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在活细胞中，蛋白质之间的动态相互作用被认为在调节许多信号转导通路中起着关键作用，并有助于广泛的其他关键过程。过去，阐明这种相互作用机制的经典生物化学方法很常见，但在自然细胞环境中可能发生的微弱或短暂的相互作用对于这些技术通常是透明的。例如，在固定细胞中使用免疫荧光显微镜共定位可疑蛋白质伙伴已成为原位检查相互作用的流行方法，并且已经基于这种技术提出了许多文献报告。然而，由于荧光显微镜的分辨率比典型蛋白质的大小小几百倍，共定位通常会导致有问题的结果。一个很好的类比是荧光显微镜产生的信息相当于两个学生出现在一个大演讲厅的知识。它没有提供必要的分辨率来确定学生是否在同一个教室里，或者更好的是，如果他们坐在相邻的桌子上。
典型的荧光显微技术依赖于一个波长（激发）光的荧光团的吸收，然后是更长波长的二次荧光的后续发射。激发和发射波长通常彼此相隔数十至数百纳米。用特定荧光团标记细胞成分，如细胞核、线粒体、细胞骨架、高尔基体和细胞膜，使其能够在固定和活体制剂中定位。通过使用具有分离的激发和发射光谱的单个荧光团同时标记多个亚细胞结构，专门的荧光滤光片组合可用于检查单个细胞或组织切片内标记分子的接近程度。使用这种技术，比光学分辨率限制更接近的分子似乎是重合的（据说是共定位的）。这种明显的空间接近性意味着分子关联是可能的。然而，在大多数情况下，普通的衍射极限荧光显微镜分辨率不足以确定生物分子之间是否确实发生了相互作用。
共定位测量在最好的情况下是暗示性的，在最坏的情况下具有误导性，特别是考虑到许多信号通路使用相同的细胞结构，例如，用于许多受体复合物内化的网格蛋白包被的凹坑。两个分子或蛋白质实际上是相邻的，而不仅仅是位于同一邻域的知识，为确定它们的相互作用潜力提供了明显更可靠的方法。历史悠久的电子显微镜技术具有足够的分辨率来满足高精度定位的需要，但只是缺乏产生可靠结果所需的精确标记方法。此外，许多共定位技术通常应用于固定细胞内，这排除了可通过活细胞测定获得的非常理想的动态测量。多色荧光蛋白的荧光成像很容易允许对活细胞进行实验，这对于瞬态相互作用的测定是必要的，但该方法的空间分辨率相对较差，限制在大约 200 纳米。
通过应用Förster（或荧光）共振能量转移 (FRET) 显微镜技术，可以克服确定蛋白质分子空间接近度的限制。仅当两个适当定位的荧光团之间的距离为8到10纳米或更小时，FRET 才会发生。因此，FRET 非常适合研究在彼此相距几纳米的两个分子之间发生的蛋白质相互作用。在过去的十年中，由于需要使用与绿色荧光蛋白 (GFP) 及其突变衍生物融合的基因靶向特定蛋白质和肽的应用的增加，FRET 方法越来越受欢迎。两种光谱不同的荧光蛋白（称为FP-FRET) 已广泛应用于两种截然不同的实验技术，如下所述。示于图1中是一个 Jablonski 能量图，说明了 FRET 中供体发射和受体吸收之间涉及的耦合激发态跃迁。吸收和发射跃迁由直线垂直箭头（蓝色、绿色和红色）表示，而振动弛豫由波浪形黄色箭头表示。耦合跃迁用虚线表示，如果它们是由光子介导的电子跃迁引起的，则表明它们在 Jablonski 图中的正确位置。在合适的受体存在的情况下，供体荧光团可以将激发态能量直接转移到受体而不发射光子（如图1中的紫色箭头所示）。产生的荧光敏化发射具有与受体发射光谱相似的特性。
在活细胞中广泛实施 FRET 研究的主要障碍之一是缺乏用适当的荧光团标记特定细胞内蛋白质的合适方法。荧光蛋白的最新发展具有广泛的光谱剖面和蛋白质嵌合体（融合以及生物传感器）的日益复杂，已经产生了许多可用于 FRET 实验的潜在荧光蛋白对。荧光蛋白在FRET中的应用包括将选定的一对整合到生物传感器中（单个基因编码构建体）或在两个单独的蛋白质之间进行分子间测量，每个蛋白质融合到不同的荧光蛋白。后一种方法已被用于对各种蛋白质相互作用进行成像，包括受体的寡聚化和阐明转录因子的功能。然而，由于在活细胞中表达单独的荧光实体时不可避免地会发生可变的化学计量，因此对独立表达的蛋白质嵌合体进行FRET分析要困难得多。不管难度如何，当安装了适当的控制装置并且以严格的精度进行调查时，这种性质的实验可以产生信息丰富的结果。
荧光蛋白生物传感器在报告各种细胞内过程方面具有广泛的用途。通过创造性地将成对的荧光蛋白融合到生物聚合物上，这些生物聚合物在生理信号的各个方面执行关键功能，研究科学家们开发了许多新的分子探针，这些探针可用于重要过程的光学活细胞成像，如钙波诱导、循环核苷酸信使效应、pH 值变化、膜电位波动、磷酸化和细胞内蛋白酶作用。另一种但非常有用的生物传感器构建策略涉及对荧光蛋白骨架结构本身的修改，或者将肽分成在体内组合的单个单元以产生荧光（一种称为双分子荧光互补的技术;BiFC）或加入天然氨基和羧基末端在一起，并且将分子用于传感器肽内创建一个插入位点。
第一个荧光蛋白生物传感器是一种名为cameleon的钙指示剂，通过将蛋白质钙调蛋白和肌球蛋白轻链激酶的钙钙调蛋白结合域（M13域）夹在增强的蓝色和绿色荧光蛋白（EBFP和EGFP）之间构建。在细胞内钙水平增加的情况下，M13 结构域与钙调蛋白肽结合，在荧光蛋白之间产生 FRET 增加。不幸的是，该传感器受到非常低的动态范围（荧光增加 1.6 倍）的阻碍，并且由于缺乏亮度和 EBFP 的光稳定性差而难以可视化。使用相同模板的改进版本包含青色和黄色变体ECFP和EYFP产生更高的信号水平，当 YFP 衍生物（称为camgaroos）通过在荧光蛋白骨架的第七个β链的开头插入钙敏感肽时，获得了更好的结果。位于这个不寻常位置的传感器肽在保持高水平荧光方面具有很好的耐受性。另一种策略利用荧光蛋白中常见的独特桶状结构，通过连接天然N和C来重新配置蛋白质的末端终止并在结构中心区域（通常在环中）内的几个位置之一创建新的起始密码子。称为循环置换荧光蛋白，这些结构修饰的衍生物可以与钙调蛋白和 M13 融合，以产生出色的钙生物传感器。
