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体内询问涉及肿瘤发生的基因的功能受到生成和杂交种系突变小鼠的需要的限制。在这里，我们描述了建模结直肠癌（CRC）和转移的方法，这些方法依赖于小鼠中的原位基因编辑和原位类器官移植，而无癌症易感性突变。通过基于CRISPR–Cas9的结肠上皮细胞中Apc和Trp53抑癌基因的编辑以及通过Apc编辑的结肠类器官的原位移植可以诱导自体肿瘤的形成。APC Δ/Δ;Kras G12D / +;Trp53的Δ/Δ（AKP）小鼠结肠类器官和人类CRC类器官移入远端结肠并转移到肝脏。我们应用原位移植模型表征Lgr5 +干细胞的克隆动力学，并证明已建立的结肠腺瘤中癌基因的顺序激活。这些实验系统能够快速体内表征与癌症相关的基因，并再现肿瘤进展和转移的整个过程。
肿瘤测序研究已经确定了许多候选基因，这些候选基因在CRC中发生了突变，并且可能有助于患者子集的癌变，肿瘤表型和治疗反应。传统上，推定的癌相关基因功能评价在体内已要求CRC的遗传工程化小鼠模型（GEMMS）的发展通过广泛的相互交叉或从头基因靶向的小鼠，这是昂贵且耗时的产生。CRC的GEMMS如装甲运兵闵鼠标也受小肠肿瘤发作延迟（即2-4个月）和高肿瘤负荷（即30-100个息肉）的限制，这对于人肠肿瘤而言是罕见的位置，因此无法研究早期腺瘤以外的肿瘤进展或使用结肠镜纵向研究。肿瘤可以是局部与任一结肠装甲运兵损失由结肠特异性启动子驱动的，这是由肿瘤生长缓慢（即，4-6个月）的限制，或体细胞缺失的装甲运兵中的远侧结肠装甲运兵FL / fl腺病毒Cre的直肠灌肠小鼠，需要结肠损伤和/或耗时的手术。
除GEMM外，人类和小鼠细胞系还用于体内CRC模型。移植的典型部位是小鼠侧翼或肾囊，它们不能概括结肠粘膜的天然基质。几个研究小组试图通过直肠灌肠，损伤，电凝，通过外科手术将肿瘤细胞系原位递送到小鼠结肠，或者通过盲肠浆膜（不是CRC发育的相关组织层）递送到粘膜。或结肠镜检查引导的粘膜注射。但是，所有已公开的原位模型都受到使用小鼠或人类细胞系的限制，这些小鼠或人类细胞系的基因定义不明确，无法概括CRC的组织学。
聚簇的规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）-Cas9核酸酶基因组编辑系统提供了对野生型小鼠中一个或多个基因进行体细胞突变的能力，以评估其在肿瘤发生中的作用。我们和其他人已经证明由CRISPR-Cas9成分的慢病毒交付诱发肺肿瘤的可行性。CRISPR–Cas9基因编辑已应用于工程人类CRC三维培养或类器官；在突变APC，KRAS，TP53，SMAD4，和/或PIK3CA都必须成功移植在异位小鼠。
在这里，我们描述了基于CRISPR–Cas9的体细胞基因编辑和原位类器官移植方法，这些方法采用结肠镜检查指导的粘膜注射，在没有癌症易感突变的小鼠中诱导原发性和转移性肿瘤。我们首先进行了优化的结肠镜检查引导的粘膜喷射系统以产生粘膜泡沫该局部化在注射的远侧4厘米鼠标结肠固有层，基于先前的报道。使用这种方法，每只小鼠可进行3次注射，每次注射50-100μl。我们观察到在每个注射部位直径5毫米的圆形区域中通过生物发光和荧光进行重组Rosa26 LSL-tdTomato / LSL-荧光素酶小鼠接受编码Cre重组酶（Ad5CMV :: Cre）的腺病毒载体，这表明我们的方法在注射部位特异性感染了结肠细胞。
为了确定粘膜注射对隐窝基部结肠肠道干细胞进行病毒感染的效用，我们注射了慢病毒载体，该载体掺入了驱动Cre重组酶（lenti-PGK :: Cre）表达的人激酶1（PGK）启动子。进入Rosa26 LSL-tdTomato / +小鼠，然后通过免疫荧光追踪重组细胞。我们观察到隐窝基部（启动肿瘤发生的结肠干细胞的位置）上皮细胞的感染。值得注意的是，我们还在结肠基质细胞中检测到了广泛的重组，但未通过荧光显微镜观察到近端结肠，小肠或肝脏中的重组（数据未显示），表明粘膜的粘膜病毒感染仅限于结肠的上皮细胞和固有层固有层细胞注射区域。
与这些发现一致，通过将粘膜PGK :: Cre慢病毒粘膜注射到Apc fl / fl小鼠中，Apc抑癌基因的缺失可靠地在六周内产生了肿瘤，并通过结肠镜检查进行了监测。这些肿瘤表现出腺瘤性变化和核β-catenin定位的组织学特征，分别是人类结肠癌和Wnt信号通路异常激活的特征（补充图1c，表格1）。粘膜注射Ad5CMV :: Cre同样可诱导快速有效的肿瘤发生（补充图2a）。
基于粘膜注射的大肠癌小鼠模型的效率
粘膜注射后六周观察到的肿瘤定量。通过结肠镜检查鉴定肿瘤并通过尸检和组织学证实。对于所有实验，每只小鼠进行两次注射。[PGK-Cre：具有驱动Cre重组酶表达的PGK（磷酸甘油酸激酶-1）启动子的慢病毒载体；TU：转换单位；Ad5CMVCre：编码由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的Cre重组酶的腺病毒载体。4-OHT：4-羟基他莫昔芬；AKP：装甲运兵和Trp53的-null，Kras的G12D / + -mutant;NSG：点头SCID伽玛]
| 方法 | 方法 | 收件人鼠标 | 每次注射剂量（每只小鼠2次注射） | 老鼠数 | 肿瘤数目 | 每只小鼠的平均肿瘤数 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Cre介导的原位Apc切除 | PGK :: Cre | APC FL/FL | 30,000 TU /微升 | 16 | 14 | 0.88 |
| Ad5CMV :: Cre | APC FL/ FL | 300,000 TU /微升 | 25 | 32 | 1.28 | |
| 4-羟基他莫昔芬 | APC FL/ FL绒毛蛋白creER | 100微米 | 35 | 68 | 1.94 | |
| 4-羟基他莫昔芬 | APC FL / FL LGR5 creER | 100微米 | 10 | 4 | 0.4 | |
| Cre mRNA脂质纳米颗粒 | APC FL / FL | 225微克mRNA /毫升 | 8 | 7 | 0.88 | |
