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双光子激发显微镜（也称为非线性、多光子或双光子激光扫描显微镜）是共聚焦和去卷积显微镜的替代品，可为三维成像提供独特的优势。特别是，双光子激发在活细胞成像方面表现出色，尤其是在完整组织内，如脑切片、胚胎、整个器官，甚至整个动物。荧光显微镜的有效灵敏度，尤其是厚标本，通常受到离焦眩光的限制。这种限制在共聚焦中大大减少显微镜，通过使用共焦针孔来拒绝离焦背景荧光并产生薄（小于 1 微米）、不模糊的光学切片。或者，去卷积显微镜使用传统显微镜使用光学系统的测量点扩散函数以数字方式重建图像。
本文介绍了多光子激发的基本物理原理，并讨论了其在激光扫描显微镜中使用的优势和局限性。强调了实际考虑，以说明该技术的实用性并展示其一些物理限制。最后，讨论了双光子激发显微镜的选定应用，以说明该技术如何允许进行其他方式无法进行的实验。
在进行任何光学切片实验之前，应仔细考虑选择最适合为所研究问题提供答案的技术。对于相对较厚样品的荧光显微镜，双光子激发通常提供最合适的解决方案，尽管互补的三维荧光显微镜方法具有特殊的好处，使它们在某些实验中具有优势。
共聚焦显微镜利用针孔从检测中排除离焦背景荧光。因此，该技术允许对更厚的组织进行三维切片。然而，激发光会产生荧光，从而在整个样本中产生光漂白和光毒性，即使信号仅从焦平面内收集。这种大的激发体积会导致显着的光漂白和光毒性问题，尤其是在活标本中。此外，共聚焦显微镜的穿透深度受到整个光束路径中激发能量的吸收以及激发和发射光子的样本散射的限制。
去卷积技术通常为散焦背景相对较低的标本或整体信号水平较低的标本提供最佳解决方案。由于去卷积方法采用传统的宽视野显微镜进行图像采集，因此激发强度通常保持在较低水平。因此，去卷积对于活细胞的单层成像通常是有效的。然而，重要的是要认识到，许多所谓的反卷积方法只是不生成定量数据的非线性数据过滤器。只有真正的约束迭代反卷积技术产生可用于进一步分析的定量数据。然而，由于离焦背景和光散射增加，在宽场荧光显微镜上进行的去卷积对厚样品的渗透有限。此外，由于繁重的计算要求，反卷积图像无法在实验过程中提供即时反馈。
正如本文进一步讨论的那样，双光子激发提供了在焦点平面上方和下方没有吸收（这会导致光漂白和光毒性）的三维光学切片。因此，与共聚焦显微镜相比，该技术提供了更高的深度穿透，并且对活体标本的光毒性较小。因此，双光子激发显微镜优先于其他技术用于需要深入穿透活组织或完整动物标本的实验，并且可以从各种制造商处获得交钥匙系统，包括尼康A1 MP+/A1R MP+. 然而，由于控制双光子激发的光物理学不同于传统的荧光激发，某些荧光团的双光子激发偶尔会观察到有害影响，这反过来限制了这种方法在薄样品中进行光学切片的适用性。
双光子激发是量子光学中一个相对古老的理论概念。它首先由 Maria Göppert-Mayer 在她的博士论文中提出，并在大约三十年后，即激光发明后不久进行了实验观察。因此，存在大量易于理解的理论和实验背景。双光子激发现象源于在单个量化事件中同时吸收两个光子。由于光子的能量与其波长成反比，因此两个被吸收的光子的波长必须约为单光子激发所需的波长的两倍。例如，如果两个光子同时到达荧光团，通常吸收紫外光（约 350 纳米波长）的荧光团也可以被近红外光（约 700 纳米波长）的两个光子激发（见图 1）。在这种情况下，“同时”意味着在大约 10 × E(-18) 秒的间隔内。