钙生物传感器紧随其后的是 pH、磷酸化和蛋白酶活性的遗传指标。可以使用两种通用方法来调整荧光蛋白作为 pH 传感器。第一个依赖于 EGFP (pKa = 5.9) 和 EYFP (pKa = 6.5) 对酸性环境的荧光敏感性，再加上其他蛋白质的相对不敏感性，例如 ECFP (pKa = 4.7) 或DsRed (pKa = 4.5)。EGFP 或 EYFP 与不太敏感的荧光蛋白的融合产生了一个比例探针，可用于测量细胞内隔室的酸度。第二种方法依赖于天然（野生型）GFP 的质子化变化，这会导致天然蛋白质的双峰光谱曲线发生变化。一类名为pHluorins的探针源自 wtGFP，随着 pH 值的降低，激发峰从 470 纳米到 410 纳米发生偏移。还开发了双发射 pH 传感器，其在绿色和蓝色光谱区域具有峰值。尽管无法实时报告激酶活性，磷酸化生物传感器由含有来自特定激酶的磷酸化基序的肽和夹在两个具有 FRET 能力的荧光蛋白之间的磷酸肽结合域组成。当生物传感器被激酶磷酸化时，磷酸肽结合域与磷酸化序列结合，从而调用或破坏 FRET。这种简单的策略已被证明可以产生强大且高度特异性的生物传感器。与许多其他生物传感器一样，主要缺点是动态范围减小。
也许最广泛使用的用于筛选新的或改进的 FRET 对的生物传感器设计涉及蛋白酶裂解测定（见图 2）。简单的基序由两个荧光蛋白组成，它们通过一个短肽连接在一起，该短肽包含一个共有蛋白酶切割位点。通常，传感器表现出非常强的能量转移，在接头序列切割后完全消除。由于该技术通常具有高动态范围水平，因此可用于筛选具有黄色、橙色和红色受体的新青色和绿色 FRET 供体。最大的蛋白酶生物传感器家族包含对蛋白酶的半胱天冬酶家族之一敏感的切割位点，这使得传感器能够在诱导细胞凋亡期间进行检查。在过去的几年中，已经报道了大量使用敏化荧光蛋白和 FRET 对的新型生物传感器。尽管使用 ECFP 和 EYFP 衍生物的 FRET 传感器的动态范围持续受到限制，但这种策略已被广泛采用，可能是由于比率测量的简单性和探头构造的简便性。毫无疑问，使用更先进的荧光蛋白组合会出现新的策略，这些组合有助于增加这类非常有用的探针的动态范围和其他特性。
FRET 的基本机制涉及处于激发电子状态的供体荧光团，它可以通过长程偶极 - 偶极相互作用以非辐射方式将其激发能量转移到附近的受体荧光团（或生色团）。支持能量转移的理论基于将激发的荧光团视为振荡偶极子的概念，该偶极子可以与具有相似共振频率的第二个偶极子进行能量交换。在这方面，共振能量转移类似于耦合振荡器的行为，例如一对以相同频率振动的音叉或无线电天线。相比之下，辐射能量转移需要光子的发射和再吸收，并且取决于样品的物理尺寸和光学特性，以及容器的几何形状和波前路径。与辐射机制不同，共振能量转移可以产生大量关于供体-受体对的结构信息。
共振能量转移对荧光团周围的溶剂壳不敏感，因此会产生与溶剂相关事件（例如荧光猝灭、激发态反应、溶剂弛豫或各向异性测量）所揭示的分子信息所独有的分子信息。溶剂对参与共振能量转移的荧光团的主要影响是对供体和受体光谱特性的影响。与短程溶剂效应相比，非辐射能量转移发生的距离要长得多，并且位于相关荧光团之间的成分（溶剂和宿主大分子）的介电性质对共振能量转移的功效几乎没有影响，这主要取决于供体和受体荧光团之间的距离。
FRET 现象不是由光子发射介导的，而且，甚至不需要受体发色团发荧光。然而，在大多数应用中，供体和受体都是荧光的，能量转移的发生通过供体荧光的猝灭和荧光寿命的缩短以及受体荧光发射的增加来体现。共振能量转移理论最初是由 Theodor Förster提出的，为了纪念他的贡献，最近以他的名字命名。Förster理论表明FRET效率 (E) 随两个分子之间距离的倒数六次方变化（由r表示）：
EFRET = 1/[1 + (r/R0)6]
其中R(0)是 FRET 效率为 50% 时的特征距离，可以为任何一对荧光分子计算（此变量也称为Förster 半径，下面将进行更详细的讨论）。理论荧光团对（增强的青色和黄色荧光蛋白）的 FRET 效率如图 3(a) 所示。由于六次幂的倒数依赖于两个分子之间的距离 (r)，曲线有一个非常急剧的下降。对于小于R(0) 的距离，FRET 效率接近最大值，而对于大于R(0) 的距离，效率迅速接近于零。测量 FRET 的有用范围由图 3(a) 中的红色阴影区域表示，其限值为 0.5 和 1.5 x R(0)。FRET 可以有效地用作那些接近R(0)距离的分子标尺，事实上 FRET 已经通过使用精密光谱方法在结构生物学中适用于此类目的。然而，对于细胞生物学中的大多数应用，可用的信噪比将 FRET 实验限制为更二进制的读数。实际上，测量通常只能区分高 FRET和低 FRET，或者只是区分FRET的存在和不存在。
如前所述，可以很容易地计算出任何一对荧光分子的R(0)。水性（或缓冲）溶液中的R(0)值由具有完善输入参数的相当简单的方程确定：
R0 = [2.8 x 1017 × Κ2 × QD × ΕA × J(λ)]1/6 纳米
其中Κ(2)或kappa 平方表示两个荧光团偶极子之间的取向因子（用于计算取向因子的角度汇总见图 3(b)），Q(D)是供体量子产率，Ε(A)是在每厘米倒数摩尔的最大受体消光系数，和J(λ)是光谱重叠积分（参见图4的归一化供体荧光之间），F(D)(λ)，和受体激发光谱，E(A)(λ)，根据等式：
J(λ) =∫FD(λ) × EA(λ)×λ4dλ
尽管数学可能看起来很复杂，但大多数参数都是在文献中很容易找到的常数。通常需要进一步解释的两个最重要的术语是Κ(2)和J(λ)，即重叠积分。方向角变量 (Κ(2)) 仅表示 FRET 耦合取决于两个荧光团之间的角度，其方式与无线电天线的位置可以影响其接收的方式大致相同。如果供体和受体彼此平行排列，则 FRET 效率将高于垂直取向。这种对齐程度定义了Κ(2)。虽然Κ(2)可以在0到4之间变化，通常假设为2/3，这是所有可能角度的积分平均值。对于几乎任何现实情况，Κ(2)都接近 2/3，研究人员通常无法调整该值（尽管有些人将荧光蛋白牢固地连接到他们感兴趣的目标蛋白上，这可能会导致戏剧性的效果）。重叠积分J(λ)是两个光谱之间的重叠区域，如图 4 所示.可以影响 FRET 的其他参数是供体的量子产率和受体的消光系数。因此，为了最大化 FRET 信号，研究人员必须选择最高的量子产率供体、最高吸收受体和在其光谱轮廓中有显着重叠的荧光团。这个理论已经被实验反复验证，没有其他机制可以最大化非对齐荧光探针的FRET。
