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相差光学元件几乎可以添加到任何明场显微镜，前提是专门的相差物镜符合管长参数，并且聚光镜将接受正确尺寸的环形相差环。主要制造商都为他们的研究和教学级显微镜提供相差配件，包括正置和倒置（组织培养）配置。
图1说明了可用于 Eclipse 系列立式尼康研究显微镜的典型相差组件，尽管其他制造商也生产类似的配件。图1中的聚光镜是一个通用系统，设计用于使用多种放大倍率（2 倍到 100 倍）和附件的应用，以实现多种对比度增强技术，包括微分干涉对比度 (DIC))、暗场和相差。包含内相差板的物镜提供各种光学校正因子，从简单的消色差仪到平面复消色差仪。此外，相差板可提供多个级别的环绕波前衰减，以产生不同程度的对比度和背景强度。尼康等显微镜物镜制造商通常生产正相和负相透镜。
为了将聚光镜环与物镜后焦平面中的相差板对齐，可以使用插入显微镜目镜观察管之一的相差对中目镜（如图 1 所示）。一个完整的相差附件套件的成本从几百美元到几千美元不等，这取决于物镜校正系数、台下聚光器的复杂性和光学校正，以及是否包括相差对中目镜。以下部分更详细地描述了这些组件，并提供了配置和校准相差显微镜的指南。
相差的环（环是拉丁术语环，与多个存在的环) 用于立式显微镜的台下聚光镜，或倒置显微镜照明柱上的聚光镜转台内，必须与配备相应相差板的特定物镜专门匹配。例如，20 倍物镜和 100 倍物镜在衍射平面（后焦平面）附近都包含一个相差板，将需要具有不同直径的聚光镜环，这与物镜放大率和数值孔径相对应。通过将聚光器环与物镜相差板相匹配，显微镜可以对准以将穿过环的照明光线叠加到物镜相差环上，以实现相差照明。
大多数为相差显微镜设计的流行通用聚光镜系统都配备了三个或更多可拆卸环形光阑，可用于包含适当相差板的 4x、10x、20x、40x、60x 和 100x 物镜。包含最小孔径的Ph1（或等效）聚光镜环设计用于低功率 10x 和 20x 物镜。中级放大物镜（40 倍和 60 倍）使用Ph2环，而最高倍率（和数值孔径）的 100 倍物镜需要Ph3环，其中包含最大孔径。一个专门的聚光镜环（PhL) 与低倍率物镜（4x 和 5x）一起使用，当聚光器摆动透镜从光路中移除时，或在专为倒置组织培养显微镜设计的长工作距离聚光器中使用。
聚光镜环嵌件是圆形铝板，在中心具有不同尺寸的冲压环（如图 1 和图 2 所示）。冲压操作后，环形磁盘单元被阳极氧化并用黑色颜料染色，以吸收杂散光并确保通过环形空间的照明光线遵循规定的路径。中央光阑的大小取决于目标物镜孔径和放大倍率范围，位于板的中央，并由三个以 120 度间隔隔开的细长凸片固定。环形板被压入或粘合成圆形框架（也经过阳极氧化和染黑），该框架安装在聚光镜转盘的圆形开口中。
现代通用聚光系统转盘（见图 2）通常包含 5到8个开口槽位置，可以安装环形相差板、DIC Nomarski (Wollaston) 棱镜板或暗场光挡板。这些板的基本结构是相似的。暗场光阑的制造方式与相差环形光阑类似，但环通常更宽，直径更大，以使高度倾斜的光波前能够通过。相比之下，DIC 棱镜被切割成圆形板，然后粘合到阳极氧化框架中并插入转盘中。