由于双光子激发依赖于同时吸收，因此产生的荧光发射随激发强度的平方而变化。激发和发射之间的这种二次关系带来了许多与双光子激发显微镜相关的显着优势（下面更详细地讨论）。为了产生大量的双光子吸收事件（其中两个光子同时与荧光团相互作用），光子密度必须大约是产生相同数量的单光子吸收所需的一百万倍。结果是需要极高的激光功率来产生显着的双光子激发荧光。通过聚焦锁模（脉冲）激光器可以轻松实现该功率水平，其中脉冲峰值期间的功率足够高以产生显着的双光子激发，而平均激光功率仍然相当低。在这种情况下，产生发射的双光子激发态与进行常规荧光实验时填充的单线态相同。因此，双光子激发后的荧光发射与正常单光子激发产生的发射完全相同。图 1 显示了一个 Jablonski 图，说明了单个（紫外线）光子的吸收（图 1（a））和两个近红外光子的同时吸收（图 1（b）），产生了相同的激发态。产生发射的双光子激发态与进行常规荧光实验时填充的单线态相同。因此，双光子激发后的荧光发射与正常单光子激发产生的发射完全相同。图 1 显示了一个 Jablonski 图，说明了单个（紫外线）光子的吸收（图 1（a））和两个近红外光子的同时吸收（图 1（b）），产生了相同的激发态。产生发射的双光子激发态与进行常规荧光实验时填充的单线态相同。因此，双光子激发后的荧光发射与正常单光子激发中产生的发射完全相同。图 1 显示了一个 Jablonski 图，说明了单个（紫外线）光子的吸收（图 1（a））和两个近红外光子的同时吸收（图 1（b）），产生了相同的激发态。
另一个密切相关的非线性光学过程，三光子激发，也可能被证明对生物实验有益。三光子激发的发生方式与双光子过程大致相同，只是三个光子必须同时与荧光团相互作用才能产生发射。由于荧光吸收的量子力学特性，三光子激发所需的光子密度仅比两光子吸收所需的密度大十倍左右（而不是一百万倍）。因此，三光子激发可以被认为是一些实验的有吸引力的选择。举个例子，红外激光（波长约为 1050 纳米）可以对吸收紫外线的荧光团（350 纳米）产生三光子激发，同时对绿色吸收荧光团（525 纳米）产生双光子激发。此外，可以采用三光子激发将有用的成像区域扩展到深紫外（例如，使用 720 纳米光激发通常在 240 纳米紫外光处吸收的荧光团）。这是对传统显微镜能力的宝贵增强，因为低于大约 300 纳米的紫外线波长对于常规显微镜光学系统来说是非常有问题的。高阶非线性效应，例如四光子吸收，已经通过实验证明，尽管这些现象不太可能立即应用于生物研究。
在激光扫描显微镜中使用双光子激发的显着优势源于吸收取决于激发强度的平方的基本物理原理。实际上，双光子激发是通过显微镜光学系统聚焦单个脉冲激光产生的。随着激光束被聚焦，光子变得更加拥挤（它们的空间密度增加），并且其中两个同时与单个荧光团相互作用的概率增加。激光焦点是光子上光子密集到足以产生大量双光子激发的唯一位置。图 2 图示说明了在显微镜焦点处的含荧光团样品中双光子激发的产生。在焦点之上，光子密度不足以让两个光子同时在单个荧光团的吸收截面内通过。然而，在焦点处，光子间隔非常近，以至于可以在单个荧光团的吸收截面内同时找到其中的两个。
在实践中，双光子激发显微镜不仅可以通过在空间上集中光子（通过显微镜光学器件的聚焦），而且还可以通过时间集中（通过利用来自锁模激光器的脉冲）来实现。组合效应允许为双光子激发产生必要的光子强度，但 10 × E(-5) 的脉冲占空比（脉冲持续时间除以脉冲之间的时间）将平均输入功率限制为小于 10毫瓦，仅比共聚焦显微镜中使用的略大。尽管激光脉冲持续时间被认为是超短的，通常在大约 100 飞秒和 1 皮秒之间（10 × E(-13) 到 10 × E(-12) 秒），与大约 10 × E 的荧光团吸收事件相比(-18) 秒，