应该注意的是，上面讨论的每个参数仅通过六次方影响 Förster 半径计算。因此，供体量子产率翻倍仅导致R(0)的 12.5% 变化。由于几乎所有 FRET 成像实验中使用的荧光团都具有高量子产率（大于 0.5）和消光系数（大于 50,000），因此可能的Förster半径值范围限制在 4 到 6 纳米之间，并且大多数 FRET 对具有平均的值R（0）~ 5纳米。鉴于 FRET 效率强烈依赖于 FRET 对之间的距离以及荧光团的相对方向，FRET 可用于检测由两种蛋白质之间的亲和力变化或它们结合的构象。值得重申的是，对于细胞生物学中的大多数 FRET 成像应用，实验通常仅区分两种状态（FRET和无FRET），并且需要额外的信息来帮助对观察到的 FRET 变化进行分子解释。
在实践中，范围广泛的问题会使 FRET 测量复杂化和/或妥协，最终导致模棱两可或毫无意义的结果。主要问题之一是供体和受体荧光团一起成像时可能表现出明显不同的亮度水平。虽然理论上这种差异不应该是一个问题，但在实践中，因为大多数仪器只能测量有限的动态范围，双荧光团成像可能会导致一个通道饱和（对于更亮的荧光团），而另一个通道被系统的噪声（对于调光荧光团）。因此，只要有可能，最好使用亮度相当的施主和受主。
另一个可以限制 FRET 检测的因素是供体到受体的化学计量，它位于 10:1 和 1:10 之间的范围之外。这一因素可能严重限制了蛋白质-蛋白质相互作用的 FRET 测量，其中一个伙伴可能浓度过高。主要问题是在未经历 FRET 的荧光标记背景下测量少量 FRET。由于实际上没有什么可以改善这种情况，因此属于这一类的许多可能的蛋白质-蛋白质相互作用实验根本不适合通过 FRET 技术进行检查。上述荧光蛋白生物传感器仅由单一供体和受体构成，化学计量固定并保证为1:1；因此，
光谱重叠荧光团之间的渗漏（也称为串扰和交叉）和交叉激发的存在也是阻碍 FRET 研究的重要问题（见图 5）。在某些情况下，受体可以直接用波长范围内的光激发以激发供体（图 5（a））。此外，来自供体的荧光可能会泄漏到受体荧光的检测通道中，特别是当供体和受体的发射光谱分布显着重叠时（图 5（b））。因为这两个串扰源来自有机荧光团的光物理学，并且肯定会出现在任何 FRET 对中，所以在测量 FRET 时必须解决它们。选择光谱分离良好的荧光团是减少串扰的极好机制。然而，在大多数情况下，增加的光谱分离也会减少重叠积分（J(λ)），这在实践中通常会转化为检测 FRET 信号的能力降低。
最后，如果两个荧光团没有正确对齐（例如，Κ(2)值近似为零）或者如果它们根本不位于 Förster 半径内（大于 6 纳米），则可以降低 FRET 信号的水平）。例如，如果两个标记的蛋白质相互作用，但荧光标记位于复合物的两侧，则可能无法检测到 FRET 信号，即使感兴趣的蛋白质已结合。在一般实践中，这种类型的假阴性很常见，尤其是荧光蛋白 FRET 伙伴。通常，在检测到足够可靠的 FRET 信号之前，需要多种标记策略。然而，在制作载体构建体或进行合成标记实验之前，通过明智地选择要使用的荧光团对，可以缓解（或部分缓解）上述每个问题。
示于图5是在ECFP和mVenus，的激发和发射光谱曲线目前用于FRET调查最优选的荧光蛋白对一个重叠。这两种蛋白质在激发（图 5（a））和发射（图 5（b））中表现出相当大的重叠) 光谱。FRET 受体的直接激发（mVenus；红色曲线）可能很重要，这取决于用于激发供体的波长（ECFP；青色曲线或 mCerulean；蓝色曲线），因为与黄色蛋白相比，黄色蛋白的消光系数更高青色蛋白质。当 ECFP 用作供体时，这种重叠尤其成问题，并且可以通过使用具有高消光系数的 CFP 变体（例如 mCerulean）来部分抵消。请注意，图 5(a)中的激发曲线是按比例绘制的，以反映黄色和青色蛋白质之间消光系数的差异。458 纳米激发产生的 mVenus 激发串扰比 405 或 440 纳米激发高得多。ECFP 的宽荧光发射光谱 (图 5(b)) 在整个 mVenus 发射区域表现出相当大的强度重叠。
研究人员使用荧光蛋白生物传感器，或试图匹配融合到单独相互作用目标的荧光探针的化学计量，应尽可能多地使用不同的 FRET 分析技术来建立给定实验的方法。这种努力是有必要的，因为每个荧光蛋白 FRET 对都表现出独特的病理，使其使用复杂化，需要清楚地了解用于测量大多数 FRET 检测中产生的相对较小信号差异的光学显微镜参数。一旦系统和可能的结果很好地建立起来，那么最简单的方法就可以用于正在进行的程序。为 FRET 成像而开发的技术列表非常广泛。一般来说，
敏感发射- 使用校正激发和发射串扰的算法的双通道成像
受体光漂白- 也称为供体去淬灭，该技术测量受体光漂白时增加的供体发射
荧光寿命成像显微镜 (FLIM) - 荧光蛋白（或其他荧光团）供体寿命测量变化
光谱成像- 在一个或两个波长处激发并测量供体和受体的完整光谱图
荧光偏振成像- 以高信噪比测量平行和垂直于激发的偏振
上面列出的每种 FRET 方法都有优点和缺点。例如，一方面，双通道成像是最简单的方法，但需要最复杂的一组控制。另一方面，FLIM 可以对 FRET 效率进行明确的测量，并且仪器可用于集成到尼康 A1 HD25/A1R HD25共聚焦系统中。
通常也称为双色比成像对于对照，敏化发射可能是 FRET 成像的最简单方法。供体荧光团由特定波长（在宽场或共聚焦显微镜中）激发，并通过使用为供体荧光和受体荧光选择的发射滤光片收集信号。在两个荧光团的激发和荧光之间（不切实际）不存在串扰的情况下，敏化发射将是一种完美的方法。然而，荧光蛋白之间的串扰是一个重大问题，通常需要大量的控制实验来确定 FRET 的存在与否。因此，用这种方法很难获得定量准确的 FRET 数据。在宽场荧光显微镜上配置敏化发射相对简单，许多实验室都有，
