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在显微镜中，术语“分辨率”用于描述显微镜区分细节的能力。换句话说，这是样本的两个不同点（无论是观察者还是显微镜相机）仍可以作为独立实体看到的最小距离。
显微镜的分辨率本质上与光学组件的数值孔径（NA）以及用于检查样本的光的波长有关。另外，我们必须考虑衍射极限，这是恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）在1873年提出的。
本文介绍了这些概念背后的一些历史，并使用相对简单的术语解释了每个概念。
数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜（NA = nx sinα）的角孔径（α）有关。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的数值孔径，还取决于整个系统的数值孔径，同时还要考虑到显微镜聚光镜的数值孔径。在所有光学组件都正确对齐，具有相对较高的NA值且彼此协调工作的显微镜系统中，将解决更多的图像细节。分辨率还与用于对标本成像的光的波长有关。短波长的光比长波长的光能够分辨更多的细节。
处理分辨率时，需要考虑三个数学概念：“阿贝衍射极限”，“艾里斑片”和“瑞利准则”。这些内容按时间顺序在下面介绍。
乔治·比德尔·艾里（George Biddell Airy，1801-1892年）是一位英国数学家和天文学家。到1826年（25岁），他被任命为三一学院的数学教授，两年后，他被任命为新的剑桥天文台的天文学教授。从1835年到1881年，他是“皇家天文学家”，并以他的名字命名了月球和火星陨石坑。
同样在1835年，他在《剑桥哲学学会学报》上发表了题为“关于具有圆孔的物镜的衍射”的论文。艾里非常从天文学家的角度撰写了这篇论文，他在论文中描述了“好望远镜所看到的围绕恒星图像的环或射线的形式和亮度”。尽管在不同的科学领域进行了写作，但这些观察结果与其他光学系统以及显微镜有关。
的艾里斑是可以通过一个圆形孔在通过衍射限制的完全对准的系统来确定的光的最佳聚焦点。从上方看（图1），它看起来像是一个亮点，周围是同心环或波纹（更正确地称为Airy Pattern）。
衍射图案由光的波长和光通过的孔径的大小确定。艾里斑的中心点包含大约84％的发光强度，其余16％围绕该点分布在衍射图中。当用显微镜观察时，样本中当然有很多光点，更合适的是考虑多种艾里图案，而不是术语“艾里盘”所描述的单个光。
如图1下半部分所示的艾里图案的三维表示也称为“点扩展函数”。
图1：一个艾里模式的典型现象，也称为艾里盘，其中心最大光点和环绕的衍射环。
恩斯特·卡尔·阿贝（Ernst Karl Abbe，1840-1905年）是德国数学家和物理学家，在1866年，他遇到了卡尔·蔡司（Carl Zeiss），他们一起创立了被称为“蔡司光学厂”（Zeiss Optical Works）的蔡司。此外，他还于1884年与他人共同创立了Schott Glassworks。阿贝也是第一个定义数值孔径的人。1873年，阿贝发表了他的理论和公式，解释了显微镜的衍射极限。阿贝认识到标本图像由多个重叠的，多强度的衍射极限点（或艾里斑）组成。
为了提高分辨率（d =λ/ 2 NA），必须使用较短波长（λ）的光或通过具有较高折射率的成像介质或具有较高NA的光学组件（或，实际上是所有这些因素的组合）。
但是，即使考虑到所有这些因素，由于整个系统的复杂性，波长在400 nm以下的玻璃的透射特性以及在整个显微镜中获得高NA的影响，实际显微镜系统的限制仍然受到一定限制。显微镜。在理想的光学显微镜中，横向分辨率限制在200 nm附近，而轴向分辨率大约在500 nm（有关分辨率限制的示例，请参见下文）。
约翰·威廉·斯特鲁特（John William Strutt），第三任雷利男爵（1842-1919）是一位英国物理学家，也是一位多产的作家。在他的一生中，他撰写了466篇令人惊讶的出版物，其中包括430篇科学论文。他撰写了广泛的主题，包括鸟类飞行，心理研究，声学等。1895年，他发现了氩气（后来，他又为此获得了1904年诺贝尔物理学奖）。
Rayleigh建立和扩展了George Airy的工作，并于1896年发明了“ Rayleigh Criterion”理论。RayleighCriterion（图2）定义了衍射极限系统中的分辨率极限，换句话说，当两个点光线是可区分的或彼此分辨的。
根据艾里盘的理论，如果两个单独的艾里盘的衍射图不重叠，那么它们很容易区分，“分辨良好”，并且符合瑞利准则（图2，左）。当一个Airy圆盘的中心与另一个圆盘的衍射图的第一个最小值直接重叠时，可以认为它们是“刚刚分辨的”，仍然可以区分为两个单独的光点（图2中部）。如果艾里斑比这更近，则它们不符合瑞利准则，并且不会“分辨”为两个不同的光点（或样本图像中的单独细节；右图2）。
图2：两个单艾里盘的重叠衍射图显示的分辨率极限（由瑞利准则定义）：左：分辨率良好中：分辨率良好右：未分辨率
考虑到所有上述理论，很明显在计算分辨率的理论极限时需要考虑许多因素。分辨率也取决于样品的性质。让我们看一下使用阿贝衍射极限以及瑞利准则来计算分辨率。
首先，应记住：
NA = n x sinα
其中，n是成像介质的折射率，α是物镜角孔的一半。物镜的最大角孔径约为144o。该角度的一半的正弦值为0.95。如果将浸没物镜与折射率为1.52的油一起使用，则物镜的最大NA将为1.45。如果使用“干式”（非浸入式）物镜，则该物镜的最大NA将为0.95（因为空气的折射率为1.0）。
阿贝关于横向（即XY）分辨率的衍射公式为：
d =λ/ 2 NA
其中，λ是用于对样本成像的光的波长。如果使用514 nm的绿光和NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论上）极限为177 nm。
阿贝的轴向（即Z）分辨率的衍射公式为：
d = 2λ/ NA2
同样，如果我们假设以514 nm的波长观察标本的NA值为1.45，则轴向分辨率将为488 nm。
瑞利准则是基于阿贝衍射极限的略微改进的公式：
R = 1.22λ/ NAobj + NAcond
其中，λ是用于对样本成像的光的波长。NAobj是物镜的NA。NAcond是聚光镜的NA。数字“ 1.22”是一个常数。这是从Rayleigh在Bessel函数上的工作得出的。这些用于计算系统中的问题，例如波传播。
考虑到聚光镜的NA，空气（折射率为1.0）通常是聚光镜和载玻片之间的成像介质。假设聚光镜的角孔为144o，则NAcond值将等于0.95。
如果使用514 nm的绿光，NA为1.45的油浸物镜，NA为0.95的聚光镜，则分辨率的（理论上）将为261 nm。
如上所述，用于对样本成像的光的波长越短，则可以解决的细节越多。因此，如果使用可见光的最短波长为400 nm，并且油浸物镜的NA为1.45，聚光器的NA为0.95，则R等于203 nm。
为了在显微镜系统中获得最大（理论）分辨率，每个光学组件应具有可用的最高NA（考虑到角孔径）。此外，使用较短波长的光查看标本将提高分辨率。最后，整个显微镜系统应正确对准。
