通过玻璃 - 油界面而不偏离传递由于折射。 由此，数值孔径增加n的因子，石油的折射率。 这种现象可以在交互式Java教程探索浸油和数值孔径 。
设计为与浸油的使用显微镜物镜有许多优于那些使用干优点。 沉浸物镜通常是更高的修正（无论是萤石复消色差或），并可以与具有合适的分散性和粘度浸油使用时成立工作数值孔径1.40。 这些物镜允许载物台聚光器隔膜被打开到更大程度，从而延长了检体的照明，并采取增加数值孔径的优点。
用增加数值孔径的油浸物镜时所经常被忽视的一个因素是由载物台聚光器放置在系统上的限制。 在式中NA的油物镜= 1.40被用于图像的检体具有较小的数值孔径（1.0例子）的载物台聚光器的情况下，在聚光镜的下部数值孔径将覆盖物镜和的总的NA的系统被限制到1.0，聚光镜的数值孔径。
现代载物台聚光镜往往有高度的修正（见我们对部分聚光镜 ）与1.0和1.40之间不等数值孔径。 为了有效地利用油浸的所有好处，载物台聚光前透镜和含有样品的显微镜载片的底面之间的界面应当也浸入在油中。 一个理想的系统被示意性地可图示于图2，其中浸油已被放置在接口上的物镜前透镜和样品载玻片之间，并在聚光镜的前透镜和试样滑动的下侧之间。
该系统已被称为一个齐浸没系统 ，这是理想的情况，以达到最大的数值孔径和分辨率在光学显微镜。 在这种情况下，物镜前透镜，浸油，载物台聚光前透镜，和安装介质的折射率和色散相等或非常接近相等。 在这个理想系统中，倾斜的光线可以穿过聚光透镜和完全通过显微镜载玻片，浸油，并通过折射在油 - 玻璃或安装介质 - 玻璃界面封固剂非偏移。
当使用高功率消色差油浸物镜时，有时允许忽略注油聚光顶端透镜的步骤。 这是因为聚光镜孔径光阑必须经常与较少校正物镜被减少，以消除伪影并提供最佳的成像。 在膜片尺寸的减少降低了在数值孔径的电位增加（由注油聚光透镜设置），所以在这些条件下的图像质量的损失通常是可以忽略不计。
有多种已设计优化浸没显微镜技术市售合成油。 许多国家已经公布自己的标准为浸没油的必要品质和国际标准组织已经认识到通用浸没油中的ISO 8036标准的光学性质：
ne = 1.5180±0.0005（N D = 1.515）
Ve = 44±3（阿贝数-分散的度量）
温度= 23±0.1摄氏度
除了光学性质的严格控制，浸油也必须具有合适的物理化学特性，如是非干燥，惰性的光学表面的涂层，无荧光的，化学惰性的，无毒，并易于除去。 大多数显微镜制成品与他们的物镜，是专门匹配到物镜的分散性提供一个专门浸油。 确保所有售后油你购买满足分散的标准匹配为其油预期的物镜。 一些老商业生产浸油（尤其是那些超过10年前制造）含有大量显著多氯联苯的。 这些油是致癌物质，应避免使用，如果没有这个危险化学品但大多数较新的浸油制成，是完全可以放心使用。 浸泡媒体的最大的制造商的Cargille Laboratories公司，雪松树丛，新泽西谁制造五个标准类型的油的：
正常光学显微镜 -最常见的浸油会议分成两个粘度要求（ 类型A和B）：150和1250厘沲。 这些油可以混合生产中间粘度。
高粘度油（类型NVH） -有21,000厘沲的粘度，这种油是受欢迎的倒置，水平和倾斜的应用程序和也为利用宽聚光镜间隙很长的工作距离的物镜和样品。
荧光显微镜（DF型） -这产生具有荧光显微镜的最高分辨率的油。 这种油产生的背景颜色是淡绿色的。
荧光显微镜（FF型） -改进的油，基本上没有背景荧光，是清澈的和非吸湿性。 这种油通常被称为“通用”油，因为它可以与几乎任何其他浸油信心荧光应用被取代。
表1列出了三种最常见的类型的Cargille实验室浸渍油的性质。
| 属性 | A型 | B型 | NVH型 |
|---|---|---|---|
nF （氢F线） | 1.5236 | 1.5236 | 1.5227 |
nC （氢C线） | 1.5115 | 1.5115 | 1.5118 |
| nD （D线钠） | 1.5150 | 1.5150 | 1.5150 |
ne （非凡） | 1.5180 | 1.5180 | 1.5176 |
| 平均色散（nF - nC） | 0.0121 | 0.0121 | 0.0109 |
