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迄今为止发现的广泛的荧光蛋白和衍生物用途广泛，已成功应用于从微生物学到系统生理学的几乎所有生物学科。事实证明，这些独特的探针作为报告基因非常有用，可用于培养细胞和整个动物的基因表达研究。在活细胞中，荧光蛋白最常用于跟踪蛋白质、细胞器和其他细胞区室的定位和动态，以及细胞内蛋白质运输的示踪剂。荧光蛋白的定量成像可以通过多种技术轻松完成，包括宽视场、共聚焦和多光子显微镜，为揭示细胞结构和功能的复杂性提供了一个独特的窗口。
荧光蛋白的复杂光谱和物理特性会影响任何定量测量的准确性和实用性。这些特性中的许多特性，例如摩尔消光系数、量子产率、光漂白率和 pH 对光谱曲线的依赖性，都可以在体外使用纯化的蛋白质轻松测量。然而，其他重要和实验上的关键特性，包括发色团形成（成熟）的时间过程和体内蛋白质降解率，更难以确定。对于典型实验，应选择最亮、最稳定的单体荧光蛋白衍生物，以减少在要求不高的应用中应用复杂背景和光漂白校正的必要性。
在选择用于成像实验的荧光蛋白载体时，应认真考虑来自水母和珊瑚礁的市售增强变体及其衍生物。它们具有青色 (ECFP)、绿色 (EGFP) 和黄色 (EYFP) 光谱区域的荧光分布，并且现已引入了新的单体红色荧光蛋白。图 1中说明的是使用各种商业上可用的荧光蛋白融合载体获得的一系列图像，这些载体针对几个不同的亚细胞位置。图 1中描绘的探针的荧光发射光谱图覆盖近 180 纳米的带宽，最大范围为440 至 618 纳米。这些探针是最亮、最稳定的荧光蛋白变体，允许在低光照水平下进行成像，从而最大限度地减少光漂白（下文讨论）和光毒性等问题。许多荧光蛋白变体（包括 EGFP、ECFP和EYFP）可以在足够高的浓度下形成二聚体，在进行定量高级荧光技术（例如共振能量转移(FRET)）时，这种伪影会扰乱膜结构或导致错误假设.
除了基因工程荧光蛋白的内在亮度外，表达水平是从融合构建体产生显着明亮的细胞内信号时要考虑的另一个因素。使用带有强启动子的载体来提高转录水平和应用合适的密码子来优化翻译对于提高融合蛋白的表达水平至关重要，从而提高整体信号水平。当细胞自发荧光使得难以区分荧光融合蛋白发射与背景荧光时，这一点尤为重要。
可以应用多种技术来提高含有荧光蛋白融合产物的细胞的表达水平和亮度。向培养基中加入丁酸钠（约 1 至 5 毫摩尔）将增加表达融合蛋白的稳定细胞系中的整体基因表达水平。此外，使用瞬时转染的细胞也是一个有吸引力的选择，因为它们通常比稳定转染的细胞表现出更高的表达水平。最后，增加克隆载体中串联荧光蛋白序列（双或三）的数量是增加融合蛋白亮度水平的替代方法。
由于优化了哺乳动物细胞中翻译的密码子使用和定点诱变以提高在较高温度下发色团成熟的效率，因此大多数市售荧光蛋白载体都具有改进的性能。对于要求更高的成像应用，其中荧光蛋白的表达或目标丰度水平较低，探针的内在特性可能是一个限制因素。因此，有必要充分了解荧光蛋白的内在特性，并应用必要的控制来最大限度地减少活细胞实验中探针成像过程中可能出现的伪影。
与类似条件下的传统合成荧光团（如荧光素和罗丹明）相比，荧光蛋白中的光子诱导的发色团破坏（一种称为光漂白的现象）的速度和幅度通常会降低。这种对光漂白的抵抗被认为是由于荧光蛋白发色团受到紧密堆积的周围β- can蛋白结构的保护而产生的。无论如何，在定量成像实验中严格执行漂白控制措施仍然很重要。
荧光蛋白中的光漂白率可以通过获取标记控制细胞上的延时图像系列来确定，然后定量测量发射强度的逐渐损失，这通常表现为指数衰减。然后可以采用光漂白荧光损失曲线（如图2 所示）来校正成像实验。虽然通常不是一个重大问题，但如果光漂白成为活细胞成像时的限制因素，则可以将抗褪色试剂如抗坏血酸、Trolox 或氧化酶（氧气和自由基清除剂）添加到培养基中。
尽管光漂白通常是荧光显微镜中的最终限制因素，但许多荧光蛋白衍生物的光漂白速率相对较慢（见图2）。另一个限制因素是荧光团饱和，这不会发生在广角显微镜中，但对于激光扫描共聚焦仪器来说可能是一个重大问题，有时会使用足够高的激发强度以达到饱和。当所有可用分子始终处于激发态时，就会发生荧光团饱和，因此激发光的增加不会导致荧光发射的相应增加。在这种情况下，由于非线性，校准荧光信号非常困难，这个问题只能通过降低激光输入功率来纠正。
