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在偏光显微镜中，各种光学和机械组件的正确校准是必须进行的关键步骤，然后才能在单独的交叉偏振器之间或与延迟板和补偿器组合进行定量分析。必须相对于显微镜光轴以及其他机械和光学组件正确放置几个基本组件。以下概述的一系列校准步骤旨在用于偏光显微镜，并且应同时适用于学生级和研究级仪器。
偏光显微镜的基本光学和机械组件如图1所示。至少，这些显微镜必须配备两个线性偏振元件。其中一个偏光镜（在图1中称为“偏光镜”）放置在聚光镜内部或下方的镜台下方，或覆盖基座中的显微镜光源出射口。第二偏振器（称为分析器图1中的（图1）安装在物镜后孔上方，位于物镜鼻孔中或位于镜架与观察管之间的中间管内。许多偏光显微镜都配备有刻度的圆形工作台，可以旋转360度以快速改变样品相对于偏振器和检偏镜透射轴的方向。此外，偏光显微镜中的目镜之一应具有十字准线，以识别光场的中心和轴。先进的显微镜包括一个Bertrand透镜，用于锥光观察聚焦在物镜后孔径上的干涉图案，但是该附件对于常规观察并不是绝对必要的。
偏光显微镜校准程序
偏光显微镜校准的第一步是建立正确的Köhler照明，同时将偏振器和检偏器都从光路中移开。将明场（染色）样本放在载物台上，然后将10倍物镜旋转到观察位置。用物镜聚焦样品，并将视场光圈虹膜关闭至最小设置。通过调节聚光镜高度，使部分闭合的视场光阑在与样品相同的平面上聚焦。使用聚光镜对中螺钉将视场光圈虹膜开口的图像平移到目镜十字准线的中心，然后打开光圈，直到叶子刚好在视场之外。
在插入偏光镜和检偏镜之前，应将360度圆形旋转平台校准10倍物镜的中心，以便在旋转样本时将其保留在视场的精确中心。载物台和物镜的居中也是对双折射和光程差进行定量分析的重要步骤。大部分圆形显微镜载物台在三个可调销上枢转，一个在载物台的前面以正确定位，另外两个在载物台的后部附近以120度角等距分布。可以通过旋转对中螺钉对后枢轴销进行微调，将平台对中。首先在没有其他干扰结构的区域中，在相对简单的明场标本上定位一个小的圆形特征。下一个，将所选特征重新定位到目镜十字线中视场的中心（请参见图2（a））。将载物台旋转180度，直到居中的标本特征被垂直目镜十字准线之一重叠（图2（b））。使用枢轴螺钉将样本特征重新定位到距十字准线中心大约一半的距离（图2（c））。最后，将标本特征移回十字线的中心（图2（a）），并重复对齐顺序。几个循环后，随着载物台旋转，样品特征应在视场中居中。将样本特征重新定位到距十字准线中心大约一半的距离（图2（c））。最后，将标本特征移回十字线的中心（图2（a）），并重复对齐顺序。几个循环后，随着载物台旋转，样品特征应在视场中居中。将样本特征重新定位到距十字准线中心大约一半的距离（图2（c））。最后，将标本特征移回十字线的中心（图2（a）），并重复对齐顺序。几个循环后，随着载物台旋转，样品特征应在视场中居中。
将平台相对于显微镜光轴对中并在光学系统中安装10x物镜后，应将其他物镜（4x，20x，40x和100x）依次对中于平台。具有可居中物镜的显微镜在镜鼻中包含一对艾伦（或类似的驱动器）固定螺丝，可将物镜在其座内横向平移。可以使用制造商提供的物镜对中工具，按照上述圆形工作台的步骤对中每个物镜。载物台和所有物镜的准确居中对于偏光中的定量分析至关重要，并且避免了操作员在载物台旋转过程中看不见视野中的特定特征。完成对中过程后，