双光子激发对照明焦点的狭窄定位是该技术优于共聚焦显微镜的最显着优势的基础。在共焦显微镜中，虽然在整个样本照明体积中激发了荧光，但只有源自焦平面的信号才能通过共焦针孔，从而可以收集无背景数据。相比之下，双光子激发仅在焦平面上产生荧光，并且由于不产生背景荧光，因此不需要针孔。共焦和双光子激发显微镜的激发区域之间的这种巨大差异可以通过对每种方法的光漂白模式进行成像来证明。图 3 说明了在荧光素染色的 Formvar 薄膜中重复扫描单个 xy 平面（图像平面）在 xz 方向上出现的光漂白图案。共聚焦系统的激光激发焦平面上方和下方的荧光团（如图 3(a) 中的白色框所示），导致在这些广泛区域中观察到的漂白。相比之下，双光子激发仅发生在焦平面，因此漂白仅限于该区域（图 3（b））。
双光子显微技术中激发的局部化产生了许多有利的效果。也许最重要的是，双光子激发显微镜的三维分辨率与理想共聚焦显微镜的分辨率相同。此外，由于离焦标本区域没有吸收，更多的激发光穿过标本到达焦平面。结果是大大增加了样品穿透力，通常是共聚焦显微镜的两到三倍。利用双光子激发（如图 3 所示）的另一个好处是最大限度地减少光漂白和光损伤 - 活细胞和组织的荧光显微镜中的两个最严重的限制。虽然与光相互作用引起的细胞损伤知之甚少，但很明显，减少光损伤将导致被研究的生物标本的生存能力延长。来自实践经验的证据是，单独的红色激发光不会影响细胞活力，并且可能观察到的大部分光损伤与双光子吸收有关，因此仅限于焦平面。
两光子激发显微镜不需要针孔来获得三维分辨率，从而可以灵活地检测几何形状。双光子激发的去扫描和非去扫描检测的几何结构如图 4 所示。在去扫描的几何结构中，发射光（以蓝色表示）沿着与激发光相同的路径返回，在通过之前撞击扫描镜通过共焦针孔到达检测器（图 4（a））。在共聚焦显微镜中，必须利用这种几何形状来消除对离焦发射的检测。非消扫描光束路径提供更多配置选择：共轭平面检测器布置在物镜之后立即放置一个二向色镜（图 4（b），并将发射的光通过转移透镜反射到放置在与物镜后孔共轭的平面上的检测器；发射的光可以由外部检测器收集直接来自样品，不通过物镜（图 4(c)；或发射光被二向色反射器转向到中间像平面的电荷耦合器件 (CCD) 相机，以获得宽场图像（图 4（d））后一种几何结构适用于采用双光子激发的快速数据采集系统。
尽管可以对双光子激发使用去扫描检测，但为了充分利用这种技术的深度穿透，建议使用非去扫描替代方案（外部检测器）。非退扫描路径能够收集更多散射光子，需要更少的光学元件，例如镜子和透镜，并减少路径长度，空气中的灰尘颗粒会干扰荧光信号。因此，使用具有双光子激发的非去扫描检测方法可显着提高收集效率，并且对于最大深度渗透到活组织中是必不可少的。
如上所述，双光子激发显微镜最强大的优势是它能够在较厚的样品中提供更深的光学切片，而其他方法则不然。因此，重要的是了解实现这种增加的穿透深度的方法。存在三种物理机制，它们共同作用以提高厚样品的有效性：
没有离焦吸收允许更多的激发光光子达到所需的样品水平。
在双光子激发中使用的红光和红外光比颜色更蓝（波长更短）的光经历更少的散射。
与共焦显微镜相比，光散射对双光子显微镜的影响较小。
虽然结合使用，但分开考虑这三种机制是有用的。双光子显微镜允许更大比例的激发照明到达焦平面，因为在聚光区域之外不满足吸收条件，并且消除了离焦吸收。在共聚焦显微镜中，激发光子被沿激发光路遇到的任何荧光团吸收。结果是到达焦平面的光子更少，从而减少了产生的信号。如果样品始终包含荧光团，则这种效果会变得更加明显，如图 5 中所示的图像所示。该图中显示的罗丹明染色聚合物薄膜样品本身是非散射的，
