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在设计用于活细胞研究的光学显微镜系统时，主要考虑因素是检测器灵敏度（信噪比）、所需的图像采集速度和样本活力。在处理活细胞时，必须严格避免通常用于记录固定细胞和组织（其中光漂白是主要考虑因素）图像的相对较高的光强度和较长的曝光时间。在几乎所有情况下，活细胞显微镜都代表了实现最佳图像质量和保持细胞健康之间的折衷。与其对时间点进行不必要的过采样并将细胞暴露在过多的光照水平下，不如将实验设置的空间和时间分辨率限制在与调查目标相匹配的范围内。
原则上，理想的活细胞图像采集系统应足够灵敏，可以从弱荧光标本中获取优质图像，同时足够快以记录所有动态过程。此外，该系统将具有足够的分辨率来捕捉最精细的样本细节，并且具有能够准确测量非常微小的强度差异的宽动态范围。不幸的是，优化这些标准中的任何一个都是以牺牲其他标准为代价的。因此，目前不可能设计出适合所有可能调查的通用活细胞成像系统。反而，研究人员必须通过确定最重要的优化参数来做出妥协，同时仍然试图限制那些被认为不太感兴趣的变量所做的牺牲。最后，显微镜配置最终取决于成像模式的要求、在实验过程中保持标本活力的必要性、标记协议的难度级别以及设备的可用性。
在呈现图1是配备有4相机端口，每个端口连接到一个不同的相机设计用于特定成像模式的现代化倒置研究级显微镜。在大多数情况下，这种设计的显微镜要么将 100% 的光引导到一个端口（一次一个端口），要么将光在相机端口和目镜之间以 80:20 的比例分开。对于低光照条件下的关键成像，研究人员应确保将最灵敏的相机连接到接收样本发出的 100% 光的端口。在图 1，连接到底部端口 (a) 的全彩色 CCD 相机接收来自物镜的光而不会从镜子或棱镜反射，在这种情况下，用于对多重标记的荧光样本（或明场模式下的染色样本）进行成像。高性能电子倍增数字 (EMCCD)) 连接到右侧端口的相机 (b) 用于对表现出非常低水平荧光的样本进行成像。对于使用红外照明深入厚组织的微分干涉对比成像，需要具有在 700 到 1000 纳米之间具有高量子效率的传感器的相机（（c）；左侧端口））。最后，对于通过全内反射和其他荧光技术进行高分辨率单色成像，具有相对较小像素（6 微米）的珀耳帖冷却相机（（d）；前端口）是理想的。图 1中所示的配置很昂贵，但对于岩心成像设施来说可能非常通用。
活细胞成像是在光学显微镜中使用广泛的对比度增强成像模式进行的。大多数调查涉及某种形式的荧光显微镜，通常与一种或多种透射光技术相结合。荧光技术包括传统的宽场落射荧光、激光扫描共聚焦、旋转盘和扫场共聚焦、多光子、全内反射 (TIRF)、荧光相关光谱、寿命成像 (FLIM)、光活化和激光捕获。作为一个子集，专门的成像方法，如光谱成像、多色成像、共定位、延时序列、光漂白恢复技术（FRAP、FLIP和FLAP)、共振能量转移 (FRET)、散斑显微镜 (FSM) 和膜片钳通常与一种或多种主要成像模式耦合。荧光技术可以辅以传统的明场模式，包括微分干涉对比 (DIC)、霍夫曼调制对比 (HMC)) 和相差，作为荧光探针定位的确认。在几乎所有情况下，每个显微镜配置都需要许多独特的考虑因素，必须实施这些考虑因素才能成功进行活细胞成像。无论采用何种显微镜和数码相机系统对活细胞和组织进行成像，两个最重要和限制性的因素是保持细胞活力和获得高于背景噪声和自发荧光的最高信号水平。
成像固定细胞和活细胞之间的根本区别之一是前者为研究人员提供了足够的定义图像采集参数的自由度，例如定位合适的视场和确定曝光时间，以及调整电子增益设置、读出率和偏移值。因此，在大多数情况下（使用充分染色的固定标本）可以获得利用相机系统全动态范围的图像，从而产生最佳的信噪比。不幸的是，由于维持细胞活力的严格要求对成像参数施加了限制，活细胞的情况有所不同。对于获得的活细胞图像，通常情况下，样本的强度仅比背景的灰度级高几个灰度级。在这种情况下，最重要的成像考虑因素成为检测器系统的暗电流和读取噪声水平。经济型相机通常具有较高的噪声水平，导致背景图像不太均匀，通常会掩盖来自标本的信号，随着读出速度的增加，这种影响变得更加严重。在几乎所有活细胞成像应用中，检测器的选择对于决定实验的成败至关重要。