细胞内环境条件，尤其是pH值和其他单价和二价阳离子的高局部浓度，可以改变荧光蛋白衍生物的亮度水平。例如，野生型绿色荧光蛋白 (wtGFP) 从pH 5 到 pH 10显示出相对均匀的亮度，而增强的绿色和黄色荧光蛋白都在酸性 pH 水平下被淬灭，当靶向细胞器（溶酶体）或具有低 pH 内部的亚细胞区室。其他衍生物，如ECFP和DsRedFP，对低pH不太敏感。然而，许多荧光蛋白融合产物将定位在接近生理 pH 值的区域，这应该不会严重影响荧光强度。
在荧光蛋白固有的其他物理参数中，可能会显着改变定量成像（但无法在体外准确测量），发色团折叠动力学或开启时间可能会产生最严重的后果。维多利亚水母的衍生物水母（和大多数珊瑚礁）荧光蛋白需要氧化才能形成生色团，但氧气不容易穿透三肽荧光团周围的致密蛋白质结构。因此，蛋白质表达和荧光出现之间可能会出现相当大的延迟（通常超过几个小时）。不幸的是，通常不容易区分由于荧光蛋白表达（理想测量）引起的延迟和由于发色团形成缓慢（伪影）引起的延迟。相反的过程，成熟荧光蛋白的体内降解，也很难监测，但压倒性的证据表明，这些探针中的许多都非常稳定。
宽场、共焦和多光子荧光显微镜，无论是直立式还是倒置式，都是观察活细胞和组织中荧光蛋白的理想仪器。所需的照明源范围从用于宽场的汞和氙弧放电灯，到用于多光子显微镜的共焦和锁模脉冲激光器中的气体和半导体连续波激光器（见表1）。绿色荧光蛋白及其变体很容易用汞灯的亮蓝色光谱线或氩离子或氪氩气体激光器发射的 488 纳米谱线成像。此外，正在引入大量新的固态激光器，它们在可见光谱的许多部分（包括紫色和蓝色区域）中产生线条。光谱分布转移到蓝色、红色和近红外波长的荧光蛋白变体通常使用氙灯或金属卤化物灯以及与激发最大值紧密匹配的激光发射线更有效地成像。无论光源如何，荧光蛋白成像的主要问题是有足够的激发光可以获得合理的信号水平。
除了下面讨论的物镜外，荧光蛋白成像的两个最关键的组件是发射过滤器和检测器。在宽视野显微镜中，激发滤光片、二色镜和发射滤光片组合成一个光学块，激发滤光片的带宽由用于激发的光源决定。例如，汞灯需要在 450 到 490 纳米之间具有高透射率的激发滤光片带通以对绿色荧光蛋白成像。青色和蓝色变体需要较短的波长带，而黄色、橙色和红色衍生物则需要较长的波长带。激光线的带宽只有几纳米，因此通常不需要使用干涉滤光片选择波长。二色镜截止波长应该通过有效地反射前者和透射后者来清楚地分离激发和发射光谱轮廓。选择合适的二色镜几乎没有误差。另一方面，发射滤波器可以根据实验要求进行微调，以通过从 20 到数百纳米不等的带宽。这些过滤器在确定传递到检测器的荧光发射强度水平方面是最灵活的。编入可以微调以通过从20到数百纳米不等的带宽，具体取决于实验要求。这些过滤器在确定传递到检测器的荧光发射强度水平方面是最灵活的。编入可以微调以通过从20到数百纳米不等的带宽，具体取决于实验要求。这些过滤器在确定传递到检测器的荧光发射强度水平方面是最灵活的。编入表1是用于荧光蛋白定量成像的建议过滤器组合列表。这些滤波器建议仅包括带通发射滤波器（实际上忽略了长通滤波器建议），应仅将其视为设计实验的起点。
几个流行的绿色荧光蛋白滤光片组的性能可以通过比较来自相同视场的图像来判断，这些图像用每个单独的滤光片组合捕获，如图3所示。该标本是胚胎大鼠胸主动脉成肌细胞的贴壁培养物，该细胞用含有融合蛋白的载体转染，该融合蛋白将人细胞质β-肌动蛋白基因与红移（增强）绿色荧光蛋白变体EGFP 相结合。融合蛋白的表达表现在它并入生长的肌动蛋白丝中，从而使用荧光显微镜和适当的滤光片组合实现亚细胞结构的可视化（见图3））。胸主动脉成肌细胞也用 MitoTracker Red CMXRos（线粒体；红色荧光）和Hoechst 33258（细胞核中的 DNA；蓝色荧光）染色。注意带有活塞和 Endow 带通滤波器的蓝色和红色荧光团没有信号（图 3(a) 和 3(b)），但是带有 Endow 长通滤波器的线粒体探针产生了显着程度的橙红色荧光(图3(c))。带宽为 30 纳米 (活塞)、50 纳米 (Endow BP) 和超过100 纳米 (Endow LP)的带通和长通 GFP 滤波器组合也可用于各种由光激发的合成荧光团可见光谱的蓝色部分。
虽然如果强度足够高，通常可以使用标准荧光素滤光片组合对绿色荧光蛋白进行成像，但使用专门的滤光片（见图 3）将能够微调信号收集以包括或排除其他成分。用于 GFP 定量成像的专用过滤器组合应使用窄带通发射过滤器，以最大限度地提高荧光蛋白与背景信号（通常为自发荧光）的对比。使用窄带通发射滤光片，尖锐的绿蓝色荧光蛋白信号（图 3（a））优先通过绿黄色（图 3（b））或绿橙色（图 3（c））的检测器) 细胞自发荧光和其他发射更长波长的荧光团的背景。自发荧光通常表现出非常宽的光谱，而绿色荧光蛋白发射光谱相对较窄。原则上，应选择最窄的带通滤波器，以增加荧光蛋白发射对其他背景信号的辨别力。然而，滤波器的最佳通带将受到所需的信噪比和检测器特性的限制，如下所述。应为每种成像情况确定最佳带通。此外，虽然增强型绿色荧光蛋白如图 3 所示，选择的特定过滤器组合不仅取决于信号强度，还取决于被成像的蛋白质变体的荧光发射光谱图（见表1）。