| 阿贝数 （VD） | 42.6 | 42.6 | 47.2 |
| 温度系数 （-dn/dt） | 0.00033 | 0.00033 | 0.00031 |
| 荧光（紫外线） | 非常低 | 低 | 低 |
| 粘性 （cSt or mm2/s） | 150（低） | 1250（高） | 2100 （非常高） |
与普通浸渍油的主要问题是在谱（低于约375纳米）的紫外区域其固有的高吸收特性。 这不会影响大多数与浸没介质所做的可见光光学显微镜，但在低于400纳米的波长试图图像的标本时，它可能会导致麻烦。 甘油的紫外线吸收是在400-350纳米区域忽略不计，所以在纯溶剂，或者90:10混合物与水，可用于与近紫外显微镜浸没技术。
红外（IR）显微镜也合并在波长超过700纳米从浸没材料的吸收而产生的伪影。 对于红外显微镜唯一实用介质是石蜡油，这也是荧光浸没显微镜有用的，因为它具有波长可忽略的荧光下降到350纳米。
在表2中列出的浸没介质的折射率的宽光谱，并且是各种不同的光学显微镜技术是有用的。 大多数与折射率介质的等于或高于玻璃在共同的生物学明，相衬，DIC和荧光显微镜被用于低。 具有非常高的折射率，比如溴萘和二碘甲烷的那些媒体，用专门的物镜使用，以实现最高的数值孔径和分辨率可能的，并且也在反射光显微术对具有非常低的或变化的反射率的材料非常有用。
| 材料 | 折射率 |
|---|---|
| 空气 | 1.0003 |
| 水 | 1.333 |
| 甘油 | 1.4695 |
| 石蜡油 | 1.480 |
| 柏木油 | 1.515 |
| 合成油 | 1.515 |
| 茴香醚 | 1.5178 |
| 溴萘 | 1.6585 |
| 二碘甲烷 | 1.740 |
在组织和细胞培养技术现代进步引发了能够被在生理盐水溶液沐浴图像活细胞和组织的兴趣。 生物体组织内部的细胞动力学，目前正在大力研究了定量光学成像技术，包括共焦，微分干涉对比（DIC），和落射荧光显微镜。 活细胞的平均折射率为1.35，非常接近其周围的缓冲含水盐溶液（N = 1.33）必须存在以支持正在进行的细胞活动的。 使用长工作距离干物镜的可视化在含水组织培养细胞时会出现一个问题，由于从将掩盖检体的细节中的液体的表面反射。 同样地，使用的油浸物镜观察活细胞也有问题，由于水的成像介质和物镜的前透镜的玻璃之间的折射率差异。
在图3所示的物镜旨在用于成像的细胞，并在缓冲盐溶液的组织，而在观察期间提供足够的空间用于样品的显微操作。 鼻子（或浸渍锥），房屋物镜的前镜头元件在一个43度的角锥形允许的方式陡峭的倾斜度可轻松访问由机械手或微电极样品，同时保持标本和物镜浸入解。 这些物镜还有很长的工作距离范围从为2.0毫米（60倍平场萤石）到3.3毫米（10倍 - 40X平场萤石），它们也允许样品的显微额外的空间非常有用。 在这一系列的物镜数值孔径相媲美（通常略高），那些在典型的干计划萤石找到。 这种类型的物镜是由所有主要的显微镜公司，包括制造奥林巴斯 ， 蔡司 ， 徕卡 ， 尼康 ，常制造商提供了在组织培养样品和其他生物样品的显微有用的附加 配件。
分辨率和增强水浸泡物镜看到细节的优良示范如图4所示与活鼠提睾肌组织培养的观察。
图4（a）是与位于正上方的空气/水界面正常干燥4倍物镜采取的大鼠组织的显微照片。 注意失真和发生的样本的模糊，由于从水的表面反射。 这些效应被消除，如图4（b）中，这是相同的视场的显微照片，但使用4倍水浸物镜。 这个图像是相当尖锐，并显示细节比由干物镜提供更大的分辨率。
与成像组织样品的另一个问题是检查在高放大倍率的标本时通过油浸物镜表现出分辨率和照度的范围有限。浸没物镜通常在深度超过10微米到样品时，它是由一个盖玻片覆盖，并在水溶液中沐浴失去其优越的成像性能。 这个问题在图5（a）所示，其中光线跟踪表明在水介质球体使用时油浸物镜到图像样品通过浸油具有n= 1.515被扭曲成一个明显的细长椭圆形。
用水浸物镜时，相同的球体保持球形，即使在成像光线仍然必须穿过玻璃盖玻片等于1.515的折射率。 水浸泡的物镜还消除通过水溶液观看标本时，常常产生球面象差。 这些先进的物镜也具有增加的轴向分辨率，往往等于该数值孔径的理论极限，它们产生呈对比度，分辨率，并提供照明的较高的强度。