已经为敏化发射 FRET 成像开发了多种校正方法。基本概念涉及对多个样本使用不同的过滤器组合，这些样本包含：只有供体、只有受体，以及具有供体和受体的推定 FRET 样品。这些样品的发射值允许研究人员确定激发和发射通道中预期的串扰量，并将其从 FRET 测量中减去。理论上，这种方法效果很好，但不幸的是，图像处理的要求增加了所有图像中的噪声水平。因此，如果 FRET 信号很小，那么使用这种方法可能难以测量FRET。
尽管存在上述困难，但敏化发射测量对于快速动态实验很有用，在这些实验中，由于能够同时获取两个图像，因此 FRET 信号很大。在检查 FRET 动态范围很大且供体和受体的化学计量比固定为 1:1 的荧光蛋白生物传感器时，敏化发射是一种特别有吸引力的技术。一个很好的例子是图 2中所示的蛋白酶生物传感器。这种嵌合体经过工程设计，具有高 FRET 效率，当肽接头被酶促切割时，该效率基本上降至零。结果是一个大且易于测量的 FRET 变化，表明在活细胞内的给定时间和区域具有特定的蛋白酶活性。
尽管仅限于单次测量，但受体光漂白（或供体去淬灭）也是一种简单的技术，通常会产生出色的结果。基本概念利用了这样一个事实，即供体荧光在 FRET 期间被淬灭，因为一些供体荧光能量被引导到受体。光漂白受体荧光团不可逆地消除了淬灭效应并增加了供体荧光的水平。如果荧光团之间发生 FRET，则当受体被移除时，供体荧光必须增加。一般来说，重要的是要确保受体光漂白不会降低供体荧光，并且受体光漂白到其初始值的大约 10%。激光扫描共聚焦显微镜可以轻松满足这两个限制条件，
受体光漂白技术的优点是非常简单、定量，并且仅使用单个样品进行。FRET 效率可以通过从光漂白受体后的强度中减去受体存在下的供体强度来计算，然后将该值归一化为漂白后的供体强度。主要缺点是受体光漂白具有破坏性，每个细胞只能使用一次，将其应用限制在那些不涉及动态测量的实验中。此外，光漂白是一个相对缓慢的过程，通常需要几分钟或更长时间。尽管如此，在实验结束时进行受体光漂白测量几乎总是值得的，无论使用哪种方法来检测 FRET。
示于图6是使用活细胞成像致敏发射和受体漂白FRET测定法的实例。图 6(a)说明了表达由 mCerulean 和 mVenus 组成的骆驼生物传感器的人类宫颈癌上皮细胞（HeLa 系），以及包含钙调蛋白和 M13 结构域（如上所述）的介入钙敏感肽。在添加钙诱导剂（离子霉素）之前，用 440 纳米照明激发细胞会产生青色荧光，表明青色和黄色荧光蛋白之间缺乏 FRET（图 6（a））。添加离子霉素后，延时双色比成像（敏化发射）记录钙波穿过细胞质，因为生物传感器响应荧光蛋白之间 FRET 水平的增加（图 6（b）和 6（c）） ; FRET 是伪彩色的黄红色）。图 6(d)-(f)中的非洲绿猴肾细胞（COS-7 系）用合成花青染料 Cy3（图 6(d)；绿色）和 Cy5（图 6(e)；红色）标记)，与霍乱毒素 B 亚基结合并靶向质膜。在膜内，两种染料的接近会产生高水平的 FRET。在细胞的选定区域中对 Cy5 进行光漂白（图 6(e) 中的白框）)仅在供体通道中观察荧光时，在相应区域增加供体去猝灭（增加图 6(f)中的绿色荧光）。
寿命测量是迄今为止确定FRET的最严格的方法。此外，由于仅监测供体荧光，因此它们也不太容易出现串扰伪影。所有荧光分子在纳秒时间尺度上都表现出其荧光的指数衰减，并且这种衰减的速率对淬灭荧光的环境变量很敏感。因此，FLIM 的基本概念与受体光漂白的概念有些相关。供体荧光被 FRET 相互作用淬灭，淬灭量可以通过测量在 FRET 存在下供体荧光衰减时间的减少来确定。通过这种方式，FLIM 提供了一个明确的 FRET 效率值。结合 FLIM-FRET 测量的优点之一是它们对直接受体激发伪影不敏感，以及荧光供体可以与本身不具有荧光的受体耦合的事实。这两个方面都有助于扩大研究人员可用的有用荧光蛋白 FRET 对的数量。
FLIM 有几个限制，使其无法成为 FRET 成像的主要方法。首先，纳秒寿命范围内的测量很复杂，而且仪器的获得和维护成本很高。此外，这种类型的精密设备并不广泛可用。此外，FLIM 通常是较慢的成像方法之一，可能需要几分钟来获取每个图像，这限制了它在许多 FRET 实验中的实用性。随着制造商开发更多用户友好和更快的交钥匙商业系统，这些限制可能会在未来解除。另一个显着的缺点是活细胞中荧光蛋白的寿命通常显示多指数衰减，需要更全面的数据分析来进行定量 FRET 分析。此外，局部环境因素，如自发荧光或 pH 值的变化，也会缩短测量的荧光寿命，导致伪影。因此，在解释活细胞中的 FLIM-FRET 数据时必须非常小心。
光谱成像技术是敏化发射 FRET 检测方法的一种变体，但不是通过两个单独的通道获取数据，而是在激发供体时收集包含供体和受体荧光的整个发射光谱。记录整个光谱是用于光谱学实验的典型方法，但它是宽场和共聚焦显微镜中工具调色板的一个相对较新的补充。该概念的核心前提是收集整个荧光光谱能够通过不仅使用发射峰而且还使用光谱尾部的不同形状来分离重叠光谱。在收集来自供体和受体荧光团的光谱时，可以确定供体和受体荧光的相对水平。
光谱成像技术需要专门的设备，但许多商用共聚焦显微镜上都可以使用出色的系统，并且可以以适中的成本添加到传统的荧光显微镜上。由于受体的直接激发或在共聚焦显微镜中使用两个激发波长，对串扰水平进行定量分析，可以准确确定 FRET 的数量。这种方法的主要缺点是降低了与获取完整频谱相关的信噪比，而不是使用基于滤波器的系统通过两个通道收集它。然而，随着更多商业系统的开发和安装，光谱成像在 FRET 分析中的应用正在增加。在不远的将来，