数字成像中的四个主要噪声源来自检测器、照明系统、泊松或散粒噪声（由于光子通量的随机性）和杂散光。在大多数情况下，可以通过仔细选择检测器和优化照明条件来系统地降低噪声。几乎每种类型的光子探测器都会在设备记录的每个测量中引入某种形式的噪声。激光扫描和多光子显微镜中使用的光电倍增管会在信号放大系统内产生寄生电子。同样，电荷耦合器件（CCD）) 用于宽场、解卷积、全内反射、旋转盘和扫视场显微镜显示与每个像素相关的背景暗电流。CCD 和光电倍增管设计的改进，包括将器件冷却到非常低的温度，已经将暗电流的贡献降低到非常低的水平。然而，尤其是在 CCD 的情况下，读取每个像素并将模拟信号转换为数字等效信号会产生一个额外的噪声分量，称为读取噪声，这是当前一代数码相机系统（例如尼康的Digital Sight）中的主要噪声伪影（DS)显微镜用相机系列。
图2说明了数字相机灵敏度与活细胞成像中的读出速度和图像质量之间的相互依赖关系。该标本是人类宫颈癌细胞（HeLa系）的培养物，该细胞表达单体 Kusabira Orange (mKO) 荧光蛋白和人类α-微管蛋白的融合，在宽场荧光照明下成像，使用TRITC滤光片组合和灰度相机系统，读取速度为10 或 1.25 兆赫兹。当相机 CCD 关闭时（不接收光），当采用慢读出速度时，背景噪声会显着降低，如图 2(a) 和 2(b) 所示分别以 10 和 1.25 兆赫的速度运行。当可以调整曝光时间以利用整个动态范围时，这种差异不会严重影响相机性能，图 2(c) 和 2(d) 中呈现的图像质量相似就证明了这一点。然而，在低光照条件下，较慢的读出速度（图 2（f））提供了卓越的图像质量。图2(e)和2(f)中的图像是在比图2(c)和2(d)中的那些低大约10倍的光强度下捕获的。将照明水平再降低 5 倍会产生更显着的效果，如图 2(g) 和 2(h) 所示，其中较慢的读出速度提供了勉强可以接受的图像（图 2(h)) 而快速读出模式 (图 2(g)) 没有。
成功的数字成像实验要求样本的空间照明模式在整个视场和连续图像之间保持不变。根据照明源，跨越样本场的光学特性通常相当恒定（称为空间不变性) 在使用卤钨灯的显微镜中。然而，在激光扫描显微镜中，传递到特定像素的照明剂量可能因每次扫描而异。此外，宽场荧光显微镜中通常使用的汞等离子弧放电灯源不能提供均匀的光谱强度，而是在特定波长产生离散的高强度峰。相比之下，氙气灯在整个可见光谱范围内表现出更均匀分布的强度分布，但在紫外线区域（活细胞成像中通常避免的照明范围）中存在缺陷。
组合电弧放电灯（例如金属卤化物灯）具有介于汞和氙之间的混合特性，通过提供从紫外线到红外线的连续光谱以及强烈的水银线。无论光源如何，通过在灯箱和显微镜光学系统照明输入端口之间放置光纤（或液体光导），都可以使照明场几乎均匀。然后可以使用平场算法通过计算校正整个视场的任何剩余照明梯度。需要注意的是，灯输出的时间变化可能与平均值相差 10%，光纤无法校正，需要应用稳定的电源。
光子通量的测量本质上是一个统计过程，具有与信号检测相关的不确定因素。称为泊松或散粒噪声（如上所述），净效应是对于N 个光子的测量，不确定性等于N 的平方根，这也是信噪比。最大化信号光子的数量 ( N) 直接导致信噪比和图像对比度的改善。改善信号的最简单方法是收集更多光子，通常是通过更长的曝光时间或通过增加激发光照水平，但这些措施也会增加光毒性并损害细胞活力。第二个可能更有用的替代方法是提高检测器的灵敏度。
为了克服与活细胞成像相关的低光照水平，可以将现代数字CCD 相机配置为通过实施称为分档的过程（如图 3 和图 8 中所述）来显着提高灵敏度）。在正常读出期间，通过将一行水平像素传输到读取寄存器中来测量 CCD 中的像素，然后依次对其进行分析。在合并图像中，来自图像传感器（例如 2 x 2 或 4 x 4 块）上一组相邻像素的信号（光电子）被组合并分配给读出阵列中的单个像素值。这是通过将多个并行像素行传输到串行读取寄存器（例如，两行用于 2 x 2 合并，四行用于 4 x 4 合并）然后一起读取 2、3 或更多像素组来实现的。在 2 x 2 分箱的情况下，分辨率损失两倍，信号增加四倍，信噪比提高两倍。显然，信号受限应用的改进可能是显着的，尽管以空间分辨率为代价。