相差聚光器环形隔膜板插入转盘中的适当位置，并使用位于转盘开口周边内部的弹簧夹固定到位。弹簧夹的张力迫使环板靠在一组用于将环带在光路中居中的调节螺钉（或螺纹销）（如图 3 所示））。一些制造商提供专为相差对比设计的聚光镜系统，其具有集成的环对中系统。这些聚光镜通常有一组调节旋钮，可以通过按下每个旋钮的轴直到它锁定到环带调节螺钉中来启动。螺钉接合后，转动旋钮将使操作员能够将聚光镜环相对于物镜相差板居中。
每当使用通用显微镜聚光镜进行相差观察时，操作者应确保检查孔径光阑杠杆的位置，以确保光圈打开得比聚光镜环的直径更宽。事实上，在相差观察期间始终将光圈打开到其最宽的位置是一个好主意。一些制造商提供专为相差对比设计的聚光镜，它们具有弹簧加载机制，当相差环旋转到光路中时，会自动打开聚光镜孔径可变光阑，但禁用此功能以使用相同的聚光镜进行明场观察。在完成相差实验后，
相差聚光镜具有广泛的光学校正级别，从基本的阿贝设计（无色差或球面像差校正）到具有出色性能的高度校正的消球差消色差系统。此外，还提供配备长工作距离 (LWD) 光学器件的专用相差聚光镜，适用于正置和倒置显微镜，以便对厚容器中的标本进行成像。许多研究级倒置显微镜具有带相差环的超长工作距离 (ELWD) 聚光镜，可以在非常大的容器中观察活细胞。
了解如何对齐相差显微镜并在聚光镜环与物镜中的相差板对齐和不对齐时通过目镜（以不同的放大倍率）检查样品外观的变化。
相差附件的规格因制造商而异，并且没有公认的相差环形光阑（和物镜相差板）尺寸标准，无论是数值孔径还是放大倍数。因此，一个显微镜制造商的相差物镜通常不能耦合到另一个制造商的相差聚光镜（反之亦然）。
单环相聚光镜曾一度非常流行，但已在很大程度上被通用转盘模型所取代。较旧的聚光镜需要随着物镜的变化移除和插入不同的相差环，这是一项繁琐且耗时的任务，在以多个放大倍率检查精细样品细节时，通常必须经常重复。单环式聚光镜中环形隔膜的对中以类似于新型通用聚光镜的方式完成。使用平叶片或艾伦型螺纹销或螺钉将环板压靠在聚光镜外壳内的片簧或螺旋弹簧单元上。
为了使标准阿贝、消色差或消球差台下聚光镜适用于相差观察，必须建立一种机制，将环形光阑放置在聚光镜前焦（孔径）平面内或非常靠近聚光镜前焦（孔径）平面。几种聚光镜型号制造有孔径可变光阑（始终位于焦平面）位于聚光镜底部，靠近设计用于接受相差板或暗场光挡的槽。其他聚光镜的孔径平面位于外壳的中心区域，辅助部件（例如相差环）相对难以接近该区域。
为相差显微镜设计的物镜最重要的属性是存在位于衍射或后焦平面内或非常靠近衍射或后焦平面的专用相差板。相差板在物镜之间不可互换，并且通常被永久蚀刻到内部透镜元件之一中。蚀刻的环涂有部分吸收金属膜，可降低透光率，并且通常制成使得通过的光的相差相对于透射过玻璃其余部分的光提前四分之一波长。
典型相差物镜的剖面图如图 4 所示。插图说明了位于后焦平面中的相差板。物镜的其他部分，包括大部分内部透镜元件，在结构上与标准明场显微镜物镜相同。主要制造商提供的相差物镜范围几乎涵盖了校正因子的全部范围，包括消色差、平面消色差、萤石和复消色差. 这些物镜还提供盖玻片校正环（用于干式高数值孔径物镜）和用于在水、甘油和油中浸渍技术。此外，制造的相差物镜在相差板的中性密度和延迟值方面有所不同，以在正相差模式和负相差模式下产生广泛的对比度水平。
尼康和其他制造商生产各种符号（正或负）的相差物镜（见图 5），对比度范围从相对低到非常高。在正相差对比中，最常见的形式是薄样品的光密部分在具有较浅灰色阴影的背景下显得较暗。负相差使标本明亮，但叠加在暗背景上，类似于暗场照明。