在图 5 中，xz 扫描的顶部离物镜最近，并且荧光强度被绘制为每次 xz 扫描的样本深度（z 距离）的函数。对于单光子激发机制（共聚焦显微镜，图 5（a）），随着激发光到达更深的焦平面时被越来越多地吸收，强度随着穿透深度呈现稳定下降。与此形成鲜明对比的是，双光子吸收仅发生在焦平面中，而物镜和焦平面之间的光路中的荧光团不会吸收激发光。因此，所有激发能量都到达焦平面，从而在整个样品深度（本例中为聚合物）中保持荧光信号恒定。
有助于在较厚的标本中双光子激发性能的第二种机制是，在双光子激发显微镜中使用的“更红”的激发光比在常规激发中使用的“更蓝”的激发光受到更少的样品散射。生物组织可以被认为是具有可变折射率的非均匀介质。通过这种介质传播的光在各个方向上多次散射。在荧光显微镜中，入射到样品上的激发光在到达焦平面之前会发生不同程度的散射，产生的荧光在通过样品返回检测器时也会发生散射。这两种散射效应结合起来减少了收集到的荧光信号。
由于生物样本中具有可变特性的材料的不规则分布，因此无法计算或精确建模散射行为。然而，瑞利散射的最简单近似值提供了对此类系统中散射光分数的最小估计。在这种情况下，散射光的量与光波长的四次方成反比。在估计中应用这种关系，预计 488 纳米（一个光子）光会比 800 纳米（两个光子）光经历大约七倍的散射。因此，这种散射差异有助于增加可以到达焦平面的双光子激发激光的数量，并进一步增加穿透样品的深度。在实践中，观察到的与组织结构相互作用的散射总是大于瑞利近似预测的，但较长（较红）的波长总是比较短（较蓝）的波长散射得少。在荧光显微镜技术的检测阶段，无论是利用单光子激发还是双光子激发产生的，发射的荧光都是相同的，因此，荧光发射的散射对两种方法的影响都是一样的。
上面列出的第三个因素是，激发光或荧光的任何散射都不会像在共聚焦显微镜中那样显着影响双光子技术中的信号收集。这种差异可以通过考虑双光子激发显微镜中图像形成的物理学来解释。虽然缺乏离焦吸收和散射差异都有助于增加到达完整组织内部焦平面的激发光，但第三个因素实际上会增加双光子激发的图像对比度。对此有贡献的物理方面如图 6 所示。
在共聚焦显微镜（参见图 6）中，激发光（蓝色）聚焦到样品（a）中，来自该焦点的荧光（绿色）被物镜捕获，干净地穿过针孔，然后到达检测器 (b)。这种荧光是所需的信号，但其中一些信号在返回样品时会发生散射 (c)。这种散射的荧光不会通过针孔，因此会丢失并且未被检测到。这些损失大大降低了检测到的荧光信号。当激发光穿过样品时，它可能在到达焦点之前被吸收 (d) 或散射 (e)。如果它被吸收，它会产生荧光。由于这种荧光不是从焦斑中产生的，它不会通过针孔，因此不能被有效地检测到。然而，一小部分离焦荧光可以散射到针孔中，然后被检测到。这种荧光会在整个图像中产生大致恒定的背景雾，如图 7 和 8 中的示例所示。这种雾会降低图像的动态范围，从而降低图像对比度。同样，散射激发可以产生荧光（e），这种荧光也可以产生背景雾（f）。
在双光子激发方法（也参考图 6）中，激发光子（红色）可以像在共焦系统中一样被散射（g）。然而，两个光子同时散射到同一样品位置的概率基本上为零，因此，在双光子激发中不会产生困扰厚样品共焦成像的背景雾。此外，由于上面讨论的前两个因素，更大比例的激发光到达焦平面（h 和 i）：焦外吸收减少和较长波长双光子激发光的散射减少.重要的是，产生的荧光（绿色），即使被散射，被光电倍增管 (j) 检测到的可能性也会增加，因为没有针孔来阻挡它 (k)。