蓝色荧光蛋白变体可以使用标准DAPI在宽场荧光显微镜下成像具有 330 至 380 纳米范围内的激发滤光片剖面的滤光片组合、截止波长为 385 至 400 纳米的二色镜以及带通或长通发射滤光片（420 纳米及以上）。然而，这些滤光片组合对青色荧光蛋白不是很有用，它使用滤光片产生最佳图像，该滤光片设计用于对用蓝紫光（400 到 440 纳米）激发的荧光团成像。用于青色荧光蛋白的二色镜应具有 455 到 460 纳米之间的截止波长，以及传输 460 到 500 纳米之间光的发射滤光片。许多标准的蓝紫色长通和带通滤波器组合可成功用于对青色荧光蛋白衍生物（包括 Cerulean 和 AmCyan1）成像，
虽然黄色荧光蛋白衍生物（包括增强型、金星和黄水晶）通常使用为FITC和绿色荧光蛋白设计的滤光片组合产生可接受的图像，但当滤光片参数针对这些显示的稍长吸收和发射波长分布进行优化时，可以获得更好的结果探针。黄色荧光蛋白的理想组合是带通区域跨度为490 到 510 纳米的激发滤光片、截止波长为 515 纳米的二色镜以及通过波长在520到550 纳米之间的发射滤光片。截止波长为515 纳米或稍高的长通发射滤光片也将产生带有黄色荧光蛋白的良好图像。
橙色和红色荧光蛋白的光谱分布跨越了很大的波长区域，不幸的是，没有一种过滤器组合非常适合对这些荧光团的整个集合进行成像。DsRed 荧光蛋白变体通常可以使用标准TRITC进行可视化过滤器组合，以及许多设计用于在可见光谱绿色区域吸收的其他探针的长通和带通组。橙色荧光蛋白（mOrange 和 CoralHue Orange）应使用 500 至 540 纳米区域的激发滤光片进行成像，再加上截止波长约为 550 纳米的二色镜和波长在 560 至 600 纳米之间的带通发射滤光片。几种标准的绿色激发滤光片组合大致符合要求，但必须设计专门的滤光片参数，以便对此类特定荧光团进行最佳成像。较长波长的红色荧光蛋白（mCherry、HcRed1、mRaspberry 和 mPlum）通常可以使用黄色激发滤光片组合进行成像。例如，尼康Y-2E/C组具有 540 至 580 纳米的带通激发滤光片、截止波长为 595 纳米的二色镜和捕获 600 至 660 纳米之间光子的带通发射滤光片，可用于许多这些红色探针。显微镜和滤光片制造商提供定制滤光片组合。
在激光扫描共聚焦显微镜中，激发波长的选择仅限于每个仪器的可用激光线的狭窄范围。典型的显微镜，例如尼康A1 HD25/A1R HD25，配备的激光器跨越紫色（405 和 440 纳米）、蓝色（457、477和 488 纳米）、绿色（514 和 543 纳米）、橙黄色（568 和 594 纳米）和红色（633 和 647 纳米）光谱区域。这些激发波长可有效用于激发表1 中列出的大多数荧光蛋白，取决于适当的二色镜和发射滤光片的可用性。多光子显微镜还可用于在这些仪器特有的受限空间体积中对大多数流行的荧光蛋白衍生物进行成像。
| 蛋白质 （缩写） | 激发 激光 (nm) | 激发 滤光片 CWL/BW(nm) | 二色镜(nm) | 屏障 滤波器 CWL/BW(nm) | 相对 亮度 （EGFP%） |
|---|---|---|---|---|---|
| 绿色荧光蛋白（wt） | 氩气 (488) | 450/50 | 480LP | 510/50 | 48 |
| 绿色荧光蛋白 | |||||
| EGFP | 氩气 (488) | 470/40 | 495LP | 515/30 | 100 |
| 翠绿 | 氩气 (488) | 470/40 | 495LP | 515/30 | 116 |
| 阿扎米绿 | 氩气 (488) | 470/40 | 495LP | 520/30 | 121 |
| CopGFP | 氩气 (488) | 470/40 | 490LP | 510/30 | 125 |
| AcGFP | 氩气 (488) | 470/40 | 490LP | 510/30 | 82 |
| ZsGreen | 氩气 (488) | 470/30 | 495LP | 520/40 | 117 |
| 蓝色荧光蛋白 | |||||