| CRISPR / Cas9介导的原位Apc编辑 | U6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP慢病毒 | 野生型 | 1000 TU /微升 | 29 | 10 | 0.34 |
| U6 :: sgApc-CMV :: Cre慢病毒 | R26 LSL-Cas9-eGFP / + | 10,000 TU /微升 | 13 | 12 | 0.92 | |
| U6 :: sgApc-EFS :: turboRFP慢病毒 | R26 LSL-Cas9-eGFP / + Villin creER +他莫昔芬 | 10,000 TU /微升 | 25 | 25 | 1.0 | |
| CRISPR-Cas9介导的原位Trp53编辑 | U6 :: sgTrp53-CMV :: Cre慢病毒 | Apc fl / fl ; R26 LSL-Cas9-eGFP / + | 10,000 TU /微升 | 4 | 3 | 0.75 |
| hU6 :: sgApc-sU6 :: sgTrp53-EFS :: turboRFP慢病毒 | R26 LSL-Cas9-eGFP / + Villin creER +他莫昔芬 | 10,000 TU /微升 | 4 | 3 | 0.75 | |
| 小鼠肿瘤原位移植 | AKP小鼠CRC细胞系 | C57BL / 6 | 10,000个细胞/注射 | 6 | 11 | 1.83 |
| sgApc野生型结肠类器官 | 非政府组织 | 约40种类器官/注射 | 25 | 36 | 1.44 | |
| sgApc C57BL / 6野生型肠道类器官 | C57BL / 6 | 约40种类器官/注射 | 12 | 10 | 0.83 | |
| AKP结肠类器官 | 非政府组织 | 约40种类器官/注射 | 10 | 15原发性 3肝转移（第12周） | 1.5 0.33肝转移（第12周） | |
| AKP结肠C57BL / 6类器官 | C57BL / 6 | 约40种类器官/注射 | 20 | 17 | 0.85 | |
| sgTrp53，装甲运兵-null结肠类器官 | 非政府组织 | 约40种类器官/注射 | 4 | 5 | 1.25 | |
| 人肿瘤原位移植 | 人CRC细胞系（LS174和HT29） | 非政府组织 | 10,000个细胞/注射 | 10 | 18岁 | 1.8 |
| 患者来源的原发性CRC | 非政府组织 | 10,000个细胞/注射 | 10 | 13 | 1.3 | |
| 患者来源的主要CRC类器官 | 非政府组织 | 每次注射约150种类器官 | 26 | 24原发 8肝转移（第8 + 12周） | 0.92 0.33肝转移（第8 + 12周） | |
| 患者来源的MSI-H（患者B）原发性CRC类器官 | 人性化的NSG | 每次注射约150种类器官 | 4 | 4 | 1个 |
接下来，我们使用他莫昔芬依赖性Cre重组酶CreER生成了可诱导的肿瘤模型。由从动CreER绒毛蛋白（上皮特异性）和LGR5（肠细胞特异性干）的启动子已经被用于诱导肠道肿瘤。我们生成了Rosa26 LSL-tdTomato / +;Villin CreER，Apc fl / fl； Villin CreER和Apc fl / fl； Lgr5 eGFP-CreER / +小鼠，并通过粘膜递送4-羟基他莫昔芬（4-OHT）局部激活了CreER。我们观察到Rosa26 LSL-tdTomato / +中的上皮特异性重组；Villin CreER小鼠和Apc fl / fl中有效的肿瘤形成； Villin CreER小鼠（补充图2b，2c）。对这些肿瘤进行组织学活检（补充图2c）。Apc fl / fl ; Lgr5 eGFP-CreER / +小鼠的肿瘤发生率较低，这很可能是由于结肠中Lgr5等位基因的镶嵌表达所致（补充图2d，表格1）。我们还有效地诱导了Apc fl / fl小鼠的肿瘤发生，并在脂质纳米颗粒中稳定递送Cre mRNA（补充图3a–e，表格1）。在一起，这些发现建立了基于Cre介导的Apc固定等位基因切除的CRC小鼠模型，其中肿瘤发生仅限于远端结肠。
然后，我们寻求利用基于CRISPR–Cas9的Apc编辑，利用粘膜注射方法对CRC模型进行建模。我们将靶向鼠Apc基因外显子16的先前验证的短链RNA（sgRNA）克隆到含有Cas9和GFP（U6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP）的慢病毒载体中。将该病毒粘膜递送至野生型小鼠中导致表达GFP的肿瘤，表明稳定的慢病毒整合。GFP表达在这些腺瘤的大部分区域中丢失，这意味着慢病毒转基因表达的沉默（图1a）。在该系统中，接受两次注射的小鼠中有34％发生了肿瘤发生，这很可能是由于慢病毒基因组的大小较大（〜8.1 kb）导致的相对较低的病毒滴度（约1000 TU /μl）所致，因为需要加入Cas9 （表格1）。
图1
结肠上皮中基于CRISPR-Cas9的原位Apc编辑诱导腺瘤形成
（a）在粘膜注射每μlU6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP慢病毒1,000个转化单位（TU）后，野生型小鼠的肿瘤。肿瘤通过白光结肠镜检查，明视野尸检，GFP荧光尸检，苏木精和曙红（H＆E）染色以及β-catenin免疫组化指示。注意在肿瘤中的片状GFP表达（箭头）。（b）Rosa26 LSL-Cas9-eGFP / +小鼠的粘膜递送编码针对Apc的sgRNA的慢病毒后的肿瘤和Cre重组酶（U6 :: sgApc-CMV :: Cre，10,000 TU /μl）（白光结肠镜检查，明视野尸检和GFP荧光尸检; H＆E免疫组织化学和GFP /β-catenin免疫荧光）。GFP肿瘤荧光表明从Rosa26基因座Cre诱导的Cas9和eGFP表达。（c）Rosa26 LSL-Cas9-eGFP / +中的肿瘤发生； Villin CreER用他莫昔芬治疗的小鼠，然后将编码sgApc和turboRFP（U6 :: sgApc-EFS :: turboRFP，10,000 TU /μl）的慢病毒注射入结肠粘膜（白光/ GFP / turboRFP荧光结肠镜检查和明场/ GFP / turboRFP荧光尸检； GFP / turboRFP免疫荧光）。箭头指示在基质细胞中turboRFP表达。箭头指向GFP / turboRFP双阳性肿瘤细胞。组织学图像为20倍，插图为60倍（比例尺：200μm）。虚线表示肿瘤。（tRFP：turboRFP； R26：Rosa26； N：正常； T：肿瘤）。