图7中显示的图像（用荧光素染色的鲨鱼脉络丛）提供了共聚焦和双光子显微镜成像质量的比较。这些图像是在样品表面下方 80 微米处收集的，这是使用共聚焦显微镜从该样品获得足够图像对比度的最大深度。尽管两种方法可以轻松匹配最亮特征的信号电平，但由于背景雾的存在，共焦图像（图 7（a））中的整体图像对比度大大降低。相比之下，双光子激发图像（图 7（b））表现出出色的强度对比度。由于荧光散射在厚生物标本中很重要，因此即使使用“开放”针孔，使用去扫描检测也不足以获得双光子激发的优势。
为了充分发挥潜力，需要一种非去扫描检测方案（参见图 4），其中荧光不会像在共聚焦显微镜中那样通过扫描系统返回，以提高荧光收集效率。使用图 7 中所示的相同鲨鱼标本，图 8 显示了采用去扫描（针孔“开放”）和非去扫描检测方法的图像的比较。对于每个检测几何结构，使用相同的成像光学组件，包括二色反射镜、屏障过滤器和光电倍增管检测器。最初，使用解扫描检测在接近最大值的深度（140 微米）处对样本进行成像，该深度提供了一些强度对比度（图 8（a））。保持所有设置固定，并切换到非解扫描检测，收集了图 8(b) 中显示的图像。很明显，这张未去扫描的图像在许多区域完全饱和（最大显示亮度），证明了这种检测几何结构改进了信号收集。由于两种情况下的激发条件相同，因此信号强度的 8 倍增加可以完全归因于散射荧光光子的收集，这是由非反扫描检测几何结构实现的。为了获得全范围的非饱和图像（如图 8(c) 所示），光电倍增管电压从 1000 伏降低到 750 伏，这意味着可以利用非去扫描检测装置更深入地扫描该样本。事实上，该样本中可接受成像的穿透深度不受组织的限制，而是受物镜工作距离的限制。
用双光子激发获得的图像分辨率并不比在对准良好的共聚焦显微镜中获得的图像分辨率好。使用更长的激发波长（例如红色或红外线，而不是紫外线或蓝色）虽然是双光子激发的一个有利方面，但实际上会产生更大的分辨率光斑。如果在共聚焦显微镜中无法解析生物结构，则在双光子激发激光扫描显微镜中同样无法解析。虽然在这些技术方面经验丰富的显微镜专家很好理解这一点，但生物医学研究界的潜在用户通常认为双光子激发的优势包括提高分辨率。
如前所述，由于三个因素的综合作用，双光子激发对于厚样品成像更有效：缺乏离焦吸收允许更多的激发光到达预期的样品区域；红色激发光散射少；与共聚焦显微镜相比，荧光散射对双光子显微镜的影响较小。当使用长工作距离光学器件和非去扫描检测配置时，穿透深度和图像质量通常受到有效标记组织能力的限制。在更深的地方将荧光标记引入组织变得越来越困难。利用绿色荧光蛋白（GFP）表达的实验) 在转基因动物中可能会增强体内双光子激发成像。转基因动物在开发改进技术以使用双光子激发对活体动物的特定器官和蛋白质进行荧光标记以进行检测方面提供了巨大的希望。某些组织特征可能会对厚标本成像的穿透深度施加额外限制，尤其是在色素沉着的组织（如肝脏）或高度散射的组织（如皮肤）中尤其令人担忧。
一般来说，与传统的共聚焦显微镜相比，双光子激发技术对薄样品的成像不一定显着受益。其原因是焦平面中可能发生的光漂白略有增加（与传统技术相比，厚样品中的总光漂白大大减少，如图 3 所示）。然而，有些应用对双光子激发是有益的，即使对于薄制剂也是如此；一个例子是紫外激发荧光团如 NADH 的成像（进一步讨论如下）。在这样的实验中，紫外线造成的损害比双光子诱导的光漂白更为显着。在评估双光子激发的潜在好处时，首先在共聚焦显微镜上进行实验总是值得的。一旦知道共焦对所需成像施加了哪些限制，就可以轻松确定使用双光子激发是否有利于完成实验。