图3说明了组合相邻像素对空间分辨率和使用增加的分级级别捕获的数字图像的最终尺寸的影响。该标本是印度麂鹿皮肤成纤维细胞的培养物，表达 mCherry 荧光蛋白（伪红色）和人类β-肌动蛋白的融合，其定位于包含丝状细胞骨架网络的应力纤维中。正如在荧光蛋白标记中通常观察到的那样，显示出卓越定位的细胞通常是那些以非常低的水平表达融合产物的细胞，从而显着降低了可用信号。未启用分箱（图 3(a))，在产生可忽略不计的光毒性和光漂白的曝光时间时，信号太低而无法区分。Binning 2 x 2 和 4 x 4 逐渐增加信号电平，但以空间分辨率为代价（图 3(b) 和 3(c)）。最亮的图像是通过合并 8 x 8 像素（图 3（d））产生的，但会遭受严重的分辨率损失。需要注意的重要一点是，通过增加合并过程中组合的像素数，图像尺寸会按比例减小。例如，图 3 中的 unbinned (1 x 1) 图像最初是 1360 x 1024 像素，而 (2 x 2)、(4 x 4) 和 (8 x 8) 合并图像分别为 680 x 512、340 x 256 和 170 x 128 像素。为了在图中进行说明，这些图像已缩小尺寸。同样，显示尺寸为 512 x 512 的数码相机在以类似方式合并时将产生 256 x 256、128 x 128 和 64 x 64 像素的图像。
合并概念中的一个关键点是在合并过程之后会增加读取噪声，因此即使合并了多个像素，每个合并像素也只有一个读取事件。相比之下，如果在数据收集后对 2 x 2 像素盒进行计算平均，结果将不如分箱，因为四个像素中的每一个都有单独的读取噪声贡献。因此，即使分箱会牺牲空间分辨率，它也会导致信噪比的显着增加，这在对需要低光照水平和短曝光时间的光敏细胞进行实验时尤其有用。在活细胞成像中，关键参数通常是检测微弱荧光信号的能力，而不是在空间上解析它们，因此，通过分箱提供的图像强度和采集速度的增加不仅抵消了分辨率的损失。作为分档的替代方案，许多高性能相机使研究人员能够通过仅读取完整 CCD 阵列上的子阵列或选定的感兴趣区域来减少图像采集时间，这是一种保持空间分辨率同时减少图像数量的有用机制。时间细胞暴露在有害的光照下。
为了克服传统高性能CCD相机在极低光照水平下需要快速帧率捕获的应用的缺点，制造商引入了一种创新方法来放大CCD读取本底噪声以上的弱信号。通过结合片上倍增增益寄存器，电子倍增器件 (EMCCD) 以低得多的成本实现了增强型或电子轰击CCD典型的单光子检测灵敏度，并且不会影响传统 CCD 架构的量子效率和分辨率特性。EMCCD的显着特点是在传感器芯片上并入了一个专门的扩展串行寄存器，该寄存器通过碰撞电离过程产生倍增增益在硅子结构内（参见图 4）。即使在高帧速率下，光子生成的电荷也会高于读取噪声，并且适用于任何当前的 CCD 传感器配置，包括背照式设备。
EMCCD相机系统的一个显着优点是，由于信号放大级直接并入 CCD 结构，因此它们的制造成本比增强型CCD便宜得多。对于具有低强度信号的关键活细胞研究，例如在单分子成像、全内反射、旋转圆盘和扫描场共聚焦显微镜、钙或其他离子的通量测定以及时间分辨三维显微镜中遇到的那些, EMCCD 与其他专为低信号电平设计的传感器相比具有显着优势。此外，当与传统荧光成像技术的较高信号水平一起使用时，EMCCD 系统的极高灵敏度允许应用较低的荧光团浓度和/或来自激发源的较低功率水平，从而减少荧光探针的光毒性和光漂白
针对活细胞成像应用的显微镜必须配备由坚固的复合材料或铝制成的高质量框架，并应通过牢固地安装在无振动平台上来稳定。外部光学表面以及组件外壳（聚光镜、灯箱、物镜转盘等）应保持清洁状态，显微镜周围的环境应无尘且相对湿度较低。活细胞成像持续必需的常规程序之一是确保显微镜光路和隔膜使用科勒照明原理对齐。
电子数码相机系统通常使用专用适配器通过一个或多个相机端口安装到显微镜机身上。研究级显微镜，例如尼康目前的Eclipse Ti2倒置系统，通常配备多个端口，可以同时连接多个摄像头（见图 1））。此功能对于用于多种成像模式的显微镜特别有用，以便在必要时可以快速访问针对每种对比度增强技术优化配置的相机。在显微镜的机身内，一系列反射镜、分束器和棱镜被战略性地放置，以将成像光波反射到各种相机端口和目镜。重要的是要注意，在图像采集过程中发送到目镜的任何光都是以发送到相机的光为代价完成的，从而降低了信噪比。因此，在如此配备的显微镜上，应调整端口方向控制以将 100% 的光发送到用于获取光子限制荧光图像的相机端口。
物镜的选择对于从样本收集最大信号并将其传输到显微镜光学系统至关重要。光路中过多的元件，例如反射镜、分束器、投影透镜、滤光片和棱镜，会严重降低所捕获图像的信噪比，因此必须保持在绝对最小值。在荧光成像中，需要具有非常高数值孔径的物镜来最大化从样本收集的光量。数值孔径定义了镜头可以收集多少来自单个点光源的光，可以说是选择活细胞成像物镜时最重要的考虑因素。该值刻在物镜筒上，范围从低倍率 (10x) 干物镜的 0.25 到水的 1.20 和 1。45 用于油浸版本（40x 到 100x）。在数学上，数值孔径表示为：