示于图5是使用当前可用的尼康相差物镜以证明通过在相差差板中性密度和改变环绕的波阵面内延迟（或前进）水平得到对比度变化记录的数字图像的比较。这些图像是来自Zygnema丝状藻类的固定和安装制剂的相同视场。图 5(a)、5(b) 和 5(c)比较了暗低低、暗低和切趾相差物镜（分别为DLL、DL和ADL），它们在相对较亮的物体上产生相似的对比度灰色背景。暗、亮中等尼康相差物镜（图 5(d) 和 5(e)) 展示了中等灰色背景上的正负相差。下面讨论各个尼康相差物镜的特性。
由于折射率和厚度的大波动会产生对比度反转和远离焦平面的样品区域的显着光散射，因此由各种类型的相差物镜提供的样品对比度程度是复杂的。应用于相差板的吸收材料的密度（以衰减环绕光波前）和相差板的相移特性（延迟或提前环绕波前）对相差显微镜中观察到的结果有显着影响.下面列出了尼康生产的各种相差物镜的几个重要特征。
DL（暗低 - 中对比度）- DL 物镜在浅灰色背景上产生深色图像轮廓，是用于通用相差观察的典型物镜。这些物镜旨在为与周围介质的折射率有重大差异的样品提供最强的暗对比度。DL 相差物镜是检查细胞和其他半透明活体材料最流行的类型，特别适用于显微摄影和数字成像。
DLL (暗低低 - 低对比度) - 在设计上与 DL 物镜相似，DLL 系列在明场照明中产生更好的图像，并且经常被用作利用多种照明模式（如荧光、DIC）的显微镜系统中的“通用”物镜、明场和暗场。DLL 相差物镜产生的对比度低于 DL 物镜，但具有比标准 DL 物镜更高的光透射值、光学校正和数值孔径。制造商提供的大多数 DLL 相差物镜具有萤石或复消色差校正级别。
ADL（变迹暗低 - 中对比度） - 最近由尼康推出，变迹相差 ADL 物镜在相差板中央环的两侧包含一个二级中性密度环。添加次级环有助于减少通常与相差显微镜中大颗粒或样本特征（如细胞核、全细胞和纤维）成像相关的不需要的“光晕”效应。变迹物镜可用于消色差光学校正和类似于 DL 物镜系列的特征对比度级别。
DM（暗中- 高对比度）- DM 物镜在中灰色背景上产生暗图像轮廓。这些物镜设计用于与具有小相移或折射差的样品（例如细纤维、鞭毛、纤毛、颗粒和非常小的颗粒）的高图像对比度。通常仅限于具有大数值孔径（萤石和复消色差）的更高放大倍率物镜，DM 相差物镜在非常薄的样品上表现良好，但在对厚样品成像时通常会显示对比度的反转。
BM（明亮中等 - 高负对比度）- 通常称为负相差，BM 物镜在中等灰色背景上产生明亮的图像轮廓。BM 物镜是目视检查细菌鞭毛、纤维蛋白束、微小球和血细胞计数的理想选择。
为了使显微镜师能够快速识别相差物镜，许多制造商在外筒上用绿色字母标出了重要的规格，例如放大倍率、数值孔径、管长校正等。绿色字母数字颜色代码用于区分相差物镜与普通明场、偏振、DIC 和荧光物镜，后者使用替代颜色代码或标准黑色字母。此外，相差物镜在桶上有铭文，表明物镜是为相差而设计的，也是匹配的环指定。表 1中描述了许多最常见的物镜桶雕刻. 相差物镜也可以很容易地通过将物镜保持在明亮的光线下并透过玻璃观察中心定位的暗相差环来识别。
| 缩写 | 类型 |
|---|---|
| 相差、PHACO、PC | 相差 |
| Ph 1、2、3 等 | 相差聚光镜环 1、2、3 等 |
| DL、DLL、DM、ADL | 暗低、暗低低、 暗中、切趾暗低 （正相差） |
