本文介绍了如何通过计算清除冷冻光学显微镜图像来提高对冷冻电子显微镜的细胞靶标的识别。
人类知道许多疾病。为了找到有效的治疗方法,必须研究健康和不健康人体中潜在的细胞机制。
冷冻电子显微镜工作流程的发展使得能够以低于1 nm的分辨率获得细胞蛋白质社会学的3D数据。
为了提高这种工作流程在生成所需数据时的可靠性,低温光学显微镜是检查样品质量和识别目标部位的必不可少的工具,通常用于低温电子显微镜检查,尤其是对于低温层析成像。在这里,我们描述了如何提高冷冻显微镜图像的图像质量,以确保更精确地识别目标部位。
关于人体生理学和病理学的许多科学问题只能通过研究潜在的细胞机制来回答。它们是任何功能组织,器官和整个生物的基础。
为了了解健康和病理生理条件下不同细胞类型的功能,确定参与的生物分子(例如蛋白质)并在分子水平上检查其相互作用至关重要。
为了实现这一目标,使用了低温透射电子显微镜(Cryo TEM)来解析其细胞环境中的生物分子,使其分辨率降至1 nm以下。这样,可以识别单个蛋白质而无需任何标记,仅凭其形状即可。此外,甚至可以区分甚至不同的构象及其在细胞质内的分布。
图1:冷冻电子断层图的分段,显示了细胞核周围的原始细胞环境。蛋白酶体在两个不同的位点束缚到核孔复合体(紫色)(橙色:膜束缚的蛋白酶体,黄色:篮束缚的蛋白酶体蓝色:游离蛋白酶体)。还显示了核被膜(灰色),核糖体(黑/白)和线粒体(红色,带有成排的黄色ATP合酶)。数据由德国马丁斯里德马克斯·普朗克生物化学研究所分子结构生物学系B. Engel博士提供。原始出版物:阿尔伯特·S,沙弗·M,贝克·F,莫萨拉甘蒂·S,浅野·S,托马斯·HF,普利兹科·JM,贝克·M,鲍迈斯特·W,恩格尔·BD,蛋白酶体拴在核孔复合体的两个不同位点,PNAS,2017年12月。
作为前提,必须使用复杂的技术(玻璃化)将标本冷冻固定,以避免形成破坏性的冰晶。与其他固定技术相反,蛋白质保持尽可能接近天然状态。之后,可以在CryoTEM中直接评估薄样品(小于300nm)。通过倾斜样品,可以创建并重建观察到的样品量的3维数据集,以获得相关目标蛋白的3D分布(图2,低温电子断层扫描)。
图2:低温电子断层扫描技术示意图。当使用电子束(TEM)观察样品时,将其倾斜以从不同的观察角度创建一系列图像。重建3D体积,可以可视化和分析蛋白质的分布。
为了观察样品的“较厚”部分,必须将样品稀释。除了冷冻超薄切片术以外,还可以选择使用专用的低温扫描电子显微镜进行聚焦离子束(FIB)铣削。放置两个离子束窗口的方式是,在感兴趣的区域生成约200 nm厚的薄冰片(薄片)。这样,即使是无法调查的部分标本也可以用于Cryo ET(图3,FIB铣削)。
图3:聚焦离子束铣削技术示意图。在用扫描电子束观察样品的同时,聚焦离子束(FIB)被导引到薄残留冰片(薄片)上方和下方的样品去除材料。
由于工作流程很繁琐,因此需要很多步骤,而在EM上的材料和成像时间却很昂贵,因此在早期确定样品的质量和靶标在网格上的存在至关重要。此外,一个主要的挑战是找到精确的研磨位置以确保薄片包含目的蛋白。
为了克服这些挑战,低温显微镜是工作流程的重要组成部分。使用低温显微镜可以检查样品的质量,重要的是,可以使用遗传编码的荧光标签确定目标结构的位置(图4)。
图4:定位和检索。荧光酵母细胞的低温显微镜和FIB扫描电镜。左图:酵母的荧光图像,红色表示核仁,绿色表示细胞壁。核仁以十字线标记。右图:在FIBSEM中检索到相同位置,以创建包含目标核仁的薄片。显示了初始研磨阶段。可以看到薄片上方和下方的铣削窗口(黑色)。比例尺:10μm。图片由Philipp Erdmann博士提供;麦克斯普朗克生物化学研究所F.Wilfling创建的酵母茎,德国马丁斯里德。
这些标记可以选择性地可视化,并揭示2D和3D中任何感兴趣的结构的位置。将荧光图像和SEM图像相关联,可以分配潜在的铣削位置(相关光和电子显微镜,CLEM)。
尽管出现了许多挑战(样品的安全冷冻转移,冷零件上可能的水凝结,低温使用的物镜……),但仍可以使用商用冷冻光学显微镜。
Leica Microsystems提供了专用的低温显微镜THUNDER ImagerEMCryoCLEM,该显微镜配备了的LED技术和高度灵敏的科学CMOS相机(图5)。
图5:Leica Microsystems专用的低温显微镜。THUNDER ImagerEMCryoCLEM。
通过遵循软件工作流程,可以在不到一分钟的时间内创建完整的样品架(EM网格)的概述,并可以检查网格上支撑膜的完整性。在第二步中,可以确定目标荧光信号的分布以及后续FIB研磨的合适区域的定位。
图6:室温下在HeLa细胞球体上应用的THUNDER技术
不幸的是,尽管宽视野显微镜是一种敏感,因此适合低温成像,但在图像中仍会观察到背景噪声。这种背景主要来自样本的失焦区域,大大降低了系统的对比度和潜在的信噪比(SNR)。记录的图像通常显示雾度,并且可能无法提供正确瞄准目标结构所需的详细程度。
