
在50年代中期,一个名为乔治诺马斯基法国光学理论家修改用于标本检测光渐变并将它们转换为强度差异的沃拉斯顿棱镜。 今天有这种设计的几个实施方式中,它们统称微分干涉对比(DIC)。 生活或染色标本,这往往产生于明照明查看时较差的图像,是由光学,而不是化学手段清晰可见。
在透射光中的DIC,来自灯的光通过位于台下聚光镜下方的偏振器,以类似于偏光显微镜的方式。 在光路中下一个(但仍聚光镜下方)是偏振光的入射光束分成两道光束稍微不同的方向行进的在修改的渥拉斯顿棱镜。 渥拉斯顿棱镜由胶结在一起的两个石英楔,从中新兴光线振动在相对于彼此有轻微的路径差90度。 需要针对不同的放大每个物镜不同的沃拉斯顿棱镜。 渥拉斯顿棱镜通常装入聚光镜上,它允许显微镜来改变放大倍数时,适当的棱镜旋转到光路中的旋转转台。
平面偏振光,在垂直于光束的传播方向的振动仅在一个方向(东 - 西),进入分束改性沃拉斯顿棱镜,分成两条射线,彼此垂直的振动。 这两个射线行进并拢但稍有不同的方向(见图2)。 的光线相交于聚光镜,在那里他们通过在轻微路径差一起行进平行和非常接近的前焦面,但它们彼此垂直的振动和因此不能引起干扰。 的光线之间的距离,称为剪切,是如此分钟,它是小于物镜的分辨能力。
分裂光束进入和穿过其中,其波径是按照检体的变化厚度,山坡,和折射率改变的样品。 这些变化会引起在通过的任何标本细节紧贴在一起领域两个光束的波路径变化。 当平行光束进入物镜,它们被集中在那里输入的第二变形沃拉斯顿棱镜,结合了两个光束在一个限定的距离,棱镜本身以外的后侧焦点面的上方。 这消除了剪切和梁对之间的原始路径差。 如在穿过试样的结果,平行光束的路径是相同的长度(光程差),用于不同样品的区域的不。
为了使光束干涉,不同的路径长度的光束的振动必须进入同一平面及轴。 这是通过将上部渥拉斯顿光束组合棱镜上方的第二偏振器(分析器)来完成。 光然后朝着在那里可以观察到的强度和颜色差异的目镜前进。 设计结果中的细节的一侧出现明亮的(或可能有颜色),而另一侧看起来更暗(或其它颜色)。 此阴影效果赋予一个伪三维外观的样品。
在一些显微镜,上部改性沃拉斯顿棱镜在与它上面引入分析器的单个接头相结合。 上部棱镜也可以被布置成使得它可以水平移动。 这允许通过移动棱镜,提供用户的机构,以改变背景和标本的亮度和颜色变化的光程差。 由于棱镜设计和展示位置,背景将是均匀已经选择什么颜色。
在图像中示出的颜色和/或光强度的效果都与特别是在折射率的变化率,试样厚度,或者两者兼而有之。 样品的取向可以对浮雕状外观明显的影响,通常,由180度的检体的转动改变一个山成山谷或反之亦然。 三维外观并不的检体的真正几何性质的表示,但是基于光学厚度夸张。 它不适合于实际的高度和深度的精确测量。
相比相差显微镜有在DIC显微镜许多优点。 与DIC,能够更充分地利用该系统的数值孔径,并以提供光学染色(色)。 DIC还允许显微镜来实现出色的分辨率。 充满物镜孔径的使用使得该显微镜专注于一个厚的样品的薄平面部分,而不从平面的上方或下方混淆图像。 恼人的光晕,在相衬经常遇到,是在DIC图像不存在,以及适当的消色差和萤石物镜可以用于这项工作。
不利的一面是塑料的组织培养皿等双折射标本产生混乱的图像DIC,因此被推荐用于组织培养工作霍夫曼调制对比。 此外,高品质的复消色差的物镜现在被设计成适合于DIC。 图3呈现透射和反射的绿头苍蝇的口器的光DIC显微照片(透射DIC;图3(a))和在一个铁硅酸盐合金表面缺陷(反射DIC;如图3(b))。 这两种显微照片是使用相位差板具有10倍的物镜的。