| PL、PLL、PM、PH | 正低、正低低、 正中、正高对比度 （正相差） |
| NL、NM、BM、NH | 负低、负中、 亮中、负高 （负相差） |
具有增加的数值孔径和放大率的典型系列相差物镜如图 6 所示。通常，当物镜数值孔径和放大倍数增加时，相差板宽度和直径都会减小（并且聚光镜环尺寸增加）。也如图 6 所示是剖视图，显示了正负相差板结构背后的基本概念。正相差板产生暗对比度，并包含一个部分吸收膜，旨在降低环绕波前的幅度。此外，该板包含相差延迟材料，旨在将衍射光的相差偏移（延迟）90 度。负相差板还包含相差延迟和部分吸收材料。然而，在这种情况下，两种材料都放置在圆形相差环内，因此未衍射的环绕波前成为唯一受影响的物质，并且相差衰减和延迟 90 度。
通过改变相差板的特性，包括金属膜（或抗反射涂层）的吸收、相差延迟材料的折射率和相差板的厚度，可以在相差物镜中调节对比度。制造商提供的大多数相差板都是通过将薄介电和金属薄膜真空沉积到玻璃板上或直接沉积到显微镜物镜内的透镜表面之一来生产的。介电膜的作用是改变光的相差，而金属膜则衰减非衍射光强度。一些制造商将多种抗反射涂层与薄膜结合使用，以减少反射回光学系统的眩光和杂散光的数量。如果在透镜表面没有形成相差板，它通常粘合在位于物镜衍射平面附近的连续透镜之间。精心选择介电、金属和抗反射膜以及光学胶的厚度和折射率，以在相差的互补（衍射）和共轭（环绕）区域之间产生必要的相移盘子。在光学术语中，将环绕光相对于衍射光的相差改变 90 度（正或负）的相差板被称为 仔细选择以在相差板的互补（衍射）和共轭（环绕）区域之间产生必要的相移。在光学术语中，将环绕光相对于衍射光的相差改变 90 度（正或负）的相差板被称为 仔细选择以在相差板的互补（衍射）和共轭（环绕）区域之间产生必要的相移。在光学术语中，将环绕光相对于衍射光的相差改变90 度（正或负）的相差板被称为四分之一波片，因为它们对光程差的影响。
如果位于台下聚光器前焦平面的聚光器环与物镜中的固定相差板（沿显微镜光轴位于中央）不完全对齐，则相差光学系统提供的对比度效果将受到极大的损害。为了确保适当的显微镜操作并最大限度地提高相差效果，应检查物镜后焦平面，聚光镜环就位，以确保显微镜正确对齐。这项任务可以使用相差对中目镜来完成，它可以插入一个目镜观察管（代替普通目镜）或伯特兰透镜内置于显微镜双目（或三目）目镜筒组件中。尼康Ti2 倒置显微镜具有内部 Bertrand 镜头，可以通过肉眼或直接在相机上观察相差环以进行精细对准，以及外部相差对比模块，用于使用不带物镜的物镜执行相差对比成像有一个相差环。
相差对中目镜，通常也称为辅助对中目镜或辅助显微镜，由一个简单的两个或三个镜头对中目镜组成（如图 7 所示）) 用作物镜和目镜组合的微型光学系统，介于对中目镜和显微镜之间。相差对中目镜的焦距范围从大约 150 到 200 毫米，使该装置在插入显微镜目镜观察管之一时能够聚焦在物镜后焦平面上。当相差对中目镜正确聚焦时，物镜焦平面的放大视图清楚地揭示了聚光镜环和物镜相差环之间的空间排列。在观察物镜中的固定相差环时，操作员可以对聚光镜环位置进行调整，将两者对齐以进行相差对比观察（见图 8）。