| EBFP | 二极管 (405) | 375/50 | 405LP | 445/50 | 27 |
| 宝蓝 | 二极管 (405) | 400/50 | 460LP | 515/50 | 55 |
| T-宝蓝 | 二极管 (405) | 400/50 | 460LP | 515/50 | 79 |
| 青色荧光蛋白 | |||||
| AmCyan1 | 氩气 (457) | 440/40 | 470LP | 500/40 | 31 |
| ECFP | 二极管 (440) | 435/40 | 460LP | 495/50 | 39 |
| 蔚蓝 | 二极管 (440) | 435/40 | 460LP | 500/50 | 79 |
| 珊瑚青色 | 氩气 (488) | 450/50 | 480LP | 505/35 | 73 |
| 黄色荧光蛋白 | |||||
| EYFP | 氩气 (514) | 490/40 | 515LP | 540/30 | 151 |
| PhiYFP | 氩气 (514) | 500/45 | 525LP | 555/40 | 155 |
| 柠檬色 | 氩气 (514) | 500/25 | 515LP | 545/40 | 174 |
| 金色 | 氩气 (514) | 495/35 | 515LP | 545/40 | 156 |
| ZsYellow1 | 氦氖 (543) | 500/45 | 525LP | 555/40 | 25 |
| 橙色和红色荧光蛋白 | |||||
| 珊瑚橙 | 氦氖 (543) | 525/40 | 550LP | 580/40 | 92 |
| mOrange | 氦氖 (543) | 525/40 | 550LP | 585/50 | 146 |
| DsRed | 氦氖 (543) | 540/45 | 570LP | 600/50 | 176 |
| DsRed2 | 氦氖 (543) | 540/50 | 570LP | 600/40 | 72 |
| DsRed-Express | 氦氖 (543) | 540/45 | 570LP | 600/50 | 58 |
| mTangerine | Kr-Ar (568) | 545/40 | 570LP | 600/40 | 34 |
| mStrawberry | Kr-Ar (568) | 550/50 | 580LP | 615/50 | 78 |
| AsRed2 | Kr-Ar (568) | 540/40 | 575LP | 620/60 | 8 |
| mRFP1 | 氦氖 (594) | 560/55 | 590LP | 630/60 | 37 |
| mCherry | 氦氖 (594) | 560/55 | 590LP | 630/60 | 47 |
| HcRed1 | 氦氖 (594) | 560/60 | 595LP | 630/50 | 1 |
| mRaspberry | 氦氖 (594) | 570/60 | 605LP | 645/60 | 38 |
| HcRed-Tandem | 氦氖 (594) | 570/70 | 610LP | 650/60 | 19 |
| mPlum | 氦氖 (594) | 570/60 | 605LP | 650/60 | 12 |
| 光学荧光笔荧光蛋白；(N)=原生 (P)=光转换 | |||||
| PA-GFP (N) | 二极管 (405) | 400/60 | 465LP | 530/50 | 8 |
| PA-GFP (P) | 氩气(488) | 480/40 | 505LP | 535/40 | 41 |
| PS-CFP (N) | 二极管 (405) | 395/50 | 430LP | 470/60 | 16 |
| PS-CFP (P) | 氩气(488) | 470/50 | 500LP | 530/40 | 15 |
| PS-CFP2 (N) | 二极管 (405) | 395/50 | 430LP | 470/60 | 26 |
| PS-CFP2 (P) | 氩气(488) | 470/50 | 500LP | 530/40 | 32 |
| Kaede (N) | 氩气(488) | 485/40 | 510LP | 535/30 | 259 |
| Kaede (P) | Kr-Ar(568) | 540/50 | 570LP | 590/30 | 59 |