sgRNA靶位点侧翼的基因组区域的大规模平行测序揭示了CRISPR–Cas9介导的克隆移位或Apc缺失。值得注意的是，我们观察到以相等的双等位基因比例出现的独特的Apc失活突变，这表明这些肿瘤起源于两个细胞（补充图4a）。因此，我们证明了CRISPR–Cas9在追踪癌症克隆起源中的应用，与使用CRISPR–Cas9追踪生物谱系的报道相一致。该方法可用于确定在转化细胞中有效的突变类型，从而赋予多克隆肿瘤以内的生长优势。
为了增加病毒滴度，我们产生了一种慢病毒，其中含有不带Cas9的Apc sgRNA（U6 :: sgApc-CMV :: Cre或pUSCC；基因组大小约为4.4 kb），产生的病毒滴度约为10,000 TU /μl。向Rosa26 LSL-Cas9-eGFP / +小鼠粘膜注射pUSCC-sgApc导致92％的小鼠形成肿瘤（图1b，表格1）。已经证明粘膜注射慢病毒会导致广泛的基质细胞感染（补充图1c），我们试图将CRISPR–Cas9基因编辑限制在结肠上皮细胞中进行癌症建模。我们将他莫昔芬施用于Rosa26 LSL-Cas9-eGFP / +; Villin CreER小鼠，以在肠上皮细胞中特异性表达Cas9。U6 :: sgApc-EFS :: turboRFP（pUSET;基因组大小〜3.8 kb）慢病毒的粘膜递送导致有效的肿瘤发生，其特征在于感染基质和上皮细胞以及CRISPR介导的Apc编辑仅在Cas9阳性上皮细胞中（图1c 表格1）。与U6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP慢病毒相比，病毒滴度提高了10倍，我们检测到以相似比例存在的多个移码Apc突变，表明多克隆肿瘤起源于> 10个原始细胞（补充图4b）。进展为一年的U6 :: sgApc-EFS :: turboRFP肿瘤在组织学上显示高度不典型增生，但无局部浸润或肝转移（补充图5a，5b，未显示数据）。与六周大的肿瘤相比，一岁大的U6 :: sgApc-EFS :: turboRFP肿瘤显示出1–2个Apc移码突变的优势。这些突变很可能为起始细胞提供了生长优势。
为了证明我们的体内基因编辑系统在建模癌症相关基因中的应用，我们单独对肿瘤抑制因子Trp53（即将pUSCC-sgTrp53导入Apc fl / fl Rosa26 LSL-Cas9-eGFP / +小鼠）进行了粘膜编辑。与Apc（即hU6 :: sgApc-sU6 :: sgTrp53-EFS :: turboRFP组合）进入Rosa26 LSL-Cas9-eGFP / +;他莫昔芬治疗的Villin CreER小鼠）（补充图5c，5d，表格1）。sgTrp53靶位点侧翼的基因组区域的大规模平行测序揭示了这些肿瘤中的多个移码突变（补充图6a，6b）。总之，这些研究证明了体内体细胞CRISPR–Cas9编辑在没有种系癌症易感突变的小鼠中进行CRC建模和基因功能评估的实用性和多重性。
我们试图使用我们的粘膜注射方法来开发肠道类器官功能的体内模型，其中培养的肠道类器官在宿主小鼠的天然结肠环境中生长。我们从Rosa26 LSL-tdTomato / +衍生出肠道和结肠类器官；用他莫昔芬处理的Villin CreER小鼠，并通过粘膜注射将这些tdTomato +类器官原位移植到受体小鼠中。植入的类器官在体内通过荧光结肠镜检查可见（补充图7a）。为了证明移植的类器官是有功能的，我们：1）标记的EdU +增殖类器官细胞；和2）给接受Apc的小鼠服用他莫昔芬fl / fl；维林CreER肠类器官，并观察到肿瘤形成（补充图7a，7b）。不同于肠类器官移植的报告通过直肠灌肠到小鼠，我们的方法并不需要结肠炎或机械损伤。
我们利用粘膜注射技术通过原位移植癌细胞来模拟CRC。来自基因工程小鼠肿瘤的AKP鼠CRC细胞系的同系移植导致可移植的植入和侵袭性肿瘤形成（补充图8a，表格1）。然而，这些肿瘤不能复制人结肠腺癌的腺结构。
我们假设原位移植后，缺乏Apc的肠类器官会在远端结肠中植入并形成肿瘤。肠道和结肠类器官感染了U6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP慢病毒，然后通过在无外源Wnt配体Wnt3a和R-spondin-1的培养基中进行培养来选择Apc损失（补充图8b）。这些类器官在sgApc目标基因位点表现出CRISPR–Cas9介导的编辑作用，并通过Wnt目标基因的定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）激活Wnt信号通路。原位异种移植和CRISPR–Cas9编辑的Apc空肠类器官的同种异体移植分别进入免疫缺陷小鼠和C57BL / 6小鼠，导致腺瘤扩展至具有核β-catenin定位的上皮表面（图2a，补充图8e，表格1）。对这些肿瘤中sgApc结合位点的突变进行分析后发现，肿瘤内和肿瘤间存在异质性（补充图9b，8c）。我们在进展不足24周的不全（N = 16）和同基因受体（N = 20）的Apc空原位肿瘤中未发现局部浸润或肝转移（数据未显示）。没有将Apc空肠类器官移植到同系小鼠的小鼠腹侧而形成的肿瘤，这表明结肠粘膜是肠类器官植入比皮下空间更宽松的环境（N = 5，数据未显示）。我们的粘膜注射系统补充了O'Rourke等人描述的类器官原位移植的灌肠模型。在这个问题上。
图2
小鼠和患者来源的大肠癌的原位移植模型