数值孔径 (NA) = 折射率 (η) × 镜头接受角 (sin(θ))
因此，物镜的聚光能力由前透镜和样品之间介质的折射率 (η) 乘以角度 (θ) 的最大衍射光线，能够有助于图像形成。此外，物镜产生的图像分辨率是数值孔径的函数。根据瑞利准则（保守估计），分辨率等于常数 (0.61) 乘以照明波长并除以物镜数值孔径。此外，数值孔径定义了图像的强度（亮度），它与数值孔径的四次方成正比，但仅与放大倍数的二次方成反比。因此，数值孔径的小幅增加可以显着改善信号。为此原因，
如上所述，信号亮度与物镜放大倍数的平方成反比，因此在对暗淡样品进行成像时，放大倍数较低的物镜通常是有益的。例如，如果信噪比成为使用数值孔径为 1.4 的 100x物镜成像的样本的限制因素，则更改为类似数值孔径的 60x或 40x物镜将显着提高亮度。事实上，当使用 60x物镜和 100x物镜（两者的数值孔径均为 1.4）成像时，特定的荧光特征应该看起来亮近三倍。
为了对多重标记的固定细胞（在某些情况下为活细胞）成像，物镜在整个可见光谱（范围从 400 到 700 纳米；称为复消色差）中对色差进行了很好的校正，并且具有平坦的成像平面（称为plan或plano）被认为是理想的。不幸的是，复消色差和平面复消色差物镜不可避免地包含比不太精确的物镜（消色差和萤石）更多的光学元件（透镜））。高度校正使这些物镜能够用于透射光技术，包括具有最小伪影的相位对比和 DIC。然而，结果是为了获得最佳光学校正而牺牲了光通量，这一结果对固定细胞成像几乎没有影响，但在活细胞成像中通常会适得其反。这个缺点最好的证明是具有 1.4 的高数值孔径的平面复消色差 40x 物镜，理论上应该比类似的 100x 物镜亮大约六倍，但实际上只有大约四倍的亮度。无论如何，40x 和 60x 物镜仍能提供在光学分辨率极限下可实现的最亮图像。
在示出的图5是的数值孔径重要性关于分辨率和图像亮度的原理的一个例子。标本是贴壁非洲绿猴肾上皮细胞（CV-1系）的培养物，该细胞用编码增强型绿色荧光蛋白的质粒载体转染，该蛋白融合到来自人细胞色素 C 氧化酶亚基 VIII 的线粒体靶向核苷酸序列。在转染的哺乳动物宿主中质粒的转录和翻译后，线粒体定位信号负责荧光蛋白嵌合体在整个细胞线粒体网络中的运输和分布。随后可以使用荧光显微镜观察管状线粒体。
在图 5 中，使用具有相同光学校正（平面萤石）和数值孔径 (1.3) 的物镜对相同视场成像，但放大倍数范围为 40 至 100x。尽管用于收集图 5图像的像素数和检测器条件相同，但当通过 40x 物镜成像时，线粒体最亮（图 5（a）；请注意，图像已调整为通用尺寸）。相比之下，放大倍数更高的 60x和 100x物镜（图 5(b) 和 5(c)，分别）产生逐渐变暗的图像，100x 图像几乎无法分辨。该物镜仍可用于对样品进行成像，但必须显着增加检测器增益，从而导致信噪比恶化和普遍较差的图像。请注意，由于相同的数值孔径值，物镜的分辨能力（图 5（d）至 5（f））具有可比性。
从图 5 中的数据中收集到的主要概念之一是在为荧光蛋白（和其他荧光团）的活细胞成像选择物镜时避免过度放大。使用 40x 或 60x 物镜在共聚焦显微镜上收集图像期间简单地增加数字放大（变焦），结果图像大小与 100x 镜头相当（图 5(d) 和 5(e)）。两个物镜的分辨率相同，因为它们具有相同的数值孔径值。关于放大率相对不重要的论点不应被视为表明使用 60x或 100x物镜没有好处。事实上，当使用宽视野显微镜对非常小的物体（例如过氧化物酶体或分泌颗粒）进行成像时，通常需要选择高倍率物镜。由于图像尺寸相对于探测器尺寸在确定空间采样频率方面起着重要作用，因此最佳放大倍率由数码相机系统的参数（CCD 像素尺寸和中间放大系数）决定。因此，物镜的最佳选择通常取决于仪器的光学配置以及特定实验的特定要求。
在信噪比比分辨率更重要的情况下，使用具有显着更高光通量的低校正物镜（更少的光学元件）通常是更好的选择。当通过包含显着降低光传输的光学元件的物镜（例如相差物镜中的减幅板）进行成像时，也应谨慎使用。这种程度的光减少在传输模式下很少成为问题，但可以显着降低荧光成像中的信号水平（15% 到 20%）。出于这个原因，除非实验协议需要相衬和荧光图像的叠加，否则不应将相位目标用于低丰度探针的活细胞成像。同样，在收集使用荧光和 DIC 的组合图像时，偏振光分析仪（将信号降低约 30%）通常位于物镜正下方的共享光路中，应在获取荧光图像之前将其移除。