| mEosFP (N) | 氩气(488) | 490/30 | 510LP | 535/30 | 128 |
| mEosFP (P) | Kr-Ar(568) | 540/50 | 570LP | 600/40 | 68 |
| Kindling (N/P) | Kr-Ar(568) | 560/50 | 590LP | 625/50 | 12 |
| Dronpa (P) | 氩气(488) | 485/30 | 505LP | 530/30 | 240 |
列于表1是几种最流行和潜在有用的荧光蛋白变体所显示的特性的汇编。除了每种荧光蛋白的通用名称和/或首字母缩略词外，还列出了最佳激光波长线以及激发和发射滤波器带宽（和中心波长）的建议起点。表中还包括相对亮度和推荐的二色镜参数。计算出的亮度值来自摩尔消光系数和量子产率的乘积，除以EGFP的值。此列表是根据科学和商业文献资源创建的，并非旨在全面，
定量显微镜通常首选的检测器是光电倍增管和冷却电荷耦合器件(CCD) 相机系统。由于光电倍增管不是成像设备，因此必须对样品进行光栅扫描（如激光共聚焦显微镜中使用的）以逐点构建图像。或者，CCD 图像传感器包含光电二极管阵列，可产生尺寸仅受单个二极管元件数量限制的二维图像。除了信噪比考虑之外，检测器系统最重要的方面是线性度和偏移。光电倍增管和 CCD 阵列都是高度线性的，高端相机系统可以调整偏移（通常称为黑电平)，就像所有光电倍增管配置一样。在实践中，当样品中没有荧光发射时，应将偏移量调整为读数为零。如果系统中存在非零偏移，则无法获得图像之间的定量差异。
在激光扫描共聚焦显微镜中，与冷却的CCD相机系统相比，光电倍增管通常表现出较低的动态范围（8 位或 256 个灰度级）和检测效率（15% 到 30%）。尽管希望提高检测效率，但 8 位动态范围通常不是问题，因为每次扫描通常每像素收集不到 255个光子（即使对于染色良好的标本）。尽管如此，光电倍增管响应的出色线性、背景抑制特性以及适当激光器的可用性使共聚焦显微镜成为荧光蛋白定量成像的绝佳选择。多光子显微镜可消除远离焦平面的光损伤，避免色差，
定义定量成像效用的最重要参数是信噪比（缩写为S/N）。在现代商业荧光显微镜中，该值通常来自散粒噪声，散粒噪声定义为探测器收集的光子数的平方根。检测系统中可能会引入一些系统误差，但与CCD和光电倍增管的散粒噪声相比，它们通常很小。例如，如果探测器每个像素收集 100 个光子，则噪声预计为 10（100的平方根），或信号的10%。同样，对于每像素10,000 个光子的信号，噪声 (100) 仅为信号的 1%。这些示例反映了荧光显微镜中的典型信号水平，检测电子设备中引入的误差通常小于1%。乍一看，很明显，最高的信噪比是最理想的，
在大多数情况下，荧光蛋白标记与其融合的细胞靶蛋白之间存在相等的比例。因此，可以使用已知浓度的重组荧光蛋白作为参考标准，从总细胞荧光中计算出细胞中荧光分子的浓度。增强型绿色荧光蛋白通常用于此目的，因为它具有光稳定性和亮度。为了计算细胞内 EGFP 浓度，可以将已知数量的标记物嵌入聚丙烯酰胺板中，并与表达融合构建体的细胞一起成像。还开发了参考标准，用于通过将精确数量的组氨酸标记的 EGFP 连接到包被的珠子上来计算膜结合蛋白的密度。
尽管在为成像实验设计协议时它可能是最重要的考虑因素，但通常很少考虑目标的选择。客观参数对于确定可用的空间分辨率和为图像传感器收集的光量至关重要。通常，物镜由三个主要标准定义：数值孔径、放大率和光学校正程度。尽管普遍认为相反，但最不重要的参数是放大率。放大率仅决定物体在目镜或探测器中出现的大小，但对图像的分辨率（可以清晰观察到的最小细节）或亮度（将收集的荧光信号量）没有影响。
分辨率和亮度是数值孔径的函数，数值孔径是选择物镜的最重要标准。数值孔径定义了进入物镜前透镜的光量，因此应选择尽可能高的数值孔径来对荧光蛋白进行定量成像。图像收集（任何形式）背后的一般原则很简单：随着信噪比的增加，图像质量也会随之提高。这个概念对于使用激光扫描共聚焦显微镜系统进行图像采集尤其重要，在这种系统中，收集的光子数量通常非常少（通常每个像素只有几个）。因此，在优化光子收集策略时，仔细选择合适的目标特别有用。
在示出的图4是数值孔径重要性关于分辨率和图像亮度的原理的一个例子。该标本是粘附的人骨肉瘤上皮细胞（U2OS系）的培养物，该细胞用质粒载体转染，该载体编码增强的绿色荧光蛋白，该蛋白融合到来自人细胞色素 C 氧化酶亚基 VIII 的线粒体靶向核苷酸序列。在转染的哺乳动物宿主中质粒的转录和翻译后，线粒体定位信号负责荧光蛋白嵌合体在整个细胞线粒体网络中的运输和分布。随后可以使用荧光显微镜观察管状线粒体。