（a）原位移植受U6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP慢病毒感染的野生型结肠类器官后，NSG小鼠远端结肠中的肿瘤。用白光/ GFP荧光结肠镜检查，白光/ GFP荧光尸检和GFP免疫荧光观察肿瘤。（b）中通过原位移植在NSG小鼠诱导的肿瘤装甲运兵Δ/Δ，Kras的G12D / +，色氨酸53Δ/Δ（AKP）结肠类器官。通过结肠镜检查，尸检，苏木精和曙红（H＆E）染色，β-catenin免疫组织化学和CDX2免疫组织化学对肿瘤成像。（C）移植的AKP结肠类器官肿瘤的局部浸润和肝转移，如原发性结肠肿瘤的H＆E和LYVE1免疫组织化学，尸检和肝转移的CDX2免疫组织化学所示。箭头表示固有肌层的侵袭，箭头表示LYVE1阳性淋巴管的肿瘤侵袭。（d）原位移植患者来源的CRC类器官后，NSG小鼠的肿瘤。结肠镜检查，尸检，H＆E染色，β-catenin免疫组织化学和CDX2 /人Keratin20免疫组织化学证实了肿瘤。（e）H＆E染色，LYVE1免疫组织化学，肝剖检和CDX2 /人Keratin20免疫组织化学证明了患者来源的类器官原位肿瘤的局部浸润和肝转移。箭头表示肌层的侵袭，箭头表示LYVE1阳性血管的肿瘤侵袭。组织学图像为20倍，插图为60倍（比例尺：200μm）。虚线表示肿瘤。（NSG：nod SCIDγ； T：肿瘤； N：正常结肠； hKeratin20：人角蛋白20）。
我们通过用Ad5CMV :: Cre感染Apc fl / fl ; Kras LSL-G12D / + ; Trp53 fl / fl结肠类器官来建模更高级的CRC ，然后在包含nutlin-3和缺乏Wnt途径激动剂的培养基中进行选择以生成AKP肿瘤类器官。这些类器官在原位同基因移植后发展为具有增生性基质反应的浸润性肿瘤，这是浸润性人类CRC的基本特征（补充图8f，表格1）。原位移植入NSG小鼠后12周，在33％的受体小鼠中，AKP类器官侵入了固有肌层，局部脉管系统并转移到肝脏（图2b–c， 表格1）。所有具有肝转移的小鼠均表现出原发性结肠肿瘤，并伴有固有肌层的侵袭。这些结果表明，鼠肿瘤类器官的原位移植可用于模拟人类CRC的整个谱图，包括远处器官转移。
我们问是否可以基于体外基于CRISPR–Cas9的类器官编辑，然后进行原位移植，可用于评估体内基因功能。源自我们感染的结肠组织体装甲运兵FL / FL ROSA26 LSL-Cas9-EGFP / +与U6小鼠:: sgTrp53-CMV :: Cre重组慢病毒，然后在媒体选择，而没有Wnt通路激动剂，其次是选择了Trp53的-null类器官与nutlin -3。然后，我们将Trp53- null肿瘤类器官原位移植到NSG小鼠中，以模拟P53突变CRC。
我们随后旨在开发患者的CRC原位小鼠模型。人CRC细胞系的植入有效地形成了延伸到上皮表面并侵入固有肌层的肿瘤，但没有反映人CRC的组织学。相反，源自患者的原位类器官异种移植所产生的肿瘤可准确地概括原始癌症的上皮和基质组织学。此外，患者来源的类器官移植物形成了侵袭性结肠肿瘤，在移植后8周时有25％的原发性肿瘤小鼠转移到肝脏，在12周时有45％的小鼠转移到肝脏。（图2d，2e，表1，表2）。移植到小鼠胁腹的患者来源的CRC类器官形成了组织学上相似的肿瘤，但没有转移（N = 5肿瘤；补充图12c和数据未显示）。移植患者来源的原位异种移植物，其中将CRC组织消化并直接移植到远端结肠中而不暴露于组织培养条件下，也引发了表现出人CRC组织学特征的肿瘤（补充图11c，表格1）。这些发现表明，患者来源的CRC类器官的原位移植可强有力地模拟原发性和转移性人CRC。
病人类器官的临床特征和原位移植实验的结果
所有源自患者的类器官移植研究均在NSG小鼠中进行。通过结肠镜检查鉴定肿瘤并通过尸检和组织学证实。对于所有实验，每只小鼠进行两次注射。（T：肿瘤； N：结节； M：转移； MSS：微卫星稳定； MSI-H：微卫星不稳定性高）。
| 患者 | 年龄 | 性别 | 位置/病理 | 阶段 | 变异 | 原发性肿瘤/小鼠 | 肝转移/原发肿瘤 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 第四周 | 第八周 | 第十二周 | 第24周 | |||||||
| A | 61 | 女 | 直肠腺癌中度分化的肝转移 | T4 M1 | MSS。突变KRAS，TP53，PTCH1 | 17/18 | 0/7 | 1/3 | 2/4 | 2/3 |
| B | 68 | 女 | 右结肠腺癌伴肿瘤周淋巴细胞浸润 | Tis N0 M0 | MSI-H，IHC上MSH6核表达的丧失。KRAS野生型。TP53和PIK3CA中的突变 | 12/13 | 0/3 | 1/5 | 2/4 | -- |
| C | 47 | 女 | 右结肠中度分化的腹膜转移 | T4b N1b M1b | MSS。突变的KRAS | 11/11 | 0/4 | 1/4 | 1/3 | -- |
| 所有患者（％） | -- | -- | -- | -- | -- | 40/42（95％） | 0/14（0％） | 3/12（25％ | 5/11（45％） | 2/3（67％） |
微卫星不稳定的CRC与明显的淋巴细胞浸润和抗编程性死亡1（PD-1）免疫检查点抑制作用改善了生存率。然而，患者源性CRC的异种移植模型缺乏人类免疫系统，因此在研究肿瘤免疫学或免疫检查点封锁方面的实用性有限。我们从患有Lynch综合征的患者的微卫星不稳定性高（MSI-H）CRC中获得类器官（患者B；请参见表2）。然后，我们将MSI-H类器官原位移植到具有重组人类免疫系统的NSG小鼠中，该免疫系统引起了类似于MSI-H患者肿瘤中所观察到的人类淋巴细胞浸润。
Lgr5（富含亮氨酸的重复序列，包含异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联受体5）标志着小肠腺瘤干细胞的亚群，可产生新的腺瘤细胞。然而，先前用于Lgr5细胞标记和追踪的小鼠模型不能模拟结肠腺瘤，也不能在已建立的腺瘤中进行基因突变。我们使用原位移植系统克服了这些局限性和已建立的结肠腺瘤中的谱系痕迹Lgr5 +细胞。我们生成了Lgr5 CreER / + ; Rosa26 LSL-tdTomato / +小鼠，衍生的结肠类器官，通过体外灭活了Apc慢病毒感染（即U6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP），然后将这些肿瘤类器官原位移植到NSG小鼠体内，在注射后两周通过结肠镜检查将其可视化。然后给荷瘤小鼠施用他莫昔芬脉冲，以tdTomato（Ld5）标记Lgr5 +细胞及其后代（图3a）。标记后2天，3周和6周，通过荧光结肠镜检查和免疫荧光观察肿瘤（图3b，3c）。与标记2天后相比，标记后3周和6周时，Lgr5细胞衍生的群体与总肿瘤面积成比例并平均克隆大小增加（图3d–e）。值得注意的是，与肿瘤的tdTomato-区域相比，tdTomato +区域包含更多的增殖EdU +细胞，表明源自Lgr5 +细胞的克隆具有更高的增殖潜力（图3f）。我们通过将他莫昔芬应用于Apc- null Lgr5 CreER / + ; Rosa26 LSL-tdTomato / + ; Kras LSL-G12D / +原位肿瘤，来激活Lgr5 +肿瘤细胞中的致癌Kras （图3g–h）。这些结果揭示了结肠腺瘤中Lgr5肿瘤细胞的肿瘤干细胞活性，并证明了我们的原位移植模型在已建立的结肠肿瘤中进行连续诱变的应用。