在示出的图7（a）中是由 mCerulean 和 mVenus 荧光蛋白与10个氨基酸接头融合在一起的伪 FRET 生物传感器的供体寿命衰减（mCerulean 荧光蛋白）的变化。蓝色衰减曲线显示了在单独表达 mCerulean 的细胞中观察到的寿命，而红色衰减曲线表示在细胞表达串联蛋白质时获得的 mCerulean 寿命。请注意当蛋白质参与共振能量转移时 mCerulean 寿命的减少。曲线之间的区域表示在 FRET 配对中通过 FRET 从 mCerulean（供体）转移到 mVenus（受体）的能量。当在活细胞中以 405 纳米激发时，同一伪生物传感器中 mCerulean-mVenus 的 450 至 650 纳米的发射曲线如图 7(b)中的红色曲线所示. 从 mCerulean 到 mVenus 的能量转移导致在 529 纳米（mVenus 发射最大值）处出现大量发射峰值，在 475 纳米（mCerulean 的峰值发射波长）处的值要低得多（大约 25%）。用 514 纳米激光对 mVenus 进行光漂白并重复光谱扫描后，发射剖面移至较低波长，与没有 FRET 伙伴的 mCerulean 光谱非常相似。这些光谱图谱在475和529纳米处的强度差异与偶联蛋白质之间的 FRET 效率有关。
荧光偏振的测量为荧光蛋白 FRET 的高对比度辨别提供了特殊的优势。该概念基于这样一个事实，即用偏振光激发会选择一群荧光分子，这些分子的吸收矢量与激发光的偏振矢量平行。在激发之后，大部分荧光发射将保持平行于激发的偏振，因此荧光可以被认为是各向异性的。如果分子在纳秒荧光寿命期间旋转，则各向异性将消失。然而，由于荧光蛋白较大且旋转缓慢，因此它们的荧光在测量时间过程中不会发生很大程度的去极化。
这种方法的主要优点是易于测量平行和垂直于具有高信噪比的激发矢量的荧光偏振。由于可以快速获取偏振各向异性数据，且图像处理要求极低，因此该技术非常适合高内涵筛选应用。然而，必须避免受体的直接激发，因为它会降低供体信号并降低测量的信噪比。此外，虽然这种技术在区分 FRET 的存在和不存在方面非常出色，但它不是区分强 FRET和弱 FRET 的好方法。最后，高数值孔径物镜中的偏振会降低，
示于图8是使用荧光蛋白作为模型系统的偏振各向异性的图解说明。当随机定向的荧光蛋白群（图 8(a)) 被线性偏振光（青色波）激发，只有那些吸收偶极矢量平行于偏振方位角的分子被优先激发。使用与激发光偏振矢量（绿波）平行的分析仪，可以将正确定向的荧光蛋白的发射作为信号观察到。所得各向异性是取向程度的指标，可以通过测量和比较垂直和水平取向分析仪的发射强度来确定。如果荧光蛋白在实验的时间尺度内旋转（图 8（b））或者如果它由于 FRET 将激发能量转移到邻近的蛋白质（图 8（c）），则各向异性信号水平将降低) 具有不同的方向。如上所述，由于共振能量转移可以比大荧光蛋白分子的分子旋转发生得快得多，因此可以很容易地将 FRET引起的去极化与旋转过程中发生的各向异性损失区分开来。
用于检查活细胞 FRET 的合适探针的选择是有限的。合成荧光团是固定细胞共振能量转移研究的理想选择，但难以在活细胞中给药和靶向。同样，量子点可用于标记膜成分以检查细胞外部的现象，但它们也无法穿透膜，因此在细胞内隔室（如细胞核、线粒体或内质）中几乎没有用网状。基因编码的荧光蛋白目前代表了活细胞中 FRET 高分辨率成像的最佳候选者，这一领域每年发表的大量文献证明了这一点。然而，使用合成荧光团和量子点测量 FRET 时遇到的许多典型伪影在应用于荧光蛋白时尤其严重。例如，与合成材料中 30-40 纳米的发射光谱图谱带宽相反，荧光蛋白中的发射光谱图谱范围从大约 60 纳米到 100 纳米，当试图分离供体和受体荧光时，通常会导致显着重叠。荧光蛋白的广谱也限制了可在 FRET 和其他类型的成像实验中一起使用的探针的数量。此外，荧光蛋白在亮度水平上表现出很大的变化。例如，最受欢迎的供体蛋白之一 ECFP 的亮度比其常见的黄色受体伙伴 EYFP 低五倍。
围绕荧光蛋白发色团的是 220 多个氨基酸的多肽，该多肽缠绕成尺寸约为 2.4 x 4.2 纳米的三维圆柱结构（称为β-桶或β-罐），并由广泛的氢键多肽β-折叠组成围绕并保护包含发色团的中央α-螺旋（见图 9）。桶的末端用半螺旋肽区域覆盖，用于阻止离子和小分子的进入。蛋白质的内部紧密地挤满了氨基酸侧链和水分子，以至于氧气、离子或其他设法穿过桶端的侵入小分子的扩散空间很小。这些有利的结构参数是荧光蛋白的弹性光稳定性和优异性能的部分原因，也有助于降低 FRET 效率。大尺寸的桶有效地屏蔽了相邻的带有肽残基的荧光蛋白生色团（限制接近距离为 2 到 3 纳米；由图 9 中的红线表示）)，导致最大 FRET 效率降低到理论值的大约 40%。无论如何，使用荧光蛋白进行活细胞 FRET 成像的众多好处远远超过成本。
荧光蛋白出现的高度光谱带宽重叠和大小问题是它们寡聚化的趋势。迄今为止发现的几乎所有荧光蛋白都至少显示出有限程度的四级结构，例如天然维多利亚水母的弱趋势绿色荧光蛋白及其衍生物在高浓度固定时二聚化。在珊瑚礁和海葵中分离的天然黄色、橙色和红色荧光蛋白的严格四聚基序也证实了这种趋势。对于细胞生物学中的许多应用，寡聚化可能是一个重大问题，特别是在荧光蛋白与靶向特定亚细胞位置的宿主蛋白融合的情况下。一旦表达，嵌合体的荧光蛋白部分诱导的二聚体和高级寡聚体的形成会产生非典型定位，破坏正常功能，干扰信号级联，或限制融合产物在特定细胞器或细胞质内聚集。当荧光蛋白与自身参与天然寡聚体形成的伙伴融合时，这种效果尤其显着。与仅形成弱二聚体的蛋白质的融合产物（实际上，大多数Aequorea victoria变种）可能不会表现出聚集或不正确的靶向，前提是局部浓度保持较低。然而，当弱二聚体荧光蛋白靶向特定的细胞区室（如质膜）时，局部蛋白浓度在某些情况下会变得足够高以允许二聚化。在进行分子间 FRET 实验时，这可能是一个特别关注的问题，这可能会产生复杂的数据集，这些数据集有时会受到二聚化伪影的影响。另一方面，在某些情况下，水母蛋白中自然发生的弱二聚化可用于增加生物传感器中的 FRET 信号，否则将表现出有限的动态范围。