双光子吸收光谱与相应的单光子光谱几乎没有相似之处是很常见的。迄今为止获得的经验表明，当双光子激发照明的波长是荧光团单光子吸收峰的两倍时，大多数荧光团的功能都相当好。由于本讨论范围之外的物理化学原因，具有非对称化学结构的荧光团往往比对称的荧光团更接近于这种关系。例如，荧光蛋白（CFP、GFP、YFP, 和其他) 的特点是非对称荧光团, 并在其单光子激发波长的两倍处强烈吸收。然而，为了充分利用双光子激发显微镜的能力，必须测量荧光团的吸收光谱。这在技术上比测量传统的单光子吸收光谱更具挑战性，而且这种信息的来源很少。随着这种显微技术的使用增加，双光子吸收光谱可能会变得更加普遍。
双光子激发的另一个功能是在样品的焦点区域引发光化学反应。各种实验上有用的化学过程涉及紫外光诱导的反应，可以用双光子激发代替。一类反应，染料脱笼可以在组织的单个细胞中使用双光子激发，通过光化学诱导非荧光分子变为荧光。类似地，生物刺激剂或抑制剂可以通过相同的激发过程解笼。双光子激发解笼锁的各种潜在方法尚未完全开发，主要是由于光反应动力学的限制，其范围可以从几毫秒到几秒。因此，目标化合物可能会在其激发时间和它变得活跃之间的样品内扩散数微米。尽管存在这种困难，但该技术可能在许多有趣的生物学应用中很有价值，其中一些将在以下部分进行讨论。
双光子激发显微镜的仪器要求与共聚焦显微镜的仪器要求几乎相同，但激光激发源有很大不同。目前的双光子激发显微镜通常使用两种类型的超快锁模激光系统：Ti:sapphire激光器和Nd:YLF激光。虽然这些系统可以由普通电源插座供电并且不需要水冷，但它们比共聚焦显微镜中使用的小型风冷激光器要贵得多。Ti:sapphire 激光器（700 到 1100 纳米）的波长可调性使其比单波长 Nd:YLF 激光器（1047 纳米）具有更大的通用性，目前 Ti-sapphire 激光器的商业型号覆盖了 720 到 900 的波长范围纳米通过容易实现的计算机控制。在可预见的未来，激光照明系统的易用性和多功能性的进一步改进可能会继续。
激发含荧光团样品所需的激光功率具有最佳极限值。随着激光功率的增加，荧光强度增加，直至达到荧光团饱和点. 饱和状态发生在激光功率足以使大部分荧光分子以激发态而不是基态存在时（对于单光子激发，样品的功率水平约为 1 毫瓦，50 毫瓦）在样品上进行双光子激发）。在更高的功率水平下，额外的光子根本无法激发更多的荧光分子。超过饱和点的任何激发能量增加都有助于增加光损伤和光漂白。必须评估每个实验装置在光束扫描过程中造成的损伤，重要的是要认识到微不足道的细胞活力测试（例如酯酶活性或染料排除）并不总是准确反映细胞光损伤。对于许多实验，更严格的功能测试可能会提供更多信息。例如，在最近发表的一项研究中，仓鼠胚胎的生存能力通过其持续发育得到证实，而在另一项研究中，胰岛的生存能力通过维持正常的葡萄糖刺激 NAD(P)H 反应得到证实。
最近发表的实验结果的一些例子说明了双光子激发比共焦成像具有优势的常见情况。虽然本次讨论中没有提供实验的细节，但重点集中在双光子激发的好处上，因为它降低了光毒性、增加了组织成像深度以及启动局部光化学的能力。
正如最近一项利用仓鼠胚胎发育延时成像的研究所证明的那样，双光子激发显微镜通常比共聚焦显微镜具有更低的光毒性。在这个例子中，使用重要线粒体染料的双光子激发能够连续监测胚胎的发育超过 10 小时。相比之下，当采用共聚焦方法时，正常的胚胎发育在仅几分钟的共聚焦激光照射后就停止了。研究人员得出结论，双光子激发激光的较长波长（1047 纳米）允许胚胎存活时间大大增加。同样的研究人员还利用双光子激发显微镜来评估无机磷酸盐对仓鼠胚胎发育的影响。在这个实验中，活的仓鼠胚胎在不同量的无机磷酸盐中培养，并使用双光子激发显微镜在培养 6 小时后对其线粒体分布进行成像。在进一步胚胎发育后，在培养 27 和 51 小时后进行形态学评估。这些研究提供了明确的证据，表明双光子照明不会干扰仓鼠胚胎的发育，而它们会被平行共聚焦成像损坏。