图3
建立的原位结肠腺瘤中的Lgr5细胞谱系追踪和连续诱变
（a）对源自Lgr5 CreER / + ; Rosa26 LSL-tdTomato / +小鼠的结肠类器官进行U6 :: sgApc-EFS :: Cas9-P2A-GFP感染的基于CRISPR-Cas9的Apc编辑，然后原位移植到NSG小鼠会产生Apc无效的体内肿瘤。荷瘤小鼠接受一剂他莫昔芬以tdTomato标记Lgr5 +细胞及其后代，并在2天，3周或6周后进行评估。处死前4小时，用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记增殖细胞。（b） 体内细胞标记后第2天，3周和6周，通过白光，GFP荧光和tdTomato荧光结肠镜检查（虚线）对肿瘤进行成像。（c）原位肿瘤的GFP，tdTomato和EdU免疫荧光图像。箭头指示在标记后2天用tdTomato标记细胞（白色箭头）。箭头指向GFP阴性的肿瘤区域，提示马赛克慢病毒沉默。分析了免疫荧光图像：（d）相对于总GFP +肿瘤面积的tdTomato +肿瘤面积；（e）平均tdTomato +克隆大小（即，总tdTomato +面积/总克隆数）；和（f）标记后6周，EdU +增殖tdTomato +，GFP +肿瘤细胞的比例与EdU +增殖tdTomato-，GFP +肿瘤细胞的比例。（每组和每个时间点N = 3或4个肿瘤）。（克） tdTomato +（箭头）的克隆激活2天他莫昔芬给药后小鼠轴承原位装甲运兵-null LGR5 CreER / + ; ROSA26 LSL-tdTomato / + ; Kras的LSL-G12D / +肿瘤; （h）分析突变型Kras LSL-G12D / +上的lox-stop-lox（LSL）盒的重组响应他莫昔芬介导的CreER激活。Tam x 3表示肿瘤，其中小鼠接受了3个脉冲的他莫昔芬，而Tam x1则给出了一个脉冲。在他莫昔芬的一次脉冲后48小时收获组织。野生型小鼠尾部DNA用作阴性对照，和Kras的G12D / + ; Trp53的Δ / Δ肺腺癌细胞株DNA（KP细胞）作为阳性对照。* P<0.005（单向方差分析），** P = 0.01（学生的T检验）。（R26：Rosa26； NSG：nod SCID伽玛； tdTom：tdTomato）
我们的原位上皮基因编辑和原位移植系统比CRC的标准小鼠模型具有重大进展：1）肿瘤位于适当的组织区室（即结肠）和正确的组织层（即固有层）中；2）类器官只需要装甲运兵用于原位植入损失，而不是所需要的植入其它部位的多个附加致癌突变; 3）数周内形成肿瘤；4）在几乎所有实验小鼠中都可见到肿瘤；5）用结肠镜检查对肿瘤进行纵向监测；6）具有先进的突变的肿瘤再现人类CRC的关键病理特征，包括从原发癌的进展，固有肌层浸润和肝转移; 7）定制的病毒载体减少了功能上询问癌症相关基因的成本和时间；8）在体内或类器官中通过基于CRISPR–Cas9的明确遗传改变快速诱导肿瘤，而无需费时在种系中产生突变；和9）Apc的原位移植编辑的类器官可以在确定的腺瘤中进行谱系追踪和顺序诱变。
癌症建模的一个重要目标是在体内再现原发性和转移性疾病，以用于临床前研究和临床应用。已经证明，患者来源的CRC类器官可以在体外概括原始肿瘤的分子，遗传和病理特征，但是迄今为止，它们仅被移植到了肾囊和腹侧。转移性CRC的基于类器官的模型被限制为从肾囊或脾远端器官的播种。我们演示了使用患者派生的类器官来模拟原生结肠环境中的肿瘤形成，并准确反映患者疾病的肿瘤和基质组织学。我们将原位移植系统应用于患者源性原发癌，局部肿瘤浸润和肝转移的模型。
小鼠被安置在麻省理工学院的科赫综合癌症研究所的动物设施中。本研究中描述的所有动物研究均已获得麻省理工学院机构动物护理和使用委员会的批准。Apc fl / fl（参考文献40），Kras LSL-G12D / +（参考文献41），Villin CreER（参考文献42）， Lgr5 eGFP-CreE（参考文献27），Lgr5 CreER（参考文献43）和Rosa26 LSL-Cas9-eGFP（参考文献31）已经描述了小鼠，并在纯C57BL / 6或混合C57BL / 6J×129SvJ背景下饲养。Rosa26 LSL-tdTomato小鼠被维持在混合C57BL / 6J×129SvJ遗传背景下。使用C57BL / 6类器官的原位移植实验在同种C57BL / 6或NOD scidγ（NSG）受体小鼠中进行。用NSG受体小鼠进行混合背景小鼠类器官和人类器官的植入。如先前所述开发人源化的小鼠。所有实验都使用大约相等数量的6-10周龄的雄性和雌性小鼠。
pL-CRISPR-EFS :: GFP载体获自Addgene（＃57818）。pSECC载体先前已有描述，可从Addgene（＃60820）。U6 :: sgRNA-CMV :: Cre（pUSCC）或U6 :: sgRNA-EFS :: turboRFP（pUSET）慢病毒载体是通过使用慢病毒的模块化Gibson组装将DNA末端重叠的四个部分组装而成的，如前所述。简而言之，对于pUSCC，2.2kb部分（对应于pSECC的U6-Filler片段），0.3kb部分（对应于pSECC的EFS启动子），0.5kb部分（对应于CMV-GFP的CMV启动子）（ Addgene＃68485）]，将0.7kb的部分[对应于pTRIPZ中的turboRFP（Dharmacon，目录号RHS4740），用于pUSET]或1kb的部分（对应于来自pSECC的Cre重组酶，对于pUSCC），并使用Gibson组装体组装5.7kb的慢病毒骨架。遵循制造商的规程（新英格兰生物实验室吉布森组装预混料；目录号E2611S）。对于因组克隆，所述pUSCC，pUSET和U6-sgApc-EFS-Cas9-2A-GFP载体消化BsmBI和用BsmBI兼容退火因组寡靶向外显子16连接装甲运兵（靶序列GTCTGCCATCCCTTCACGTT AGG，PAM序列加下划线） ，如先前报道。的pUSCC载体消化，并与先前描述的因组中靶向外显子7连接Trp53的（目标序列GTGTAATAGCTCCTGCATGG GGG，带下划线的PAM序列）。使用上述sgRNA，使用先前描述的系统克隆了配对的指导hU6-sgApc-sU6-sgTrp53-EFS-turboRFP载体。