显微镜光学系统中存在的任何缺陷都会影响最终图像中的信噪比。在具有高数值孔径物镜的活细胞成像中，球差是必须克服的最常见的伪影。这种像差是由沐浴细胞的介质（通常是折射率为 1.33 的水溶液）与目标浸没介质的折射率之间的不匹配引起的。球面像差通常表现为焦距沿光轴的不均匀分布，从而使点的图像显着拉长和扭曲。因为在存在像差的情况下信号会传播到更大的体积，所以信噪比会降低。与玻璃盖玻片上的贴壁细胞（通常只有几微米厚）相比，在对厚组织进行深入成像时，这个问题要严重得多，并且可以通过使用与折射率更接近的水浸透镜来很大程度上消除培养基。作为替代方案，可以调整浸没介质的折射率或盖玻片的厚度。需要注意的是，折射率随温度而变化，因此浸入介质和盖玻片厚度的最佳组合在室温和 37 摄氏度之间会有所不同。带有校正环的新型浸没物镜可用于对抗温度引起的折射率波动。并且可以通过使用与培养基的折射率更紧密匹配的水浸透镜来很大程度上消除。作为替代方案，可以调整浸没介质的折射率或盖玻片的厚度。需要注意的是，折射率随温度而变化，因此浸入介质和盖玻片厚度的最佳组合在室温和 37 摄氏度之间会有所不同。带有校正环的新型浸没物镜可用于对抗温度引起的折射率波动。并且可以通过使用与培养基的折射率更紧密匹配的水浸透镜来很大程度上消除。作为替代方案，可以调整浸没介质的折射率或盖玻片的厚度。需要注意的是，折射率随温度而变化，因此浸入介质和盖玻片厚度的最佳组合在室温和 37 摄氏度之间会有所不同。带有校正环的新型浸没物镜可用于对抗温度引起的折射率波动。因此浸入介质和盖玻片厚度的最佳组合在室温和 37 摄氏度之间会有所不同。带有校正环的新型浸没物镜可用于对抗温度引起的折射率波动。因此浸入介质和盖玻片厚度的最佳组合在室温和 37 摄氏度之间会有所不同。带有校正环的新型浸没物镜可用于对抗温度引起的折射率波动。
示于图6是显微镜光学系统（图（a）），并且检测器的显著限制;在执行活细胞调查（数字照相机图（b））。该标本由一个来自粘附的大鼠袋鼠肾上皮细胞（PtK2系）的单个间期细胞核组成，该细胞表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP) 融合到组蛋白 H2B 序列（位于细胞核中），并在具有落射照明的宽场荧光中成像。最高分辨率的图像显示在面板 (a) 右下角的光学系统和面板 (b) 的左下角的数码相机系统。在活细胞显微镜中，光学系统决定了可用于生成对比度的光量，并决定了物理分辨率限制，该限制由物镜数值孔径和照明波长设置。随着光照强度的增加（在面板（a）中从上到下遍历），光子计数噪声变得不那么明显并且图像质量显着提高。类似地，随着光学分辨率的增加（图（a）中从左到右），细胞核的较小细节变得更加明显。
数码相机系统从显微镜捕获光学信息，并根据离散的光级和空间分辨率元素（面板 (b)；图 6）对数据进行采样。随着像素大小的增加（图（b）中从左到右），许多特征的较小细节变得模糊，图像呈现块状、几乎无法辨认的外观（图（b）中的右下角）。减少用于捕获和显示图像的灰度级数（面板 (b) 中的从下到上）可减少阴影，只留下对比度非常高的特征（面板 (b) 中的顶行）。请注意，这两个因素共同作用于提供信息。再一次，在活细胞成像实验中，收集的信息量应与调查的要求成正比。
在专为活细胞成像而设计的显微镜中采用了各种滤光片和反射镜，以引导和微调照明和发射光的波长分布，因为它从光源穿过显微镜（和样本），然后到达检测器。在具有对比度增强光学系统的传输模式中，光修改组件是偏振器和棱镜 (DIC) 或聚光镜环和相位环（相位对比度和霍夫曼调制对比度）。由于用于明场、DIC 和相位对比度的显微镜光学系统中的总光通量远高于荧光，因此在这些模式下成像时，通常只需要很少的修改即可提高信噪比。主要考虑是过滤卤钨照明以在它们损坏样品之前去除光毒性紫外线和红外线波长。阻挡红外光对于避免对细胞造成热损伤和降低背景水平是必要的，这些背景水平会使红外敏感相机系统的信噪比复杂化。透射光灯不太关心紫外线，但可以使用绿色或红色干涉滤光片轻松控制到达样品的波长。红外和可见光滤光片都会显着降低光水平，并且可能需要增加检测器系统的曝光和增益设置以保持信噪比。阻挡红外光对于避免对细胞造成热损伤和降低背景水平是必要的，这些背景水平会使红外敏感相机系统的信噪比复杂化。透射光灯不太关心紫外线，但可以使用绿色或红色干涉滤光片轻松控制到达样品的波长。红外和可见光滤光片都会显着降低光水平，并且可能需要增加检测器系统的曝光和增益设置以保持信噪比。阻挡红外光对于避免对细胞造成热损伤和降低背景水平是必要的，这些背景水平会使红外敏感相机系统的信噪比复杂化。透射光灯不太关心紫外线，但可以使用绿色或红色干涉滤光片轻松控制到达样品的波长。红外和可见光滤光片都会显着降低光水平，并且可能需要增加检测器系统的曝光和增益设置以保持信噪比。现代光源还包括发展迅速的 LED。