主要设计用于在偏振光或微分干涉对比中观察的显微镜通常有一个 Bertrand 透镜，它被整合到目镜观察管单元中，或者有一个插入在目镜管和显微镜主体之间的中间管。Bertrand 透镜比简单的相差对中目镜稍微复杂一些，它充当中继透镜，将物镜焦平面的图像传输到位于目镜孔径光阑中的显微镜中间图像平面。因此，将 Bertrand 透镜插入显微镜光路后，可以通过显微镜目镜观察物镜后焦平面（和相差板/聚光镜环对准）。在大多数配备 Bertrand 透镜的显微镜上，镜头可以通过位于目镜筒下方的小型指轮机构旋转进出光路。后来型号的显微镜通常将 Bertrand 透镜与改变图像放大系数的透镜一起安装在转盘中。调整是通过一个标有小旋钮B或Ph表示 Bertrand 镜头位置，0或其他数字表示放大镜头。
相差对中目镜和伯特兰透镜都必须配备调焦机构，因为物镜后焦平面的位置会随着放大倍数（以及许多其他因素）而变化，并且位于显微镜内的不同水平. 对典型的相差对中目镜进行聚焦只需简单地扭动目镜筒即可完成（参见图 7) 直到物镜后焦平面清晰聚焦。以类似的方式，现代显微镜中的大多数 Bertrand 透镜都配备了一个聚焦指轮，使操作员能够将 Bertrand-透镜-目镜组合聚焦在物镜的相差板上。当使用一组匹配的物镜（齐焦，具有相同的光学校正和镜筒长度）时，后焦平面位置应在放大倍数改变时保持基本相同，从而减少重新聚焦相差对中目镜或伯特兰透镜的必要性。
在尝试对齐显微镜以进行相差观察之前，请仔细检查仪器以确保所有物镜都包含相差板并牢固地固定在物镜转盘上。物镜也应按其在物镜转盘上的排列顺序排列，从低到高的放大倍率，以最大限度地减少一个聚光镜环和另一个聚光镜环之间的转换频率。通常 10x和20x 物镜共享一个共同的聚光镜环，40x 和 60x 物镜也是如此。高度校正的物镜，例如为油浸设计的复消色差仪，通常具有相似的数值孔径，并在更广泛的放大倍数范围内（40 倍到100 倍）使用相同的聚光镜环。低功率相差对比（4x和5x）通常需要一个摆动透镜聚光镜和一个专门的聚光镜环。
聚光器环形板也应按顺序排列，从为低倍率物镜设计的环开始，一直到为最高倍率设计的环。一般来说，整个放大范围可以用三个或四个单独的环面覆盖。如果使用通用聚光镜，将放大率最低的环（例如，PhL或Ph1）放置在明场槽的右侧，其他板按顺序放置在相邻的槽中。通常，样品必须在相差观察之前或之后在明场中进行检查，因此这种安排将提供一个简单的工作流程。
示于图8是在未对准物镜后焦平面的图像（图8（a）和图8（c））和后聚光镜环和相差环已适当地对准（图8（e）中）。该图中还说明了通过目镜观察时出现的相应图像（图 8(b)、8(d) 和 8(f)），它们展示了当显微镜未对准时标本的外观（图8（b) 和 8(d)) 并根据下面概述的程序仔细对齐 (图 8(f))。
建议按照以下步骤校准相差显微镜。
将明亮染色的标本放在舞台上，并在明场照明模式下将 10 倍相差物镜旋转到光路中。聚焦标本，并关闭视场光阑，直到它进入视野的边缘。使用聚光镜高度调节旋钮，定位台下聚光镜，使视场光阑的各个叶片清晰对焦，并使用主聚光镜居中调节旋钮确保视场光阑居中。仔细检查显微镜配置，以确保已实现 Köhler 照明，并且样品处于清晰对焦状态。
取出染色标本并将相差标本放在显微镜载物台上。如果目标样本只有最小的光程差异（并且可能难以可视化），请将显微镜与已知在相差模式下产生高对比度的样本对齐。旋转聚光镜转盘，直到合适的环位于光路中（Ph1或 10x 物镜的等效物）。检查以确保聚光镜环颜色代码或铭文与物镜相匹配。检查聚光镜孔径光阑杆的位置并将其移动到最宽的光圈位置（专为相差设计的聚光镜可能会自动执行此操作）。