通过使用TransIT-LT1（Mirus Bio）将293T细胞与慢病毒骨架构建体和包装载体（pSpax2和pMD2.G）共转染，可以生产出慢病毒。转染后48和72小时收集上清液，通过以25,000 rpm超离心2小时浓缩，并重悬于适当体积的OptiMEM（Invitrogen，目录号31985-070）中。通过连续感染293T细胞（对于含有GFP或turboRFP的慢病毒）或GreenGo Cre报道细胞（对于含有Cre的慢病毒），计算病毒滴度。
如先前报道的并在此简要概述，将小肠和结肠切除，用冷PBS-/-洗涤，侧向打开，切成3-5毫米的碎片。碎片用冷的PBS-/-洗涤多次直至清洁，用PBS-/-EDTA（10mM）洗涤2-3次，在冰上孵育90-120分钟，同时以30分钟的间隔混合。然后通过摇晃将地穴与结缔组织机械分离，并通过70-μm筛网过滤到50-ml锥形管中，以去除绒毛材料（用于小肠）和组织碎片。然后将地穴如前所述重新悬浮在50％L-WRN条件培养基中此后称为条件培养基（源自L-WRN细胞，是华盛顿大学Thaddeus Stappenbeck的一种礼物），并进行了人工计数。将地穴埋入生长因子降低的Matrigel ™（Corning，目录号356231）中，在条件培养基中以3：4的比例稀释到24孔板（Olympus，目录号25-107）中，密度约为750穴，总体积为75μl每孔，并与补充有10μMp160 ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐一水合物（APExBIO，目录号A3008）的条件培养基一起孵育，以防止细胞死亡。
根据先前由Hans Clevers实验室描述的针对类器官逆转录病毒感染的方案，用慢病毒感染鼠肠类器官。简短地讲，在肠隐窝培养后2-3天，将培养基换为培养基和10 mM烟酰胺（Sigma Aldrich，目录号N3376）。此时，类器官的外观为囊性或圆形，表明存在健康的干细胞。第二天，通过用1000μl移液器上下吸移30至50次来机械破坏类器官。在这一阶段，类器官是小于10个细胞的小团块。如果机械离解还不够，则用1X TrypLE Express（生命技术，目录号12604-021）在37摄氏度下温和地将类器官酶解1-5分钟。然后将类生物素重悬于24孔板中，并在培养基中添加10μMY27632、10 mM烟酰胺和8μg/ ml Polybrene（Sigma Aldrich，目录号TR-1003）。将该板在32℃以600g离心60分钟（旋转接种），然后在37℃下孵育6小时。然后将感染的类器官包埋在Matrigel中，并用加10μMY27632和10 mM烟酰胺的培养基进行培养。对于sgApc CRISPR–Cas9病毒感染，类器官在条件培养基中维持7天，以允许Cas9介导的编辑Apc，然后在不含Wnt3a或R-spondin-1 [Advanced DMEM / F12（Life Technologies，目录号12634-028）的介质中补充1X N2（Life Technologies，目录号17502-048）和1X B27（Life Technologies，目录） ＃17504-044）]，用于选择缺乏Apc的类器官。
通过从Apc fl / fl培养结肠类器官来产生AKP结肠类器官；克拉斯LSL-G12D / + ; Trp53 fl / fl小鼠并感染Ad5CMV :: Cre。通过培养来自Apc fl / fl ; R26 LSL-Cas9-eGFP / +小鼠的类器官并感染U6 :: sgTrp53-CMV :: Cre慢病毒来创建CRISPR-Trp53结肠类器官。在没有添加10μMnutlin-3的Wnt3a或R-spondin-1（Cayman Chemical，目录号10004372）的培养基中选择AKP和ApcΔ/Δ，p53-无器官类器官。
使用Image 1 H3-Z Spies HD Camera System（TH100摄像头），Image 1 HUB CCU（TC200主机，TC300连接模块），175W D-Light冷光源（20133701-1），AIDA HD，进行光学和荧光结肠镜检查捕获系统，0°霍普金斯内窥镜（64301AA）以及tdTomato（发射554 nm）和GFP通道（发射509 nm）中的荧光滤光片（全部来自卡尔史托斯）。
对于粘膜注射，将Ad5CMV : Cre，4-OHT（Calbiochem，目录号579002）或慢病毒重悬于OptiMEM中，然后通过光学结肠镜检查将其递送至C57BL / 6受体小鼠的结肠固有层（理想情况下为6-10周龄）使用定制的注射针（Hamilton Inc.，33号，小Hub RN NDL，16英寸长，点4，45度斜角，如零件号7803-05），注射器（Hamilton Inc.，零件号7656-01） ），转移针（Hamilton Inc.，零件号7770-02）和带集成工作通道的结肠镜（Richard Wolf 1.9mm / 9.5Fr. 小儿尿道镜，零件号8626.431）。每只小鼠进行2-3次含有50-100μl培养基的注射。对于原位类器官移植，Apc将空的类器官缓慢地机械解离，重悬于90％的基本培养基（Advanced DMEM加N2和B27）和10％的Matrigel中，然后移植到受体小鼠中。慢病毒注射或类器官移植后4-8周对小鼠进行结肠镜检查以评估肿瘤形成。保存结肠镜检查视频和图像以供离线分析。如先前使用ImageJ所述，量化肿瘤大小。处死后，切除远端结肠并固定在10％福尔马林中，切片，并用苏木精和曙红染色检查以鉴定腺瘤。或者，将肿瘤在4％多聚甲醛中固定1小时，然后在25％蔗糖溶液中固定过夜，然后冷冻切片。