在荧光成像中，干涉滤光片和二色镜相结合，以选择合适的光波段，用于激发和收集标记样品的荧光团的发射。与透射模式相比，荧光显微镜中相对较低的光水平使得过滤器的选择对于实现足够的信噪比至关重要。在大多数情况下，尤其是在由于荧光团发射谱重叠而引起信号渗漏的情况下，需要应用带通激发和发射（屏障）过滤器。通常，这些过滤器固有的窄光谱窗口进一步限制了通过显微镜的光量，并挑战研究人员选择最佳带宽以获得满意的图像。
显微镜制造商和售后光学滤光片公司提供各种特定的带通滤光片和二色镜组合。为获得最佳信噪比，为活细胞成像选择的过滤器组合应与实验中使用的荧光团的光谱轮廓密切匹配。例如，使用专为多色标记应用而设计的标准荧光素 (FITC) 滤光片组对单独表达黄色荧光蛋白 (YFP) 的细胞进行成像将不必要地牺牲一些 YFP 荧光，否则会提高信噪比（参见图7（a）中）。在这种情况下，将 YFP 吸收和发射曲线与适当的宽带通激发滤波器耦合到长通发射滤波器会产生明显更高的信号。
图 7 中展示了两种流行的荧光蛋白衍生物的优化荧光滤光片组合以获得可能的最高信号水平的示例。顶部面板（图 7(a) 和 7(b)）说明了金星的吸收和发射光谱， YFP 的定点诱变产物，叠加在 FITC 过滤器组上（图 7(a)）以及专门设计的宽带组合，旨在最大限度地提高通常从黄色荧光蛋白收集的信号（图 7(b)）。尽管发射滤波器在传输到检测器的信号水平方面具有可比性，但金星吸收光谱和 FITC 激发滤波器带通区域之间的重叠明显小于宽带 YFP 组观察到的重叠，导致激发效率低下和信号减少. 同样，TRITC 过滤器组合（图 7（c））不会像德克萨斯红组（图 7（d））那样有效地激发 mCherry 荧光蛋白。此外，德克萨斯红组合中发射滤波器的更宽带宽将更多信号传递到检测器。活细胞成像实验中使用的每个荧光团都应根据所选的过滤器组合进行仔细检查，以确保激发和发射的最大效率。
除了标准过滤器组合设计用于对单个荧光团成像，现在可以轻松获得多波段组，以便同时照明和检测标记有两个或多个荧光探针的样本。微调显微镜光学系统时必须考虑的其他因素是中性密度滤光片的战略定位，以降低激发照明水平（对活细胞荧光成像至关重要），以及紫外线和红外滤光片，以抵消或消除样品的光毒性。这些过滤器通常放置在电弧放电（或激光）照明源和显微镜输入光端口之间，并且可以很容易地互换以优化光通量。
如果检测器系统对光学图像进行了充分采样，显微镜中捕获的图像的空间分辨率通常由光学系统的分辨率定义。因为 CCD 检测器是由一个光电二极管阵列构成的，每个光电二极管都有一个固定的尺寸，单个像素的几何形状会限制图像的最终分辨率。为了实现显微镜的全分辨率能力，探测器尺寸应符合每个艾里斑单元 2.5 到 3 个像素的奈奎斯特采样标准。例如，对于 250 纳米的光学分辨率限制，最终图像中的像素大小应约为 80 到 100 纳米。在活细胞成像中，信噪比通常比光学分辨率更重要，收集图像没有明显退化的最有用的限制是每个艾里斑 2 个像素。减少每个艾里单元的像素数会增加图像的亮度，并允许使用可以积累更多光电子的更大的 CCD 光电二极管。
在示出的图8的（a）从在活细胞成像通常使用的高数值孔径物镜艾里斑的是图像投影到CCD像素阵列的表面上。阵列中的每个像素大小为 6 微米。数值孔径为 1.4 的 100x物镜将直径为 20 微米的图像投射到 CCD 表面上（见表 1)，从而轻松实现 Nyquist 采样大小（每个 Airy 单元 3.3 像素）。在此采样频率下，即使使用 2 x 2 像素合并，也有足够的余量来满足奈奎斯特准则。相比之下，60x物镜（也是 1.4 数值孔径）投射的图像直径为 12 微米，刚好低于奈奎斯特极限的下限。此外，即使数值孔径减小到 1.3，40x物镜也能产生 8.4 微米的图像，并且需要放大相机适配器以符合 Nyquist 分辨率标准。具有更大或更小的像素尺寸的光电二极管阵列可以匹配显微镜的光学分辨率而无需中间放大，或者可以使用包含适当镜头系统的专用 CCD 适配器轻松修改。