在图4中，使用具有相同光学校正（平面萤石）和数值孔径 (1.3) 的物镜对相同的视场进行成像，但放大倍数为40到100 倍。尽管用于收集图 4 图像的像素数量和检测器条件相同，但当通过 40x 物镜成像时，线粒体最亮（图 4（a））。相比之下，更高放大倍数的60 倍和100 倍物镜（图 4(b) 和 4(c)，分别）产生逐渐变暗的图像，100x 图像几乎无法分辨。该物镜仍可用于对样品进行成像，但必须显着增加检测器增益，从而导致信噪比恶化和普遍较差的图像。请注意，由于相同的数值孔径值，物镜的分辨率（图 4（d）至 4（f））具有可比性。
从图 4 中的数据中收集到的主要概念之一是在选择荧光蛋白（和其他荧光团，就此而言）成像的目标时避免过度放大。使用 40 倍物镜在共聚焦显微镜上收集图像期间简单地增加数字放大（变焦），可生成与 100 倍透镜大小相同的图像（图 4（d）和 4（f）））。两个物镜的分辨率相同，因为它们具有相同的数值孔径值。关于放大率相对不重要的论点不应被视为表明使用 60 倍或 100 倍物镜没有好处。因此，物镜的最佳选择通常取决于仪器的光学配置以及特定实验的特定要求。
如果可能，应仔细考虑并避免使用高度校正的物镜（复消色差）。随着校正程度的增加（例如，从萤石到复消色差），包含在物镜中的典型光学校正用于色差和场平度需要额外的透镜元件。每增加一个镜头，通过物镜的总光透射率就会降低，这进一步限制了能够到达检测器的信号量。尽管多色成像等特殊应用需要高度校正的镜头，但更难获得高信噪比（从而获得卓越质量的图像），尤其是在对某些较暗的荧光蛋白进行成像时，例如HcRed 或 ECFP。总之，40x 萤石物镜（数值孔径为 1.3）更适合对含有单一荧光蛋白的样品进行成像，但对于多色实验（两种或多种荧光蛋白），颜色校正需要一个复消色差物镜。
开发全彩色荧光蛋白调色板的主要原因是同时跟踪两个或多个细胞事件。鉴于目前可用的荧光蛋白变体数量不断增加（见表1)，最佳配对可能并不明显。在同时使用两个或多个这些独特的探针设计活细胞成像实验时，荧光蛋白及其色移遗传变异表现出的广泛激发和发射光谱曲线通常需要专门考虑。主要关注的是潜在的渗透伪影（实际上，荧光从一个探针溢出到为第二个探针配置的通道中），这是由荧光蛋白组合通常表现出的显着程度的光谱重叠引起的。
渗漏（通常称为交叉或串扰) 可以在不同荧光蛋白的激发和发射过程中发生。在检查荧光探针的特性时，会在光谱的蓝色端（较短波长）发生渗漏，而在较长波长（红色端）发射时，伪影最为明显。例如，绿色荧光蛋白通常可以通过红色发射滤光片检测到，但红色荧光蛋白通常不使用绿色滤光片成像。出于这个原因，荧光蛋白的多色成像应该首先成像最长波长的发射探针，使用不会交叉到较短波长探针的激发波长。例如，要使用氩离子激光对同一细胞中的 EYFP 和EGFP进行成像，首先会使用514 纳米谱线收集EYFP信号，这超出了EGFP的吸收曲线，并且使用530-550 纳米带通滤波器收集了发射。发射滤波器带宽不是特别重要，因为只有 EYFP 被激发。使用来自477 纳米氩离子激光线的第二次扫描以及非常窄的490 至500 纳米带通发射滤波器对EGFP进行成像。该过滤器应正确定位以排除EYFP荧光，并允许从EGFP中特定捕获信号（一项有点乏味的任务）。虽然488 纳米氩离子激光器的峰值更接近 EGFP 的激发最大值，但它太靠近发射滤波器带通区域，导致反射激光干扰图像采集的可能性。发射滤波器带宽不是特别重要，因为只有 EYFP 被激发。使用来自477纳米氩离子激光线的第二次扫描以及非常窄的 490 至 500 纳米带通发射滤波器对EGFP进行成像。该过滤器应正确定位以排除 EYFP 荧光，并允许从 EGFP 中特定捕获信号（一项有点乏味的任务）。虽然 488 纳米氩离子激光器的峰值更接近 EGFP 的激发最大值，但它太靠近发射滤波器带通区域，导致反射激光干扰图像采集的可能性。发射滤波器带宽不是特别重要，因为只有 EYFP 被激发。使用来自 477 纳米氩离子激光线的第二次扫描以及非常窄的 490 至 500 纳米带通发射滤波器对 EGFP 进行成像。该过滤器应正确定位以排除 EYFP 荧光，并允许从EGFP中特定捕获信号（一项有点乏味的任务）。虽然488 纳米氩离子激光器的峰值更接近EGFP的激发最大值，但它太靠近发射滤波器带通区域，导致反射激光干扰图像采集的可能性。使用来自 477 纳米氩离子激光线的第二次扫描以及非常窄的 490 至 500 纳米带通发射滤波器对 EGFP 进行成像。