新鲜的CRC外科手术标本的0.5–1 cm 3部分是从在塔夫茨医学中心，马萨诸塞州总医院，布里格姆妇女医院/达娜·法伯癌症研究所接受CRC手术的患者获得的。仅当不需要临床评估时，才由临床病理学家选择癌症组织。将样品置于冷PBS中，并运送到麻省理工学院的科赫研究所。各自的机构审查委员会委员会和麻省理工学院人类使用实验对象委员会批准了研究方案。获得所有受试者的知情同意。如前所述，将癌组织长成类器官稍作修改。简短地说，将组织切碎，然后在冰上用1型胶原酶（200单位的5 ml PBS）消化5 – 10分钟。消化成块细胞后，将样品通过100μm滤网过滤并接种到24孔板的Matrigel中（每孔50-75μl）。在Matrigel聚合之后（在37度下10分钟），加入650μl人类培养基（条件培养基，1X N2、1X B27，EGF 40 ng / ml（PeproTech，目录号315-09），3μMSB202190（Sigma Aldrich，目录） ＃S7067），500 nM A83-01（Tocris，目录号2939），20 ng / ml一水合Y-27632二盐酸盐，1μMN-乙酰基-1-半胱氨酸（Sigma-Aldrich），10 mM烟酰胺，10 nM人胃泌素I（Sigma-Aldrich，目录号G9020）和100μg/ ml Primocin（InvivoGen，目录号ant-pm-1）。类器官形成后两天
如前所述，将组织和类器官固定在10％福尔马林中，石蜡包埋并切片。用Borg Decloaker RTU溶液（Biocare Medical）在加压的脱色室（Biocare Medical）中进行抗原提取3分钟。使用了以下抗体：小鼠单克隆β-catenin（1：200，BD Biosciences 610154），兔单克隆CDX2（1：1250，Abcam ab76541），兔单克隆人特异性细胞角蛋白20（1：500，Abcam，ab76126），兔多克隆Lyve 1（1：200，Abcam，ab14917），兔单克隆抗CD3（1：200，Abcam ab16669），CD31（1:50，Abcam，ab28364）和人特异性核被膜标记Lamin A + C（ 1：2500，Abcam，ab108595）。使用生物素偶联的驴抗兔或抗大鼠二抗，来自Jackson ImmunoResearch。使用Vectastain Elite ABC免疫过氧化物酶检测试剂盒（Vector Labs PK-6101），然后使用Dako Liquid DAB +底物（Dako）进行可视化。
如先前所述，在冷冻切片上进行免疫荧光检测。简短地，将7μm的肠冷冻切片风干，用冷丙酮固定，用PBS洗涤并用Donkey Immunomix（5％正常驴血清，0.2％牛血清白蛋白，0.05％叠氮化钠和0.3％Triton-X100封闭）封闭。 PBS）。以下一抗用于小鼠组织的免疫染色：兔β-catenin（1：100，AbCam，目录号ab32572），小鼠β-catenin（1：100，BD Biosciences，目录号610154），兔多克隆溶菌酶（1 ：250，Thermo Scientific，目录号RB-372-A1），大鼠EpCAM-APC（1：500，Biolegend，目录号17-5791-82）。用含有0.3％Triton-X100的PBS洗涤切片，并用适当的Alexa 488、594或647二抗偶联物（Molecular Probes / Life Technologies）检测一抗。将组织后固定在1％多聚甲醛中，并用DAPI（VectorLabs，目录号H1200）固定在Vectashield中。使用尼康A1R共聚焦显微镜，使用10倍或20倍的空气物镜，并以帧模式（针孔1.2艾里单位）进行多通道扫描，捕获了免疫荧光图像。为了鉴定增殖细胞，在安乐死前4小时腹膜内注射1 mg 5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU，Setareh Biotech），对原位肿瘤小鼠进行腹膜内注射。根据制造商的协议，使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像套件（Thermoscientific）在冰冻切片中检测到EdU。为了鉴定增殖细胞，在安乐死前4小时腹膜内注射1 mg 5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU，Setareh Biotech），对原位肿瘤小鼠进行腹膜内注射。根据制造商的协议，使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像套件（Thermoscientific）在冰冻切片中检测到EdU。为了鉴定增殖细胞，在安乐死前4小时腹膜内注射1 mg 5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU，Setareh Biotech），对原位肿瘤小鼠进行腹膜内注射。根据制造商的协议，使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像套件（Thermoscientific）在冰冻切片中检测到EdU。
为了分析两组之间差异的统计显着性，我们基于数据的正态分布使用了两尾学生t检验。所有误差条均表示标准偏差。所有样品代表生物学重复。没有样本或动物被排除在分析之外，并且没有使用样本量估计。将动物随机分组。研究不是盲目的进行的。
向野生型小鼠的结肠注射仅含有萤火虫荧光素酶mRNA或萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒。在结肠镜检查指导下，向Rosa26 LSL-tdTomato / LSL-荧光素酶小鼠注射Ad5CMV :: Cre。两天后，给小鼠腹膜内注射100 mg / kg D-荧光素，使其循环10分钟，然后安乐死并解剖结肠以进行生物发光成像（IVIS，Caliper Life Sciences）。