毒性是由于合成荧光团浓度过高以及定位不佳的荧光蛋白过度表达或聚集而导致的问题。此外，显微镜成像室中最佳标记的哺乳动物细胞的健康和寿命也可能受到许多其他有害因素的影响。其中最重要的是在荧光标记的细胞反复暴露于激光和高强度电弧放电灯的照射下时发生的光诱导损伤（光毒性）。在激发态下，荧光分子倾向于与分子氧反应产生自由基，自由基会破坏亚细胞成分并损害整个细胞。荧光蛋白，由于它们的荧光团深埋在保护性多肽包膜中，通常对细胞没有光毒性。在设计 FRET 实验时，应选择具有最长激发波长的荧光蛋白组合，以尽量减少短波长照射对细胞的损害，尤其是在长期成像实验中。因此，与其用蓝色或青色荧光蛋白（分别由紫外线和蓝色照明激发）产生融合产物和生物传感器，在光谱的黄色、橙色和红色区域发射的变体会更理想。
研究人员在使用新的荧光蛋白生物传感器和细胞系时应注意进行必要的控制实验，以确保细胞毒性和光毒性伪影不会掩盖 FRET 结果或其他重要的生物现象。在某些情况下，在瞬时转染后的细胞系成像过程中，亲脂性试剂会诱发有害作用，这些作用可能与荧光蛋白毒性相混淆。来自珊瑚礁的寡聚荧光蛋白（上面讨论过）比单体水母蛋白更容易形成聚集体（结合不良的亚细胞定位），但任何变体都可能出现折叠不当的融合产物。最近，一种能够产生活性氧（ROS）的荧光蛋白) 已被报道为通过发色团辅助光灭活 (CALI)灭活特定蛋白质的有效试剂。这种基因编码的光敏剂被恰当地命名为KillerRed，在显微镜照射下能够杀死细菌和真核细胞。先前对 EGFP 光毒性的研究表明，即使发色团能够产生单线态氧，荧光蛋白作为光敏剂的效率也相对较低。然而，长时间照射表达 EGFP 及其变体的细胞会导致生理改变和最终的细胞死亡，这是长期成像实验中潜在光毒性的明确信号。
在活细胞实验中，由于与合成荧光团相比，荧光蛋白的光漂白率降低，因此对于扩展成像非常有利。尽管在光稳定性方面荧光蛋白之间存在高度不相关的变异性，但大多数变体可用于短期成像（从 1 到 25 次捕获），而几种更耐光的蛋白质可用于延时序列跨越 24 小时或更长时间（其中收集了数百到数千张图像）。然而，任何特定蛋白质的长期稳定性都必须针对每种照明场景（宽场、共焦、多光子、扫场等）进行研究。) 因为当照明由电弧放电灯与激光系统产生时，通常会观察到相同蛋白质的光稳定性差异。因此，在光稳定性方面，荧光蛋白的选择取决于许多参数，包括照明条件、表达系统和成像设置的有效性。
在过去几年中，已经开发和改进了多种新的荧光蛋白变体，以具有跨越 200 纳米范围（从大约 450 纳米到 650 纳米）的发射曲线，从而填补了许多空白，以提供潜在有用的 FRET 合作伙伴每个颜色类。在蓝色（440 纳米到 470 纳米）和青色（470 纳米到 500 纳米）光谱区域开发蛋白质的最新进展已经产生了几种可能用于成像和 FRET 研究的新探针。三个蛋白质工程小组报告了改进的蓝色水母荧光蛋白变体，与 EBFP 相比，它们具有更高的亮度和光稳定性。命名为Azurite、SBFP2（强增强蓝色 FP）和EBFP2（见表1），这些蛋白质为在蓝色光谱区域中成功对活细胞进行长期成像提供了第一个真正的希望，并且都具有与 FRET 生物传感器中的 EGFP 和衍生物组合的重要适用性。新蓝色报告基因中最亮和最耐光的 EBFP2 在融合中表现出典型的 GFP 样行为，并且已被证明是绿色光谱类蛋白质的出色 FRET 供体。所有蓝色荧光蛋白都可以使用标准DAPI滤光片组或售后市场制造商提供的专有 BFP 组在荧光显微镜中轻松成像。
青色光谱区域中的荧光蛋白与黄色发光蛋白配对时已被广泛用作 FRET 供体，并且在引入单体青色报告基因（称为mTFP1）之前一直由原始Aequorea ECFP的变体主导。与水母CFP相比，蓝绿色荧光蛋白具有更高的亮度和酸稳定性，并且更耐光。mTFP1 的高发射量子产率（见表 1) 提供了一个很好的替代青色衍生物、mECFP 和 mCerulean，当与黄色或橙色荧光蛋白结合时，作为 FRET 供体。额外的研究在青色光谱类中产生了有用的蛋白质。在最近推出的改进的青色荧光蛋白中，CyPet和称为Cerulean的增强型青色变体显示出最有希望作为融合标签、FRET 生物传感器和多色成像的候选者。Cerulean 的亮度至少是 ECFP 的 2 倍，并且在 FRET 研究中已证明，当与发黄荧光蛋白（如金星（见下文））结合时，可显着提高对比度和信噪比。名 CyPet的 CFP 变体（来自首字母缩写词：Cy一个荧光P rotein为ë NERGY吨转让（BOT））通过使用荧光激活细胞分选（一种独特的策略衍生FACS）来优化FRET青色和黄色的配对。CyPet的亮度约为 EGFP 的一半，亮度为 Cerulean 的三分之二，但在 37 摄氏度时表达相对较差。然而，CyPet比CFP具有更多的蓝移和更窄的荧光发射峰，这大大增加了其多色成像的潜力。
将有益的折叠突变引入 ECFP 的单体变体中，产生了具有增强亮度、折叠效率、溶解性和 FRET 性能的新变体。被称为超级CFP (SCFP)，新的报告基因在细菌中表达时比母体蛋白显着更亮，在哺乳动物细胞中几乎亮两倍。这些高性能探针对于常规融合标签和创建具有高动态范围的新型 CFP-YFP FRET 生物传感器都非常有用。另一种新的单体青色报告基因 TagCFP来自水母Aequorea macrodactyla的 GFP 样蛋白.关于该蛋白质的具体细节在文献中不可用，但它可作为哺乳动物克隆载体和 Evrogen 的融合物在商业上获得。据报道，TagCFP 比 ECFP 和 Cerulean 更亮，但具有相似的耐酸性。另一种发青色的蛋白质Midoriishi-Cyan（缩写为MiCy）最初被设计为与单体Kusabira Orange(mKO；见表1)的新 FRET 组合中的供体) 以生成具有高光谱重叠的生物传感器（福斯特距离为 5.3）。这种蛋白质的特点是在青色光谱区域中的任何探针的最长吸收和发射波长分布（分别为 472 和 495 纳米）。MiCy 表现出的高摩尔消光系数和量子产率使蛋白质具有与蔚蓝相同的亮度。