该过滤器应正确定位以排除 EYFP 荧光，并允许从 EGFP 中特定捕获信号（一项有点乏味的任务）。虽然 488 纳米氩离子激光器的峰值更接近 EGFP 的激发最大值，但它太靠近发射滤波器带通区域，导致反射激光干扰图像采集的可能性。使用来自 477 纳米氩离子激光线的第二次扫描以及非常窄的 490 至 500 纳米带通发射滤波器对 EGFP 进行成像。该过滤器应正确定位以排除 EYFP 荧光，并允许从 EGFP 中特定捕获信号（一项有点乏味的任务）。虽然 488 纳米氩离子激光器的峰值更接近 EGFP 的激发最大值，但它太靠近发射滤波器带通区域，导致反射激光干扰图像采集的可能性。
对两种或多种荧光蛋白进行成像时要考虑的一个重要问题是，使用滤光片进行多色成像需要仔细注意，以控制荧光发射到非预期通道中的渗漏。然而，应该注意的是，滤波器带宽的显着限制是以信噪比（因为收集带宽受到严重限制）和由于需要单独的收集策略而导致的时间分辨率为代价的。其次，通常需要专门针对实验的专门光学设计，以实现最佳成像条件。例如，在黄色衍生物存在的情况下收集绿色荧光蛋白变体所需的专用过滤器组合在标准共聚焦显微镜中并不常见。
在示出的图5是一系列与融合到亚细胞定位的目标的两个或更多的荧光蛋白同时转染细胞系捕获的图像的。图 5(a)中显示的 HeLa 细胞用 EYFP（细胞核）、ECFP（高尔基体）和 DsRed2FP（线粒体）标记，这三种探针被用于捕获图像的宽场荧光滤光片组合（尼康 CFP、 YFP HYQ 和 Cy3 HYQ）。用 EGFP（微管蛋白）、ECFP（细胞核）和 DsRed2FP（线粒体）转染并用标准过滤器组合成像的负鼠肾上皮细胞（OK线）如图 5(b) 所示。同样，图 5(c) 中的兔肾细胞（RK-13系）用 EYFP（内质网）和 ECFP（过氧化物酶体）转染，并用尼康 CFP 和 YFP HYQ 滤光片组成像。图5(d)所示的非洲水猫鼬细胞(APM)转染EGFP(微管蛋白)和DsRed2FP(细胞核)，人骨肉瘤细胞(U2OS系；图5(e))用相同的细胞核标记与 ECFP（线粒体）一起探测。最后，图5（f）中显示的幼仓鼠肾细胞（BHK细胞系）用 EGFP（过氧化物酶体）和DsRed2FP（线粒体）转染。图 5中的所有图像均使用宽场荧光显微镜和尼康滤光片组合捕获针对合适的荧光蛋白进行了优化。
尽管最亮的荧光蛋白类别是绿色和黄色（见表 1），但它们的光谱最大值之间仅相隔 20 至 25 纳米的平均值。使用成对的绿色和黄色荧光蛋白进行多色实验是可能的，但过滤器组合之间的渗漏成为一个重大问题。因此，绿色和黄色的组合并不经常一起使用。最流行的双探针组合之一是青色和黄色荧光蛋白（ECFP 和 EYFP，见图 5）。尽管 ECFP 并不比 EBFP 亮多少，但它的使用具有两个优点，即 ECFP 可以用来自氩离子激光器的 457 纳米线有效激发，并且探针不容易光漂白（如图 2 所示））。
将 DsRed 衍生物与绿色或黄色荧光蛋白结合可以产生有用的探针配对，其发射光谱可以很容易地分离。然而，由于成熟率的差异，在选择 DsRed 变体时应谨慎行事。此外，由于 DsRed 及其衍生物在体内形成专性四聚体，它们可能会对所研究的蛋白质系统的生物学产生意想不到的影响（例如聚集或定位到非预期的细胞器）。没有有效的经验法则可用于预测 DsRed 衍生物是否可用作融合标签，并且某些蛋白质可能耐受寡聚化，而其他蛋白质则不能。对于仅使用荧光蛋白的三重标记（图 5(a) 和 5(b)) 青色、黄色（或绿色）和 DsRed 的组合提供了极好的解决方案。
在活细胞成像的背景下使用两种或多种荧光蛋白时，必须考虑几个折衷方案。例如，由于对不同图像采集条件的要求，数据采集速率随着每种颜色的添加而变慢。解决荧光渗漏问题变得更加复杂，尤其是因为荧光蛋白的发射光谱图往往非常广泛（并且经常重叠）。此外，由于流行的荧光蛋白的相对亮度各不相同（表1)，每种颜色可能需要不同的信号积分时间。青色和蓝色荧光蛋白非常暗淡，可能需要更长的收集时间才能使更亮的绿色和黄色荧光蛋白饱和。因此，重要的是平衡实验参数（实际上，快速收集与最佳分离）与荧光蛋白的选择。例如，结合EYFP 和 DsRedFP 是快速高效图像捕获的不错选择，因为这些荧光蛋白可以共享单个激发设置，而将 ECFP与EYFP结合使用可以提供更高程度的光谱分离。