两项已发表的研究利用双光子激发的无毒特性对人体皮肤进行体内成像。一项研究涉及使用 730 至 960 纳米的激发波长，对从不同深度（0 至 50 和 100 至 150 微米）的皮肤收集的自体荧光信号进行详细光谱分析。当与反射光共聚焦显微镜结合使用时，技术的组合无损地提供来自同一皮肤区域的皮肤层的详细反射光和自发荧光图像。
双光子激发能够避免紫外线照射对在该光谱范围内激活的荧光物质的光毒性效应。该特征特别有利于对天然存在的还原吡啶核苷酸 [ NAD(P)H] 作为细胞呼吸的指标。由于 NAD(P)H 的吸收截面小，量子产率低，并且吸收紫外线，因此难以激发和测量，并有可能造成相当大的光损伤。NAD(P)H 成像已被用于研究培养的部分分化的 L6 肌管细胞的病理生理学。细胞 NAD(P)H 图像中显示的自发荧光模式主要反映线粒体中的 NADH 作为弥散细胞质信号上的点状区域。在分化的细胞中，当线粒体柱位于肌纤维条纹之间时，荧光很明显，并且荧光的增加伴随着葡萄糖浓度的增加。该研究证明了葡萄糖代谢的同质性，
文献中报道的另一个研究领域是 NAD(P)H 的定量双光子成像，以胰岛内的单个 β 细胞为中心，胰岛是一种由约 1000 个细胞组成的准球形微器官. 扩展整体核苷酸成像，双光子技术的空间分辨率允许分离细胞质和线粒体 NAD(P)H 信号。图 9 显示了完整胰岛内 β 细胞 NAD(P)H 自发荧光的典型图像，显示来自细胞质和线粒体的信号，后者更亮且有点点状。单细胞轮廓是可见的，细胞核也是可见的，两者都是黑色的。通过分离胰岛β细胞这些区域的细胞质和线粒体信号，
当前葡萄糖刺激胰岛素分泌模型 ( GSIS)) 表明进一步沿着信号转导途径的代谢物应该刺激类似的信号事件级联并导致胰岛素分泌，尽管丙酮酸增强 GSIS 但不会单独诱导胰岛素分泌。该研究提到利用 NAD(P)H 的双光子激发成像以及细胞质和线粒体信号的分离，以证明 β 细胞代谢丙酮酸，尽管是短暂的。这种短暂的线粒体反应表明目前正在研究两种不同的模型：线粒体-丙酮酸转运或三羧酸循环在丙酮酸晚期代谢过程中受到抑制。利用双光子激发技术，以生化方法无法获得的采样间隔重复扫描活胰岛以产生数据。
由于双光子激发显微镜使用锁模（脉冲）激光器，因此可以很容易地扩展到与荧光寿命成像的结合。基于纳秒荧光衰减时间的图像提供与荧光团浓度无关的信息。一个潜在的应用是利用荧光寿命成像来获得荧光共振能量转移 ( FRET)的明确值) 两个探针之间的效率。在最近的一项调查中，使用 NAD(P)H 的双光子激发寿命成像显微镜来定量确定不同亚细胞区室中的 NAD(P)H 浓度。细胞核中的游离 NADH 水平调节辅助抑制因子 CtBP，它是细胞周期调节和转化转录途径的参与者。通过结合使用 NAD(P)H 和寿命成像的双光子激发显微镜，证明细胞核中的游离 NADH 水平与 CtBP 结合的半数最大浓度密切对应。
双光子激发技术可以与其他广泛的生物物理技术结合使用，包括荧光相关光谱 ( FCS ) 和光漂白后荧光恢复 ( FRAP)）。这些技术中的每一种通常都使用固定的单光子（连续波）激光器。FCS 技术确定了荧光探针在固定照明光束的焦点体积内的占据数量和扩散特性，并已成功应用于分子相互作用和扩散研究。通过在激光焦点区域控制荧光漂白，然后观察荧光恢复，FRAP 已被用于研究荧光分子的宏观扩散。FCS 和 FRAP 技术已被广泛用于研究荧光探针在培养细胞膜上的扩散特性。迄今为止，这些技术的复杂性限制了它们在体外的应用系统和细胞培养模型。当需要从任一方法获得定量数据时，双光子激发显微镜中明确定义的激发体积是一个优势。此外，FCS 和 FRAP 在研究厚活组织中的双分子动力学方面具有很高的价值，采用双光子而不是单光子激发。