所需DIC显微镜设备包括一个偏振器,一个分束改性聚光镜下方沃拉斯顿棱镜,光束重新组合改性渥拉斯顿棱镜的物镜的上方,该上棱镜上方的分析器。 个别棱镜需要(对于每个物镜)聚光镜下方(图4)。 对于上棱镜,单棱镜可以服务于所有的物镜。 上部棱镜可横向移动。
下部棱镜的放置相对于聚光镜的前焦面和上棱镜的从物镜的后焦平面的距离的距离是相当关键的。 因此,制造商指定哪些他们的物镜是符合其特定DIC设备。
DIC的聚光镜包含四个或更多个棱镜,一个明开口与孔径光圈定期明的工作,和/或多个光的环。 光年轮,相位物镜一起,使显微镜,使相衬和DIC图像之间的快速比较。 可旋转偏振器安装在棱镜之下。 充满物镜孔径的使用使得聚焦于厚的样品的薄平面部分,而不混淆从上方或正被聚焦在平面之下的图像; 这就是所谓的光学切片 。 大光圈也能产生在光学显微镜更高的分辨率。
在图像中示出的颜色和/或光强度的效果都与特别是在折射率 , 厚度或两者中的信息,或样品的相邻区域的变化率。 图像显示3维。 此外观并不代表检体的真正几何性质,但是基于光学厚度夸张,并且是不适合实际高度和深度的精确测量。 光学厚度是指在从折射率或实际厚度或这两个变量的某些组合变化导致的光路变化。
如上所述,在可动上棱镜的灰度设定,3-维最为明显。 样品的取向可以显著改善浮雕状外观。 有时标本180度的旋转变化的山上走入低谷 ,反之亦然; 因此图像的解释,必须谨慎进行。 一侧的较暗的外观和对细节的另一侧的打火机外形通过给伪浮雕效果大大提高了能见度。
要配置DIC对比度增强显微镜,下面的步骤应考虑:
放置DIC聚光镜进入显微镜的台下聚光器保持器和适合的DIC Wollaston棱镜成开槽管口或每个物镜后面槽。 使用10X物镜,并在明视野中的光路(0)的位置和偏振器的聚光镜,设置科勒照明用的载物台上就位的样品。 将试样出来的光路并移除目镜之一。
插入一个阶段集中到望远镜目镜管,一边看着物镜的后焦面,直到你看到一个黑色的对角线线条出现在物镜的背面的中心旋转棱镜上的螺丝。 现在稍微旋转台下偏光片,使黑线显示为黑色越好。此,实际上,正在调整偏振片,使其越过 (在90度角)与位于上部棱镜上述分析仪。 确保聚光镜孔径光阑是开放的2/3到物镜的背面透镜直径的4/5。
卸下聚焦望远镜和目镜定期返回到目镜。 转动聚光器转盘带来相应的棱镜下进入光路; 这通常是通过在炮塔的红色或白色10设置标志。 将试样转移回光路。 现在你可以使用上棱镜的旋钮把它移动来回横向达到预期效果或颜色。 你也可以旋转阶段改变试样的取向,以提高的效果。
采取类似步骤为每个物镜被使用,确保在显微镜通过调节两个字段和孔径光阑正确配置科勒照明对于每个物镜依次。
较特别相差显微镜这些都是在DIC的显微镜许多优点:
能够更充分地利用该系统的数值孔径,因为不像相差显微镜,没有台下环形限制孔; 柯勒照明得到适当的使用。
还有如可以在相图像中没有遇到混乱晕。
图像可以在醒物镜颜色( 光学染色 )和在3维阴影状的外观看到。 轮廓和细节的知名度大大提高,而这些图像的显微摄影的色彩和细节是惊人的。
定期平场消色差或消色差透镜(同样适用于普通明工作)可以如果制造商指出这些物镜被设计用于其装置可以使用。
有几个缺点或限制在DIC:
该设备DIC是因为需要的多棱镜的相当昂贵。
双折射标本,如那些在多种晶体发现可能不是因为在偏振光其效果是合适的。 同样地,试样载体,例如培养容器,皮氏培养皿等,由塑料制成的可能不适合。 对于这样的标本,霍夫曼调制对比度可能是更好的选择。
对于非常薄的或散射的标本,更好的图像可使用相衬方法来实现。
复消色差的物镜可能不适合,因为这样的物镜本身可能显著影响偏振光。
再一次,像许多的对比增强技术,我们发现,在在物镜的后焦平面聚光镜和前焦平面光的操纵具有时即通过目镜可视图像的外观显著效果。