如果显微镜配备了Bertrand镜头，请使用指轮控件将镜头摆动到位。或者，取下其中一个显微镜目镜并将相差对中目镜插入观察管中。
通过目镜或相差对中目镜观察时，调整伯特兰透镜或对中目镜聚焦目镜筒的焦距，直到物镜中的相差板处于清晰对焦状态，聚光环的亮像与暗中性密度材料之间的重叠相差板很明显。在许多情况下，显微镜最初会不对齐，并且环面图像不会准确地覆盖相差板中的中性密度材料（如图1(a)和图 1(c) 所示）。
找到聚光镜环定心销（或螺钉）并用一把螺丝刀或适当的旋钮调整环的位置，直到它与目标相差板重合（图1（e））。注意：不要尝试使用主聚光镜定心旋钮（通常位于与显微镜相连的聚光镜安装支架上）调整聚光镜环的位置。这种努力可能无法实现预期的聚光镜环对准，并且肯定会损害之前应该建立的科勒照明条件。
当聚光器环正确居中时，通过聚光器的光环将被应用于物镜相差板的中性密度材料衰减，从而降低环图像的强度。因此，如果聚光器环未正确居中，则在物镜相差板中的中性密度材料附近会出现明亮的新月形边缘（图1(a) 和 1(c)）。如果环的图像不适合相差板的暗圈，则聚光镜未聚焦（并且未建立科勒照明），或者相差对中目镜（或伯特兰透镜）未聚焦在物镜上后焦平面。在某些情况下，即使相差对中目镜（或 Bertrand 透镜）和台下聚光镜正确聚焦，聚光镜环面图像也很模糊并且看起来失焦。这可能是由样品的低频衍射引起的。如果发生这种情况，请从载物台上取下样品并继续校准显微镜。
如果聚光镜环图像与物镜相差板的尺寸明显不同，请检查聚光镜中是否安装了错误的环板（最可能的原因）。如果使用高数值孔径油浸物镜，另一种可能性是聚光镜前透镜元件设计为浸入式。在这种情况下，在聚光镜和显微镜载玻片之间（和/或物镜和盖玻片之间）没有油滴的情况下，可能很难（或不可能）将聚光镜环叠加在相差板上。
当聚光镜环和物镜相差板正确对齐时，图1(e)中所示的图像应出现在相差对中目镜或带有Bertrand透镜的目镜中。在这一点上，显微镜被正确配置为观察具有相差照明的标本。
用目镜更换相差对中目镜，或将Bertrand透镜旋转出光路，然后检查样品。背景应呈现中性灰色（取决于物镜相差板的中性密度），样品在高对比度下可见。
一旦显微镜已针对相差对齐，它通常会在大量物镜/环变化时保持其中心，但应定期检查以确保正确对齐。如果显微镜开始偏离对准，出现在目镜（或计算机显示器）中的图像将越来越像使用明场照明观察到的图像。
大多数显微镜制造商都提供带有辅助相差套件的绿色干涉或吸收滤光片，因为滤光片会产生与物镜相差板原始校准所用波长相同的单色光。因此，当滤光片插入光路（通常在照明聚光镜和视场光阑之间）时，对比度会增加。大多数商用相差板设计用于在可见光谱的绿色（550 纳米）部分产生四分之一波长的相移。理论上，如果使用白光而不是单色光，干涉消光不会对所有颜色都完全，并且对比度会受到影响。如果消色差物镜、仅在绿色区域进行色差校正，用于相差观察或图像记录。然而，对于目前高度校正的萤石和复消色差物镜，对比度差异通常可以忽略不计，因此微不足道。
使用相差照明成功成像的关键是正确对齐显微镜，并确保足够薄的样品均匀分布在显微镜载玻片上的安装介质中。用非常厚的标本制作的图像通常会受到难以解释的离焦模糊和对比度反转伪影的影响。如果显微镜长时间使用，偶尔检查物镜后焦平面，以验证聚光镜环与物镜中的相差板是否对齐。