2 x 2 像素合并的示意图如图 8(b) 所示对于包含 16 个像素的数组。在曝光期间积累光电子后，相机读出电路执行两个连续的平行移动，每个移动 4 个像素。随后，两个 1 个像素的串行寄存器移位将 4 个像素（2 x 2 分箱）收集的光电子放入输出节点，放大器读取其电压。以类似的方式，4 x 4 合并（未图示）将在读出之前将整个 16 像素阵列的内容移入输出节点，显着增加信号，同时降低读取噪声。如前所述，在检查用荧光蛋白标记的活标本时，像素合并是一种极好的方法，可以在减少毒性伪影所需的低表达水平下检索微弱信号。
实际上，对于数值孔径为 1.4 的物镜，最终图像中的理想像素大小在 100 到 120 纳米之间。将此数字转换为 CCD 光电二极管的适当物理尺寸需要考虑物镜的放大系数。例如，要实现 60x物镜（1.4 数值孔径）的全光学分辨率，检测器的光电二极管尺寸必须为 6 微米或更小（由放大倍率和分辨率的乘积决定）。然而，对于相同数值孔径的 100x物镜，最佳光电二极管尺寸增加到 10 微米。因此，很明显，特定 CCD 相机的数字分辨率仅在相机正确耦合到适当的物镜时才与显微镜光学分辨率相匹配。将具有 10 微米光电二极管的 CCD 相机与 100x物镜配对将导致图像中的最终像素尺寸为 100 纳米。当与 60x物镜一起使用时，同一台相机将产生 167 纳米像素，这在一定程度上限制了记录图像的分辨率。相比之下，带有 6 微米光电二极管的 CCD 将与 60x物镜完美匹配，但在旋转显微镜物镜转盘以插入 100x物镜时会产生过采样的图像。以这种方式过采样将显着降低图像亮度，同时无法提高分辨率。相比之下，带有 6 微米光电二极管的 CCD 将与 60x物镜完美匹配，但在旋转显微镜物镜转盘以插入 100x物镜时会产生过采样的图像。以这种方式过采样将显着降低图像亮度，同时无法提高分辨率。相比之下，带有 6 微米光电二极管的 CCD 将与 60x物镜完美匹配，但在旋转显微镜物镜转盘以插入 100x物镜时会产生过采样的图像。以这种方式过采样将显着降低图像亮度，同时无法提高分辨率。
从前面的讨论看来，将显微镜光学系统与探测器的像素分辨率相匹配的唯一理想解决方案是为每个物镜使用不同的相机。在实践中，显然这种策略是不切实际的，必须找到一个折衷来优化单个相机系统的效用。在某些情况下，可以通过在显微镜和相机之间安装耦合器来避免分辨率问题，从而降低物镜的放大倍数。例如，0.6x 耦合适配器会降低 100x 物镜的投影图像放大率，以匹配 60x 物镜的放大率。各种相机耦合器可从售后市场经销商处获得，以增加或减少 CCD 光电二极管阵列平面上的投影放大率。关于更换数字 CCD 相机，如上面可疑的建议，重要的是要注意，虽然这些设备可以相对容易地从显微镜中移除，但最好将相机安装在显微镜端口上，以防止灰尘和碎屑进入显微镜的主体和粘附在相机图像传感器窗口上（静电促进的工件）。清洁传感器面板窗口是一项异常艰巨的任务，尤其是当目标是完全清除每一粒灰尘时。
| 物镜 （数值孔径） | 分辨率 限制 （微米） | 投影 尺寸 （微米） | 所需的像素 大小 （微米） |
|---|---|---|---|
| 1x (0.04) | 6.9 | 6.9 | 3.5 |
| 2x (0.06) | 4.6 | 9.2 | 4.6 |
| 2x (0.10) | 2.8 | 5.6 | 2.8 |
| 4x (0.10) | 2.8 | 11.2 | 5.6 |
| 4x (0.12) | 2.3 | 9.2 | 4.6 |
| 4x (0.20) | 1.4 | 5.6 | 2.8 |
| 10x (0.25) | 1.1 | 11.0 | 5.5 |
| 10x (0.30) | 0.92 | 9.2 | 4.6 |
| 10x (0.45) | 0.61 | 6.1 | 3.0 |
| 20x (0.40) | 0.69 | 13.8 | 6.9 |
| 20x (0.50) | 0.55 | 11.0 | 5.5 |
| 20x (0.75) | 0.37 | 7.4 | 3.7 |
| 40x (0.65) | 0.42 | 16.8 | 8.4 |
| 40x (0.75) | 0.37 | 14.8 | 7.4 |
| 40x (0.95) | 0.29 | 11.6 | 5.8 |
| 40x (1.00) | 0.28 | 11.2 | 5.6 |
| 40x (1.30) | 0.21 | 8.4 | 4.2 |
| 60x (0.80) | 0.34 | 20.4 | 10.2 |
| 60x (0.85) | 0.32 | 19.2 | 9.6 |
| 60x (0.95) | 0.29 | 17.4 | 8.7 |
| 60x (1.40) | 0.20 | 12.0 | 6.0 |