| 蛋白质对 | 供体激发最大值 (nm) | 受体发射最大值 (nm) | 供体量子产率 | 受体摩尔消光系数 | 福斯特距离 (nm) | 亮度比 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| EBFP2-mEGFP | 383 | 507 | 0.56 | 57,500 | 4.8 | 1:2 |
| ECFP-EYFP | 440 | 527 | 0.40 | 83,400 | 4.9 | 1:4 |
| 天蓝色-金星 | 440 | 528 | 0.62 | 92,200 | 5.4 | 1:2 |
| MiCy-mKO | 472 | 559 | 0.90 | 51,600 | 5.3 | 1:2 |
| TFP1-mVenus | 492 | 528 | 0.85 | 92,200 | 5.1 | 1:1 |
| CyPet-YPet | 477 | 530 | 0.51 | 104,000 | 5.1 | 1:4.5 |
| EGFP-mCherry | 507 | 610 | 0.60 | 72,000 | 5.1 | 2.5:1 |
| 维纳斯-mCherry | 528 | 610 | 0.57 | 72,000 | 5.7 | 3:1 |
| 金星-tdTomato | 528 | 581 | 0.57 | 138,000 | 5.9 | 1:2 |
| 维纳斯-梅花 | 528 | 649 | 0.57 | 41,000 | 5.2 | 13:1 |
目前对绿色类（500 纳米至 525 纳米）中 FRET 报告基因进行活细胞成像的最佳选择是 GFP 衍生物Emerald，其特性与其 EGFP 母体相似。Emerald 包含EGFP中的F64L和S65T突变，但该变体还具有四个额外的点突变，可改善折叠、37 摄氏度下的表达和亮度。最近，绿色光谱区域新增了一个超级文件夹 GFP，它比 EGFP 或 Emerald 更亮、更耐酸，并且具有相似的光稳定性。因此，超级文件夹变体应该是与哺乳动物蛋白质融合和构建 FRET 生物传感器的绝佳候选者，尤其是那些证明标准 GFP 衍生物存在折叠问题的生物传感器。另一个明亮的荧光报告基因，可能是一个很好的 FRET 候选者，被称为Azami Green，已从石珊瑚Galaxeidae 中分离出来，并证明在哺乳动物细胞系中表达过程中迅速成熟。此外，还报道了通过定点和随机诱变结合青色蛋白文库筛选获得的两个明亮的单体 GFP 报告基因。来自克拉维利亚珊瑚属，mWasabi是蓝色荧光蛋白的潜在替代绿色发射 FRET 伙伴，因为在 400 纳米和更低的吸收率可以忽略不计，蓝色变体经常被激发。新的绿色报告基因已上市（Allele Biotechnology），对于结合长斯托克斯位移蛋白（如T-Sapphire）的双色成像以及与靶向蛋白融合的定位标签特别有用。TagCFP 的衍生物，命名为TagGFP，是一种明亮的单体绿色变体，在 482纳米处具有最大吸收，在505纳米处具有发射。TagGFP仅比EGFP略亮，可用作 Evrogen的克隆载体和融合标签，但尚未在文献报告中进行彻底表征。
黄色荧光蛋白（525纳米到555纳米）是迄今为止开发的最通用的基因编码探针之一，应该提供作为 FRET 配对中供体和受体的候选物。被称为Citrine和Venus的变体目前是该光谱类别中最有用的蛋白质（见表1），但都不是商业上可获得的。另一种以诞生石Topaz命名的变体可从 Invitrogen 获得，并已用于融合标签定位、细胞内信号传导和 FRET 研究。Evrogen “Tag”商业系列定位报告蛋白TagYFP的新成员是单体水母（Aequorea macrodactyla) 衍生物的亮度略低于 EYFP，但光稳定性高一个数量级。与其合作伙伴类似，TagYFP（发射峰值在 524 纳米）尚未在文献中表征，但可以作为哺乳动物克隆载体或融合标签购买。
在导致 CyPet 生成的同一荧光激活细胞分选研究中（上文讨论过），还获得了进化优化的互补 FRET 受体，称为YPet。其在FRET（熟练后命名Ÿ ˚F P为Ë NERGY ŧransfer)，YPet 是迄今为止开发的最亮的黄色变体，并表现出合理的光稳定性。YPet 提供的对酸性环境的抵抗力优于 Venus 和其他 YFP 衍生物，这将增强该探针在针对酸性细胞器的生物传感器组合中的实用性。然而，尽管优化的 CyPet-YPet 组合应该是开发新 FRET 生物传感器的首选起点，但对于 YPet 性能提高的起源仍存在严重怀疑，这可能仅仅是由于增强的二聚化及其共同进化合作伙伴，CyPet。同样，CyPet 和 YPet 在用于定位实验、双分子互补分析和其他应用的融合标签中的适用性尚未确定。两种蛋白质都以弱二聚体形式存在于溶液中，水母变种（尽管这显然破坏了它们在 FRET 中的优势）。
橙色荧光蛋白，所有这些都是从珊瑚礁物种中分离出来的，有可能在各种 FRET 成像场景中有用。也许其中最通用的是单体 Kusabira Orange，这种蛋白质最初是从蘑菇珊瑚Fungia concinna（在日语中称为Kusabira-Ishi）。Kusabira Orange（缩写为 mKO）的单体版本是通过定点和随机诱变引入 20 多个突变来创建的。单体（可从 MBL International 商业获得）表现出与四聚体相似的光谱特性，具有与 EGFP 相似的亮度值，但对酸性环境比其母体更敏感。然而，该报告基因的光稳定性是所有光谱类别中最好的蛋白质之一，使 mKO 成为长期成像实验的绝佳选择。此外，发射光谱剖面与青色荧光蛋白充分分离，以提高结合 mKO 的生物传感器中的 FRET 效率，并且该探针可用于结合青色、绿色、黄色和红色探针的多色研究。