为了解决这一广角问题,徕卡显微系统公司开发了全新的成像系统系列THUNDER Imagers,该系统以计算清算为核心技术。每次获取图像时,都会检测并消除离焦背景,从而可以直接访问感兴趣的信号。同时,在对焦区域中,样本特征的边缘和强度仍然保留。
特别是对于生物样品,背景通常在整个图像中不是恒定的。在整个视场中,它可能变化很大。计算清除会自动考虑到这一点,使对焦信号立即可见。
THUNDER Imagers提供三种模式可供选择:
即时计算结算(ICC)
小批量计算清算(SVCC)
大容量计算清算(LVCC)
ICC对应于如上所述的计算清除。
SVCC和LVCC是计算清除和基于决策掩码的3D反卷积的组合,专用于稀疏样本(SVCC)或稠密样本(LVCC)。反卷积方法的自适应图像信息提取遵循了一个概念,该概念是从为共焦显微镜开发的徕卡显微系统公司的自适应反卷积方法LIGHTNING演变而来的。
LIGHTNING使用决策遮罩作为基本参考,为图像系列的每个体素计算一组适当的参数。结合广域点扩展功能(PSF),可以将LIGHTNING的功能转换为广域检测(可以在此处找到更多信息)。
将小体积计算清除(SVCC)应用于单个,不重叠,衍射受限的对象可提高分辨率。在给定的示例中,对直径为40 nm的单个珠子进行了成像(100倍放大镜,NA 1.44),并应用了SVCC。取决于样品的结果是,横向分辨率提高*约2倍(使用SVCC / Raw = 0.51时X的FWHM比率)和轴向分辨率的2.5倍(使用SVCC / Raw = 0.39时Z中的FWHM比率)。
*分辨率增强由发光点光源的外观大小定义。在衍射极限以下将彼此靠近的两个结构分开是不可能的。
图7:尺寸小于光学分辨率极限的单个磁珠的强度测量。X轴(左)和Z轴(右):在SVCC之前(蓝色点)和之后(红色点)。拟合高斯(阴影)。插件显示了各自的XY和XZ平面。
由于THUNDER技术首先成功地用于在环境温度下对样品成像,因此Leica专家随后提出了在低温条件下应用该技术的想法。从宽视野冷冻图像中去除雾霾特别有用,因为它不仅可以改善图像质量,而且可以确保在后续的EM工作流程步骤(即FIBMilling和TEM分析)中更可靠地识别出感兴趣的结构。
图8:在低温条件下施加的THUNDER。酿酒酵母细胞表达核仁标记NOP56 :: mars(红色)并显示出明显的细胞壁自发荧光(绿色)。左:THUNDER之前z堆栈的图像投影;右:THUNDER-LVCC之后的图像。插页显示放大的区域。比例尺:5μm。图片由Philipp Erdmann博士提供;F. Wilfling创建的茎。德国马丁斯里德马克斯-普朗克生物化学研究所。
图8显示了用THUNDER技术(THUNDER LVCC)观察到的酵母细胞。在左侧面板上,可以看到细胞壁绿色自发荧光的散焦雾霾正在干扰核仁的鉴定。一个人可能会争辩说,绿色荧光可以从覆盖图像中去除,但是同时需要可视化细胞壁以鉴定未附着的核仁。使用THUNDER后,背景雾度降低,同时信号得以保持;细胞壁和核仁清晰可见,便于FIB Milling鉴定。
THUNDER技术的应用是在不同的样本上进行的。图9显示了另一个示例:A9细胞用与鬼笔环肽结合的绿色荧光染料标记。鬼笔环肽选择性结合纤维肌动蛋白,在真核细胞中发挥结构性作用。在左侧面板中,微小的结构被散焦光隐藏(见箭头),但在THUNDER SVCC之后,它们在右侧面板中可见。
图9:用Alexa Fluor 488鬼笔环肽标记纤维肌动蛋白(F-肌动蛋白)标记的A9细胞。在THUNDER之前(左)和之后(右)的3D图像堆栈投影。THUNDER消除了雾霾,即使是最小的结构(箭头)也可以更清晰地看到以进行瞄准(已应用SVCC)。
F-肌动蛋白纤细的纤维结构可立即显示出改进,非常适合THUNDER成像。图10还与被mCherry标记的F-肌动蛋白一起显示了囊泡结构:TGN46是Trans-Golgi Network(TGN)的蛋白质,由GFP荧光指示。TGN将新蛋白引导至不同的亚细胞目的地。THUNDER还能揭示这些小的囊泡结构,同时消除了散焦光造成的模糊。
图10:在使用THUNDER SVCC之前(左)和之后(右),带有F-肌动蛋白染色(mcherry),Trans-Golgi网络蛋白TGN46(GFP)和DNA(Hoechst 33342)的HeLa细胞。样品由英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所的Marie-Charlotte Domart博士和Lucy Collinson博士提供。
在本文中,我们展示了Leica Microsystems的THUNDER成像技术如何使用计算清除技术提高在低温条件下从玻璃化样品中拍摄的图像的质量。通过消除主要由散焦光引起的雾度或模糊,甚至可以看到微小的结构。THUNDER成像技术不仅可以提高图像质量,而且还可以帮助您更轻松地为后续的EM分析步骤识别结构。