在明场模式下很容易完成建立Köhler照明并使显微镜载物台和物镜居中的操作（但如果需要，也可以在偏光模式下对双折射样品进行此操作）。要继续进行偏振组件的校准，请将固定或旋转的偏振元件安装在聚光镜中，或将外壳安装在显微镜基座的光源出口上。许多偏光显微镜都配备了固定偏光镜，该偏光镜的透射振动轴朝东西方向取向，或者站在显微镜前面时从左到右。其他显微镜具有可旋转180或360度的偏振器，并且通常以1至90度的渐变增量安装到框架中。确保偏振器已正确固定到位，并已永久固定在其固定器中或置于零位。在此步骤中，必须将偏振片透射振动轴设置为东西方向。
将分析仪插入显微镜物镜转盘或中间管。几乎所有研究水平的偏光显微镜在矩形框架中均装有旋转分析仪，该旋转分析仪可使元件旋转180或360度。学生显微镜通常具有固定的检偏器（以及固定的偏振镜），以减轻交叉偏振镜校准的负担。旋转分析仪，同时用10倍物镜在载物台上检查双折射样品。当分析仪和偏振器的透射轴以90度角交叉时，应在非常暗的背景下（称为大消光的条件）观察到大的样品双折射（相当于大样品亮度）。）。在交叉偏振照明下，分析仪的振动轴应站在显微镜前，并朝北或朝南或朝后。仅在通过显微镜目镜观察背景强度的同时，才能完成对大消光的关键评估。请记住，在这一点上，大消光仅表示偏振片是交叉的，但不能保证偏振片的透射轴是东西向和南北向完美定向的。下一步将解决后一个方面。
偏振器和检偏器轴校准的校准可以通过以下两种方法之一完成。许多制造商提供了带有研究级显微镜的偏光显微镜定向板，以帮助交叉偏振镜校准。这些板包含一个完美切割的矩形薄双折射晶体，其光轴平行于晶体的长边（见图3）。将晶体平坦地安装在显微镜载玻片上，并专门设计用于圆偏光显微镜载物台。当长轴晶体与偏振器和检偏器透射方位角成45度角定向时（图3（a）），在偏光中观察到最大的双折射。
在这一点上，晶体的双折射被完全消除，应该与背景没有区别。请注意，晶体的轮廓在图3（c）中是人造的，仅包括在演示中以证明长轴与偏振器方位角平行。如果偏振器和检偏器未分别正确地沿东西方向和南北方向放置，则当双折射完全消失时，晶体的长轴将不会与目镜十字线平行。在这种情况下，旋转晶体的长轴，直到与水平显微镜十字准线平行，然后旋转偏振器，直到在目镜中观察到最小的双折射为止。接下来，旋转分析仪，直到晶体双折射完全消失。
如果偏光显微镜可提供Bertrand透镜或聚焦望远镜，则可以使用这些光学组件之一来进行偏振器和检偏器透射方位角的校准。在载物台上没有样品的情况下，穿过偏振镜，然后将目镜望远镜插入观察管中，或将Bertrand透镜摆动到光路中。将望远镜或Bertrand镜头聚焦在物镜的后孔径上。可以在大消光处观察到暗极化交叉（图4（a）），交叉臂的侧面有较亮的区域，该区域应垂直和水平定向。在大多数情况下，极化交叉的水平和垂直分量在视场中心较宽，而在周缘较窄。
偏振交叉的几何形状源于聚光镜和物镜中球面透镜表面的去偏振作用，并且其大小和形状可能会有所变化，具体取决于透镜系统的质量（减少或消除应变）。但是，在大多数显微镜中，偏振交叉的存在是正常现象，通常不能认为是伪影。十字应在视场中居中（当重叠在目镜十字准线上时），并在南北方向和东西方向完美对齐。如果不是这种情况（如图4（c）所示），则应将偏振器和检偏器组合旋转，直到获得正确的方向。如上所述，极化十字的完美校准（因此，对于在光路中有无延迟板或补偿器的情况下进行双折射方位角的定量测量，透射轴为零度的偏振器是必不可少的。如果固定偏振器或检偏器在安装座中未校准，则偏振交叉参考校准也很有用。
偏光显微镜校准的最后一步是调整聚光镜的孔径光阑，以使物镜孔径边缘可见的偏光交叉的较亮外部区域被阻挡。图4（b）显示了正确调整的聚光镜膜片。此步骤极大地改善了显微镜光学系统的消光系数，并且在以正视模式（没有Bertrand镜头或聚焦望远镜）观察时，该视场会显得暗。校准显微镜并校准偏振轴后，即可对双折射样品进行定量分析。
