光漂白现象(通常也称为褪色)当荧光团由于光子诱导的化学损伤和共价修饰而失去发荧光的能力时,就会发生)。在从激发的单重态转变为激发的三重态时,荧光团可与另一分子相互作用以产生不可逆的共价修饰。相对于单重态,三重态的寿命相对较长,因此使受激分子在更长的时间范围内与环境中的组分发生化学反应。在光致漂白之前,特定荧光团发生的激发和发射循环的平均数目取决于分子结构和局部环境。一些荧光团在仅发射几个光子后迅速漂白,而其他一些更坚固的荧光团在漂白前可能要经历数千或数百万个循环。
本程序使用在“未漂白图像”和“光漂白图像”窗口中出现的一对相同的荧光图像进行初始化。为了操作本程序,请单击“快门”按钮以打开虚拟快门,并在固定的时间段内使“光漂白图像”图像以极大的放大率褪色或光漂白。单击“暂停”按钮(变为“开始”按钮)可以随时停止衰落,然后单击“开始”按钮恢复衰落。在具有双标记和三标记的标本中,可以使用“颜色通道”分别查看各个荧光团的漂白速率复选框(默认设置是打开所有通道)。例如,单击带有三重标签的标本的红色复选框将仅显示红色通道。可以使用“添加”复选框将两个或三个颜色通道混合在一起,并在带有多个标签的样本中混合使用。可以使用“选择标本”下拉菜单选择一个新标本。标本名称包括以下荧光团标记信息:FITC,异硫氰酸荧光素;三重,红色,绿色和蓝色荧光团;双,两个荧光团;DAPI,4',6-二mid基-2-苯基吲哚; MitoTracker,线粒体探针;Alexa 488,绿色荧光团;和自动,自发荧光。本程序旨在重新加载后随机更改单个荧光团的光漂白速率,因此,反复单击“快门”按钮将演示随着每种颜色信号的荧光漂白速率变化而图像的外观。
由于光漂白是一种鲜为人知的现象,会导致大多数标本中荧光发射强度的急剧损失,因此控制伪影至关重要,这样才能成功捕获令人满意的图像。作为典型的荧光染料的一个例子,荧光素在中等至高光照强度下的光漂白的量子产率表明,一个平均分子在其使用寿命内(失效之前)将发出3万至4万个光子。另外,对于给定的荧光团,激发和发射循环的数量是恒定的,而不管激发能量如何以离散脉冲或通过连续照射的方式传递。因此,通过使用中性密度滤光片降低激发光水平并不能防止光漂白,
图1所示是在小鼠肠的多染色低温恒温器薄切片(16微米)在不同时间点捕获的一系列数字图像中观察到的光漂白(褪色)的典型示例。细胞核用Sytox Green(绿色荧光)染色,杯状细胞的粘液和刷缘的丝状肌动蛋白分别用Alexa Fluor 350小麦胚芽凝集素(蓝色荧光)和Alexa Fluor 568鬼笔环肽(红色荧光)染色。 。使用荧光滤光片组合以两分钟的间隔获取时间点,并调整带宽以同时激发三个荧光团,同时还记录组合的发射信号。请注意,图1(a)中所有三种荧光团的强度都相对较高,但是Alexa Fluor 350和568(蓝色和红色)的强度在两分钟后开始迅速下降,而在六分钟时几乎消失。绿色染色的核对光漂白的抵抗力更强,但在定时序列的过程中(10分钟),它们的强度也会稳定下降。各种各样的合成抗褪色剂将显着降低光漂白速率。
一类重要的光漂白事件是光动力学,意味着它们涉及荧光团与光和氧的组合的相互作用。荧光团与分子氧之间的反应会破坏荧光,并产生自由基单线态氧,可以化学修饰活细胞中的其他分子。由于光动力事件而引起的光漂白量是分子氧浓度以及荧光团,氧分子和其他细胞成分之间近端距离的函数。可以通过限制荧光团在照明下的曝光时间或降低激发能来减少光漂白。但是,这些技术也降低了可测量的荧光信号。在许多情况下,荧光团或细胞悬液的溶液可以脱氧,但这对于活细胞和组织是不可行的。
在某些情况下,还可以利用光致漂白效应来获得否则无法获得的特定信息。例如,在光漂白(FRAP)实验后的荧光恢复中,目标区域内的荧光团被有意地用过量的辐射漂白。随着新的荧光团分子扩散到标本的漂白区域中(回收),将监测荧光发射强度以确定目标荧光团的横向扩散速率。以这种方式,可以在单个细胞或活组织切片小(2至5微米)区域内确定荧光标记分子的翻译迁移率。