| 100x (0.90) | 0.31 | 31.0 | 15.5 |
| 100x (1.25) | 0.22 | 22.0 | 11.0 |
| 100x (1.30) | 0.21 | 21.0 | 10.5 |
| 100x (1.40) | 0.20 | 20.0 | 10.0 |
当前许多专为荧光显微镜设计的高性能数码相机系统的光电二极管尺寸范围为 5 到 16 微米，并具有片上分档功能。如上所述，合并功能使来自几个相邻光电二极管的电荷能够组合成一个更大的单元，从而有效地增加了像素的尺寸。对于 6 至 8 微米光电二极管尺寸范围内的相机，使用 60x 物镜通常可以匹配完整的显微镜光学分辨率，而无需合并，而将光电二极管合并为 2 x 2 阵列可与 100x 物镜一起使用以增加图像亮度。除了利用更高透射率的 60x物镜将光学系统分辨率与 CCD 的分辨率相匹配之外，当使用 100x 物镜结合分箱（2 x 2 分箱将灵敏度提高四倍）时，这种方法可以获得更亮的图像。因此，在 bin 2 处使用 100x 物镜记录的图像的亮度（并且具有相同或更好的分辨率）大约是使用 60x 物镜记录的图像（未进行 binning）的两倍。在需要或需要额外灵敏度的情况下，60x 物镜可以合并为 2 x 2，以将亮度增加四倍，同时分辨率降低，这对于大多数活细胞成像研究来说通常是可以接受的。
在一些应用中，例如那些需要同时监测大量细胞群的应用，捕捉更大一部分的视场比空间分辨率更重要。没有中间放大倍数的数码相机中的矩形 CCD 图像传感器无法捕捉通过显微镜目镜观察到的整个视野；相反，它被限制在 30% 到 80% 的范围内，具体取决于芯片尺寸。如果需要更大的视野，可以使用降低放大系数的耦合适配器（如上所述）。在许多情况下，0.6 倍中继透镜将投射出的图像尺寸与目镜中看到的视图非常接近，但会降低分辨率。或者，为了保持分辨率，x - y电动扫描台，随后使用采集后处理软件拼接成更大的图像。
光学显微镜中最大的分辨率是通过近紫外光实现的，这是最短的有效成像波长。近紫外光之后是蓝光，然后是绿光，最后是红光，能够解析标本细节。在大多数情况下，显微镜师使用卤钨灯泡产生的广谱白光来照亮样本，但在活细胞成像中，通过应用干涉滤光片，照明光谱通常限于窄带宽。可见光谱的中心约为 550 纳米，这是绿光的主要波长（人眼对绿光最敏感）。正是该波长用于计算表 1 中显示的分辨率值，因此当使用更高或更低波长的光时，这些值会有所不同。
也许活细胞成像最关键的方面是在实验过程中平衡信号强度（低放大倍数有利）、分辨率（高倍率有利）和细胞活力的同时实现最佳放大倍数。调查人员必须特别注意使最终的光学放大倍数与使用尽可能少的透镜元件的探测器的像素大小相匹配。具有多种中间放大系数的光耦合器可在市场上买到，以满足光限制和高分辨率应用的特定物镜要求（放大率和数值孔径）。在选择物镜放大倍数时，应严格考虑奈奎斯特分辨率标准。
通常用于活细胞成像的标准显微镜物镜是 10x 和 40x（干），以及 40x、60x 和 100x 油浸或水浸版本。经济型干式低倍率镜头主要用于样品的初步扫描以定位感兴趣的区域，不需要高光学校正系数。然而，浸没透镜应具有高数值孔径（油为 1.3 至 1.45，水为 1.2）和高透光效率。由于图像通常聚集在视场中心附近，因此高度校正以产生平坦视场的物镜通常不会提供可检测的好处，并且比校正较少的物镜成本更高且光效更低。
冷却单色 sCMOS 和 CCD 相机是大多数涉及培养中活细胞的成像应用的最佳选择，无论是落射荧光还是具有对比度增强（DIC 和相位对比）的透射光是主要采集模式。在选择相机时，要考虑的重要参数包括量子效率、噪声水平（暗电流和读出）、像素大小（以及相关的全阱容量）和扫描频率。为了尽量减少撞击样品的激发光水平，相机应尽可能灵敏，这通常意味着高量子效率、低噪声、大像素尺寸和慢扫描速度。
慢扫描 CCD 相机的帧速率通常受到限制，除非样品具有极亮的荧光，否则当曝光时间很短时，信噪比很差。这限制了这些相机系统在高速成像应用（范围高达每秒 30 帧）中的使用，并阻碍了对样品进行对焦的尝试。在定位合适的标本并聚焦相机时，应尝试避免光漂白和光毒性，这些伪影会损害细胞活力和亮度。在这方面，应选择具有无快门、帧传输或隔行 CCD 传感器的相机，除了慢速扫描数字信号外，它们还能够以视频速率提供连续的图像流。在极低光照条件下，荧光探针显示有限的丰度或低量子产率，再加上需要捕捉高速运动，可能需要使用增强型或电子倍增 CCD 相机系统。