用双光子激发可获得的深度样本穿透允许在体内成像，尽管在对活体动物成像时必须克服许多挑战。体内荧光成像可以通过双光子激发通过活体动物皮肤中的手术开口或通过放置在动物身上的盖玻片“窗口”来实现。与活体动物一起工作的另一个复杂因素是荧光标记标本的相当大的困难。一项已发表的研究报告使用 Ca2+ 指示剂对活体小鼠的神经元进行特定标记，允许使用双光子激发技术监测神经功能。在转基因动物中表达绿色荧光蛋白 (GFP) 以对特定器官和蛋白质进行荧光标记，这肯定会导致双光子激发在体内成像中的其他应用。由于活体标本在成像过程中可能会移动，目前大多数体内研究都是对麻醉动物进行的，并且成像率增加以限制这种移动的影响。未来的技术进步，例如用于直接连接到活体标本的双光子显微镜的小型化，很可能允许对自由移动的动物进行体内成像。
几位研究人员采用大量加载钙指示剂结合双光子激发显微镜来绘制小鼠脑切片中神经元的微电路图。他们的方法是触发信号神经元，然后映射在连接所谓的“跟随者”神经元时启动的钙信号。确定新皮质由许多精确组织的微电路组成。追随者属于几个可区分的解剖学类别，它们的位置是确定的，可以在不同的动物中进行预测。
双光子激发显微镜的一个潜在的非常强大的应用是笼状化合物的三维分辨光释放，称为解笼锁.例如，钙的定量双光子激发解笼锁是许多技术的重点。如前所述，光化学解笼锁反应通常非常缓慢（从几毫秒到几秒不等），这使得目标化合物在激发和激活之间的时间内可以在样品内扩散数微米。扩散在某些应用中不存在问题，例如通过解笼膜非永久性荧光分子“标记”细胞。一组研究人员成功地使用双光子激发光释放结合共聚焦显微镜来追踪海胆胚胎细胞谱系的发育。
其他研究人员已成功地利用反应速度更快的解笼锁分子来研究解笼锁兴奋剂，他们采用双光子激发来绘制神经元受体图。这些研究通过利用双光子激发的三维特性来控制成像介质中未笼化刺激物的位置，扩展了光化学脱笼的过程。当兴奋剂在细胞膜附近被打开时，它会刺激附近的受体，并通过细胞膜片钳检测到这一过程。在这种类型的成像中，测量的是兴奋反应而不是发射的光子映射图像。作为一个具体的例子，MNI-谷氨酸的解笼锁结合用于信号检测的全细胞钳成功地用于绘制谷氨酸受体图。标本为培养的海马神经元和海马CA1锥体神经元的急性切片制剂。进行这项研究的研究人员能够获得出色的横向和轴向半高全宽（FWHM) 直径分别为 0.6 和 1.4 毫米，在切片制备中，表明快速解笼锁反应时间。他们进一步确定，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 (AMPA) 型谷氨酸受体在蘑菇刺中丰富，并且这些受体的分布与刺的几何形状高度相关。
双光子激发显微镜为厚标本（例如完整组织）中的活细胞的动态成像提供了极大的实用性。该技术使许多无法进行传统成像或无法提供所需信息的实验成为可能。依靠锁模（脉冲）激光照明在焦点处产生足够的光子密度，双光子激发仅发生在焦平面。局部激发的好处是发射仅限于狭窄的焦点区域，无需使用针孔即可提供切片能力。此外，有限的激发区域降低了光毒性，因为光损伤主要局限于焦点体积。
虽然双光子激发显微镜不能产生比共聚焦显微镜分辨率更高的图像，但它确实可以增加对厚样品的穿透深度。更大的穿透深度是可能的，部分原因是双光子显微镜的开放式针孔几何形状、激发光的离焦吸收和减少的激发光散射（由于其波长）。为了充分利用穿透深度，必须使用非反扫描检测几何结构，这会显着提高散射荧光光子的收集效率。双光子激发的优势已明确确立，并允许进行使用共聚焦显微镜无法进行的实验。