为油浸显微镜技术提示
在显微镜的第一个规则是保持光学元件完全自由的灰尘，污垢，油，溶剂和任何其它污染物。 显微镜应保持在低振动无烟房间，干净越好，并具有循环空气的干扰最小。 在显微镜使用中使用防尘罩时没有，并保持所有配件在密封的容器中。 避免使用腐蚀性溶剂清洁显微镜的任何部分，并且只使用稀释的肥皂水清洗非光学表面。 油应采用牢记下面的技巧和注意事项：
第一步是找到具有低功率物镜样品并且使得感兴趣区域是方形的阶段开口的中心部分的显微镜载玻片的位置。 常常希望以转动浸泡的物镜（无油）到位，以确保样品的正确的位置。 使用油浸渍技术是很重要的时候也适用油的显微镜载玻片的下侧，并载物台聚光镜的顶部透镜以形成两者之间的油珠，如下所述实现最佳的结果。 大多数现代显微镜提供在机械阶段相对宽的椭圆形开口，以允许在所述显微镜载玻片的底部和聚光镜的前透镜之间的区域中使用的油。
摆动浸泡的物镜在消防水枪一个位置，这将是旋转到直接在上面的样本的光通路中的下一个物镜。用一块不起毛的纸或滴管中放置少量油直接滴在浸泡的物镜的镜头前。 接下来，将油另一个液滴上面立即要成像的区域中的盖玻璃。 许多由制造的较新的油浸物镜奥林巴斯和尼康使用平凹前透镜在其浸入物镜，当务之急是上油物镜前透镜不的步骤与这些物镜被省略。 失败以填充凹“腔”在这些物镜可能导致产生严重的耀斑和图象劣化的微小气泡的滞留。
慢慢地降低油物镜变成油使用粗调焦旋钮调节显微镜盖玻片的小水池。 当油覆盖的物镜前透镜使得在盖玻片与油接触，散射光的一小闪光灯将在油路口发射，表明这两个油池已合并。 要非常小心这一步，因为货架物镜太靠近盖玻片可能会导致两者之间的碰撞，可能导致损坏。
将样本慢慢成为关注的焦点采用粗调，直到细节才开始变得可见，然后切换到微调对样品到正确的焦点。 重要的是要记住，大多数萤石复消色差透镜物镜的工作距离小于一毫米的十分之一，导致在很窄的范围内微调旋钮的调整是很重要的，所以仔细监视物镜的方法油池，同时无论是用粗或细的调整降低了。 虽然最大功率浸油物镜具有可缩回到物镜的主体弹簧加载前端，小心使用这些物镜仍可以驱动物镜入试样滑动造成损坏。
由许多显微镜使用的另一种方法是定位在使用低功率的物镜显微镜的光路的中心将被成像的区域。接着，油浸物镜（无油）被放置到光路和感兴趣的样品面积大致带进视场的中心和聚焦。 这个预定位置的所有系统中为另外的油制备的组分。 摆动浸没物镜到相邻站上的显微镜物镜转换器和如以上所讨论适用油既物镜前透镜和标本。 接下来，快速旋转的油物镜入试样合并两个油滴（一个样本和一个在物镜）到一个单一的游泳池上方的位置。 该标本是现在可以观察和显微摄影。
对于将油载物台聚光镜的前置镜头，可使用以下考虑：
做出一定的显微镜的机械阶段具有足够尺寸的开口，以允许油样品的扫描而不溢出油到台上的底部。 许多先进的科研显微镜有一个阶段的插入是可移动的油使用。 将油到聚光镜顶级镜头前，取下显微镜阶段标本载玻片。
以类似于注油物镜的方式，放置的油的显微镜载玻片的底部下降，并应用了类似的下降到载物台聚光镜的前透镜。 确保聚光镜在其机架更换舞台上的显微镜载玻片之前略有降低。 载玻片已经被放置在该阶段之后，齿条聚光镜返回到适当的位置，同时仔细观察聚光透镜和显微镜载玻片上的油滴。 这些液滴应合并成一个作为聚光镜被带入正确位置。
作为扫描一个上油显微镜载玻片的表面上，定期观察台的位置相对于所述物镜和聚光镜前透镜，以确保有石油这些元素和所述显微镜载玻片之间的连续珠。 当在显微镜载玻片上的大面积扫描，常常需要重新应用一些油，以确保所述成像介质的连续性。
| 保持镜片清洁，无油 |
|---|
| 一直努力确保您的显微镜的物镜和载物台聚光镜头前保持清洁，无浸油的。 许多制造商广告被报道具有如此高的蒸气压的溶剂不会蒸发非干浸油，留下结晶残渣光学表面上。 这可能是几乎真实在一些情况下，但它是危险的昂贵的光学仪器赌博。 用棉签或不起毛的纸或布实验完成后，轻轻地从镜头和显微镜载玻片擦拭多余的油。 油被删除后，使用适当的溶剂从镜片取出浸油的痕迹。 未能正确清洁镜头，可能会导致小晶粒形成涂层表面上，当浸泡油是干或收集灰尘和大气中其他污染颗粒。 |