图10中说明的是ECFP（图 10(a)）、EGFP（图 10(b)）、EYFP（图 10(c)）和 mOrange（图 10(d)）的光谱图，每个都充当 FRET mPlum 的供体，mPlum 是一种发射远红光的荧光蛋白受体。随着供体的发射光谱分布向更长的波长（从青色到橙色），光谱重叠（填充灰色区域）和计算的 Förster 距离（R(0)) 相应增加。类似地，激发和发射串扰（分别为红色和蓝色阴影区域）也随着供体和受体发射峰之间的波长间隔减小而增加。请注意，ECFP 和 mPlum 在激发光谱中仅表现出有限程度的重叠，而在发射光谱中几乎没有重叠。相比之下，当 mOrange 与 mPlum 配对时，激发和发射串扰都很高。随着荧光蛋白调色板的不断扩展，研究人员应该可以轻松获得广泛的新 FRET 对。
的mRFP1衍生物，魔橙，是稍微明亮比MKO，但具有小于10％的耐光性，因而严重损害其对于需要反复成像实验应用。然而，mOrange 仍然是橙色光谱类中最亮的蛋白质之一，并且仍然是强度比长期光稳定性更重要的绝佳选择。此外，与发绿光的 T-Sapphire 相结合，mOrange 是 CFP-YFP 蛋白的合适替代品，作为 FRET 对生成更长波长的生物传感器，并且可以与其他光谱区域的蛋白质结合进行多色研究。mOrange 的改进版本（命名为mOrange2) 具有显着提高的光稳定性。最近引入了一种名为TagRFP 的明亮的新单体橙色蛋白作为定位和 FRET 研究的候选物，并且可能被证明在大量生物传感器结构中是有效的。任何光谱类别中最亮的荧光蛋白是二聚体番茄(dTomato)的串联版本，这是一种橙色衍生物，是原始水果蛋白之一。番茄蛋白包含来自 GFP 的N - 和C上的第一个和最后七个氨基酸- termini 努力增加对融合蛋白的耐受性，减少定位中的潜在伪影，并提高其在 FRET 生物传感器中使用的可能性。串联二聚体版本（实际上是单体）是通过将 dTomato 的两个副本从头到尾与 23 个氨基酸的接头融合而产生的。由于双生色团的存在，产生的tdTomato非常明亮，并具有出色的光稳定性。使用这种蛋白质的主要缺点是尺寸较大（是单体蛋白质的两倍），这可能会干扰某些生物聚合物中的融合蛋白包装。
长期以来，使用 FRET 生物传感器和融合技术进行活细胞和整个动物成像的目标一直是寻找理想的发红光荧光蛋白，这主要是由于在多色成像实验中需要该光谱区域中的探针，以及更长的激发波长产生更少的光毒性，并且可以更深入地探测生物组织。迄今为止，已经报道了广泛的潜在有用的红色探针（在 590 纳米到 650 纳米的发射），其中许多仍然受到其起源物种赋予的一定程度的强制性四级结构的影响。与水母蛋白质不同，珊瑚礁蛋白质的大多数天然和基因工程变体在 37 摄氏度时非常有效地成熟。广泛的诱变研究工作，包括新引入的方法，已成功应用于寻找黄色、橙色、红色和远红色荧光蛋白变体，这些变体进一步降低了这些潜在有效的生物探针自结合的趋势，同时将发射最大值推向更长的波长。结果是改进的单体蛋白质具有更高的消光系数、量子产率和光稳定性，尽管尚未通过所有标准优化单一变体。
红色mFruit蛋白mApple、mCherry和mStrawberry（发射峰值分别为592、610和 596 纳米）的亮度水平为EGFP的50%到110%，但mApple和mCherry 的光稳定性远高于mStrawberry，并且替代 mRFP1 进行长期成像实验的最佳探针选择。通过迭代体细胞超突变进一步扩展 mFruit 蛋白质光谱类产生了两种新的荧光蛋白，其发射波长最大值为 625 和 649 纳米，代表了第一个真正的远红基因工程探针。这对中最有潜力的探针被命名为mPlum，其亮度值相当有限（EGFP 10%），但具有出色的光稳定性。这种单体探针应与在青色、绿色、黄色和橙色区域发射的变体结合使用，用于多色成像实验，并作为生物传感器 FRET 与绿色和黄色蛋白质（如翡翠和黄水晶）配合使用（参见图10）。已经从珊瑚礁生物体中分离出另外几种显示出不同程度前景的红色荧光蛋白。将位点特异性和随机诱变应用于TurboRFP变体，然后筛选显示远红色荧光的突变，产生了一种名为Katushka的二聚体蛋白（发射最大值为635 纳米）。尽管只有EGFP的三分之二亮度，但 Katushka 在光谱窗口中表现出任何荧光蛋白的最高亮度水平，包括 650 至800 纳米，该区域对于深层组织成像很重要。将四种主要的 Katushka 突变引入TagRFP产生了一种名为mKate的单体远红蛋白，它具有相似的光谱特征。据报道，mKate 的光稳定性非常出色，蛋白质显示出与mCherry相似的亮度，这使其成为光谱远红色部分定位和 FRET 实验的绝佳候选者。
尽管在将荧光调色板扩展到光谱的橙色、红色和远红色区域方面取得了重大进展，但青色和黄色水母衍生物仍然是开发有用生物传感器的最有用的配对方案。这种不可预见的差异发生是因为大多数橙色和红色珊瑚衍生蛋白质表现出相对较宽的吸收光谱曲线，具有延伸到紫色和青色区域的长激发尾，从而产生直接受体激发。另一个可能起作用的因素是融合荧光蛋白伴侣的相对成熟率。在大多数情况下，来自水母的变种蛋白质比从珊瑚礁获得的蛋白质成熟得更快，因此未成熟的受体可能导致许多珊瑚衍生蛋白质表现出的敏感发射差。此外，橙色和红色蛋白质的宽吸收光谱，加上单体版本的量子产率降低，可能使它们难以用于FRET。荧光蛋白 FRET 实验设计的未来成功将集中在匹配配对蛋白质的成熟率等因素上。
尽管基于无处不在的荧光蛋白家族的FRET实验为揭示活细胞系统中的分子动力学提供了巨大的潜力，但目前还没有完美的FRET对。CFP和YFP的优化版本仍然为一般用途提供最有效的配对，尽管更好的组合可能会出现。同样，没有完美的技术来测量 FRET，尽管上述方法都具有可以根据所研究的特定实验情况加以利用的优势。随着更多优化的荧光蛋白的出现，包括可能适合作为 GFP 或 YFP 供体受体的亮红色变体，使用荧光蛋白的 FRET 应该对活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用研究变得更加有用。正如讨论的那样，当前红色荧光蛋白调色板的宽吸收光谱，加上单体版本的较低量子产率，使这些候选物难以用于 FRET。然而，荧光蛋白改进的快速步伐令人乐观地认为这些蛋白质将在不久的将来可用，并将有助于进一步彻底改变这种阐明细胞内生化机制的新方法。