如先前所述合成脂质纳米颗粒（LNP）。简而言之，在微流体芯片装置中将含有脂质的乙醇相和含有mRNA的水相混合。水相由300μLCre mRNA（1mg / mL于10mM TRIS-HCL中，购自TriLink Biotechnologies，San Diego，CA），155μL柠檬酸盐（100mM，pH 3）和1097μL水组成。乙醇相包含可电离的脂质ckk-E12（3.0mg，在我们的实验室中合成，如上所述），1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE，4.1mg，Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL），胆固醇（3.3mg，Sigma）和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油3 -磷酸乙醇胺-N- [甲氧基（聚乙二醇）-2000]（C14-PEG 2000，1.4 mg，Avanti）的乙醇溶液（518μL，Sigma）。将所得的LNP溶液在20,000 MWCO盒中针对PBS进行20°C透析2小时。使用动态光散射（ZetaPALS，Brookhaven Instruments）测量LNP的尺寸（118nm，100％）和多分散性（PDI = 0.128）。
在涂有连续碳膜的花边铜质网格上的缓冲溶液中对LNP进行了低温TEM照相。然后将栅格安装在TEM柱内配备的Gatan 626低温支架上。在转移到显微镜和随后的成像过程中，样品和固定器的尖端被液氮连续冷却。使用JEOL 2100 FEG显微镜使用小剂量方法进行成像，这对于避免电子束下的样品损坏至关重要。该显微镜在200kV下操作，放大倍数设置为60,000，用于评估粒径和分布。所有图像均记录在Gata 2kx2k UltraScan CCD相机上。
使用Herculase II Fusion DNA聚合酶扩增包含sgApc靶序列的基因组区域，并进行凝胶纯化（正向引物5'至3'：AAGACCAGAGAGAGCCTTGTGG；反向引物5'至3'：GCTTGTGTCTCTGCTTTTCC）。根据制造商的说明，使用Nextera DNA样品制备试剂盒（Illumina）从50ng PCR产物中制备测序文库，并在Illumina MiSeq测序仪上进行测序，以产生150 bp的配对末端读数。使用上述方法和以下引物扩增和测序sgTrp53靶序列：正向引物5'至3'：ATTCCCGGCTGCTGCAGGTC；反向引物5'至3'：GGCGGGACTCGTGGAACAGAA）。
在审查基本质量概况后，将Illumina MiSeq读段（150bp的配对末端）修整为120bp，以降低较低质量的3'末端。使用FASTX工具包（Hannon Lab，CSHL）剪切了Nextera适配器的痕迹，并保留了每个长度大于15bp的对。此外，从后续分析中删除了其中任一对的碱基对低于Q30的基本质量阈值（桑格）的50％或更多碱基的读取对。目标基因座的参考序列已添加10bp基因组侧翼，并使用增强的后缀数组进行索引。使用10bp末端片段将阅读末端锚定在参考序列中，以进行后缀数组索引查找，以搜索精确匹配项。使用单位步长和10kbp的软限位限制的滑动窗口在每次读取的任一端搜索可能的锚点。对于每次读取，Smith-Waterman动态编程对齐方式在读取序列的缩减状态空间与跨越距离的锚点位置的相应参考序列之间执行“序列化”。选择计分参数以允许灵敏地检测短和长的插入和缺失，同时允许四个错配，并选择计分比对。对两个读物都以正确方向排列的读物对进行处理，以总结野生型读物的数量以及每个插入和缺失事件的位置和大小。如果两个对之间的重叠读取在事件位置之间重叠，则它们都需要支持该事件。另外，通过考虑与该区域至少有20bp重叠的阅读比对，在sgRNA序列和PAM位点范围内总结了突变事件和野生型阅读。突变调用被翻译为基因座标，随后使用Annovar进行注释。对齐和后处理代码是用C ++以及SeqAn和SSW库函数以及Perl和R中的实用程序函数实现的。使用集成基因组查看器（IGV）对突变电话进行人工审核。
如先前所述，鼠CRC细胞系衍生自AKP基因改造的肿瘤。在远端结肠机械磨损后，通过直肠灌肠将100μlAd5CMV :: Cre（爱荷华大学病毒载体核心设施； 10 10 TU /μl）递送至C57BL / 6 Apc fl / fl；克拉斯LSL-G12D / + ; Trp53 fl / fl小鼠在剖腹手术期间可限制腺病毒向远端结肠的递送并启动肿瘤发生。提取肿瘤，切碎，用1型胶原酶（200单位在5 ml PBS中）消化（沃辛顿，目录号LS004196））并作为永生化的二维培养物生长（DMEM补充了1X青霉素/链霉素和10％的胎牛血清）。然后通过FACS将细胞培养物分类为EpCAM +单细胞，并扩增得到纯AKP细胞系。LS174人CRC细胞获自ATCC。鼠AKP和人LS174细胞均检测到支原体污染呈阴性。
人类CDX2的ISH自动检测使用View- RNA eZL检测试剂盒（Affymetrix）在Bond RX免疫组织化学和ISH染色系统上使用BDZ 6.0软件（Leica Biosystems）进行mRNA表达。载玻片上福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片从去石蜡化到ISH染色到苏木精复染自动进行处理。简而言之，将5毫米厚的福尔马林固定组织切片在60℃下烘烤1小时，然后放在Bond RX上进行处理。Bond RX用户可选择的设置如下：ViewRNA eZ-1检测1-plex（Red）协议；ViewRNA Dewax1准备方案；查看RNA HIER 10分钟，ER1（95）；ViewRNA酶2（10）; ViewRNA探针杂交。通过这些设置，FFPE组织的RNA揭露条件包括在Bond Epitope Retrieval Solution 1（Leica Biosystems）中于95°C孵育10分钟，然后以1：1000稀释度与Bond Enzyme预处理试剂盒中的蛋白酶K孵育10分钟（徕卡生物系统公司）。将人CDX2 Ez探针分别在ViewRNA Probe Diluent（Affymetrix）中稀释为1:40和1:20。运行后，将载玻片用水冲洗，在室温下风干30分钟，然后使用Dako Ultramount（Dako，Carpinteria，CA）安装，并使用标准明场显微镜进行可视化。
来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5462879/