在使用光学荧光笔荧光蛋白设计实验时，应考虑活细胞成像、显微镜配置、载体构建和蛋白质选择等几个重要方面，以优化图像采集参数。这些独特的探针主要用于监测活细胞的动态过程，这通常需要将细胞培养物在显微镜载物台上长时间保持在健康状态。作为载物台插入件制造的各种专业加热成像室可用于显微镜上的长期细胞维护，但研究人员还必须考虑几个基本的辅助要求，例如二氧化碳源、不透光的显微镜外壳和振动隔离。简而言之，
使用传统的宽场荧光显微镜技术可以成功地对几种光学荧光笔荧光蛋白进行成像，但涉及光漂白方法和光活化的严重定量研究通常必须在配备专用激光系统的共聚焦或多光子显微镜上进行。具体来说，PA-GFP、PS-CFP、Kaede、EosFP 和 Dronpa 都需要近紫外或紫光照明来进行光激活或光转换，但需要更长的波长源（蓝色和绿色激发）来成像蛋白质。因此，共聚焦显微镜应配备紫外或紫光激光器，以及发射蓝色和绿色光谱线的可见光激光器。
目前最流行的光学荧光笔激光器配置是 405 纳米二极管、488 纳米氩离子和 543 纳米氦氖，尽管紫外线高能氩、二极管泵浦固态和氦镉激光也可用于光活化（记住紫外线照射可能造成的潜在细胞损伤伪影）。其他有用的成像激光器包括几种新的二极管和氦氖模型以及多光谱氪氩系统。理想情况下，多光子仪器应配备宽带钛蓝宝石激光器，该激光器具有 750 至 1100 纳米波长范围内的可调输出。
在示出的图6是与人类一PS-CFP2荧光蛋白融合产物的光转化的β肌动蛋白使用用于成像和转换一个405纳米二极管激光器，以及用于成像的氩离子488纳米谱线和跟踪光转化的蛋白质。融合构建体质粒载体用于在活细胞成像室中转染负鼠肾（OK线）上皮细胞，以表达标记的丝状肌动蛋白。图 6(a)显示了光转换前的单个细胞，用二极管激光器成像。在大部分肌动蛋白细胞骨架网络周围绘制了一个感兴趣的区域（图 6（b）;红色框），然后用 40% 的激光功率在 405 纳米处照射。当使用二极管和氩离子激光成像时（图 6(b)），光转换的 PS-CFP2 融合蛋白在绿色荧光中清晰可见，与未转换的探针（蓝色）形成对比。10分钟后（图 6(c)），光转化的肌动蛋白已开始结合到感兴趣区域外的细丝中，并且在 30 分钟（图 6（d））时，大部分细胞骨架网络被光学荧光笔标记。
在光转换和光活化过程中，在声光可调滤光片 (AOTF) 的控制下最有效地进行照明的特定区域的描绘，该滤光片可方便地用于定义圆形、椭圆形、矩形或徒手选择，用于照射标本。AOTF 还可用于微调激光功率水平以调节样本的强度，并且能够使用称为高速通道切换或多跟踪的技术顺序扫描样本。这种方法可以连续激发和收集来自几个荧光探针的发射，以避免渗出伪影并更准确地分离发射光谱。
在宽视野显微镜中定义感兴趣的区域提出了更大的挑战。研究级显微镜通常配备可变光圈，可以调整以照亮样品中的选定区域，但精度远低于共焦显微镜 AOTF 系统。宽场仪器还必须配置专门的荧光滤光片组合，以便对几种光学荧光笔蛋白质进行成像。相比之下，共聚焦和多光子仪器比宽场显微镜更适合使用光转换和光活化技术对细胞动力学进行定量分析，因此应该成为这些应用的首选。
生成足够高的荧光信号水平以实现最佳图像采集也是使用光学荧光笔时要考虑的一个重要因素。在这方面，天然和光转化蛋白质种类的吸收摩尔消光系数和荧光量子产率值可用作确定相对亮度水平的衡量标准。例如，Kaede和mEosFP 在可见光谱的绿色（原生）和红色（光转换）区域具有相似的光谱带宽分布。然而，由于较高的消光系数和量子产率，枫的天然绿色形式具有大约两倍于绿色mEosFP 的荧光发射强度或亮度水平。光转换后，两种蛋白质具有相似的亮度水平（见表 1）并产生可比较的图像。
在目前可用的光学荧光蛋白中，Dronpa、Kaede 和 mEosFP 最亮，其次是 PA-GFP，其亮度水平与 Kaede 的光转化物种相似，但明显低于天然蛋白质。市售的 PS-CFP2 变体的亮度约为 Kaede 的二分之一，而点燃和 PS-CFP 蛋白，无论是天然形式还是光转换形式，都是迄今为止最暗的光学荧光笔，仅产生约 25%光转换后的 Kaede 表现出的亮度水平（表 1）。后者的荧光笔在成像过程中表现出显着较低的信噪比，这是在计划研究丰度水平低或需要高成像速度的生物目标时应考虑的因素。
目前可用的一系列荧光蛋白和成像工具使细胞生物学家能够轻松监测活细胞中的蛋白质动力学，继续为蛋白质、细胞器和细胞的行为提供许多新见解。通过这样做，这些非凡的探针开创了细胞生物学的新时代，在这个时代，稳态和动力学显微镜技术均可用于破译生物过程的途径和机制。结合在开发活细胞成像显微镜系统方面取得的快速进步，包括低光级电子倍增 CCD 相机、转盘共聚焦仪器和狭缝扫描显微镜，该平台用于在整个可见光范围内对荧光蛋白和光学荧光笔进行成像。和近实时精度的近红外光谱区域。
