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荧光显微镜是光学显微镜的一种特殊形式。它利用荧光染料在被特定波长的光激发后发光的能力。感兴趣的蛋白可以通过抗体染色或用荧光蛋白标记而用此类荧光染料标记。它可以确定单个分子种类的分布，数量及其在细胞内的定位。此外，可以进行共定位和相互作用研究，使用可逆结合的染料（例如Ca 2+和fura-2）观察离子浓度，并观察到细胞内吞作用和胞吐作用。如今，借助荧光显微镜甚至可以对亚分辨率的颗粒成像。
荧光的重要特征是斯托克斯频移。它描述了激发光子和发射光子的能级差异。荧光染料发出的光子比激发光子具有更大的波长。这是由于在激发荧光染料之后但在发射光子之前，能量向周围环境释放。产生的波长偏移可以区分激发光和发射光。能量的吸收和发射可以看作是分子种类的特定特征。
荧光显微镜（正置或倒置）类似于普通的光学显微镜，不同之处在于照明是由激光作为单色光或明亮而强大的光源（如水银蒸气或氙弧灯）提供的。此外，它还包含一个激发激发块和一个发射激发块。激发滤光片仅透射能够用其特定染料激发样品的光。样本发出的光在到达检测器之前必须通过发射滤光片。发射滤光片仅对具有不同波长的光（如样品发出的光）是半透明的。
图1：通过荧光显微镜的光路
近年来，LED（发光二极管）也已经用作荧光显微镜的光源。LED发出的光的波长取决于生产所用的材料。但是，在大多数情况下，由于LED通常会在相当宽的波长范围内发光，因此需要激发滤光片。
大多数荧光显微镜是落射荧光显微镜。照明器和物镜位于样品的同一侧，并且光线不穿过样品。除了激发和发射滤光片，这种荧光显微镜还需要一个二向色镜。二向色镜允许特定波长的光通过，而其他波长的光被反射。通常将滤光片和二向色镜插入滤光片立方体中。
图2：激发块的结构
激发光穿过激发滤光片并被导向二向色镜。这将光通过物镜反射到样品。样品中的荧光染料被激发并发射光子。该发射光通过物镜返回至二向色镜。发出的光具有适当的波长并且能够通过。样品反射的激发光无法通过二向色镜，将被阻挡。如果激发光能够通过二向色镜，则当到达发射滤光器时会被阻挡。可以通过检测器测量通过发射滤光片的光。
荧光显微镜中使用了不同类型的滤光片。可以区分带通，长通和短通激发块。带通滤光片会透射一个波长带，而波长更大或更小的光将被阻挡。长通和短通激发块是边缘激发块。长通滤光片透射长波长的光。波长超过某个截止值的光将无法通过。相反，短通滤光片可传输短波长并阻挡长波长。
图3：转基因小鼠胚胎，GFP
图4：染色体的荧光原位杂交。红色：TRITC，蓝色：CY5，绿色：FITC
荧光显微镜已被广泛使用并具有很高的特异性。各种技术可以解决不同的问题，甚至可以规避Ernst Abbe所描述的衍射极限。
分子种类的定位可以通过细胞器（例如细胞骨架或膜）的共染色来确定。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）使得观察标本区域成为可能，而没有来自焦平面外部的信号，并且可以进行光学切片。全内反射（TIRF）显微镜是一种允许观察靠近细胞表面的薄区域的技术。e逝场激发该区域的荧光染料。
观察分子种类动态的一种技术是光漂白后的荧光恢复（FRAP）。对受限区域的荧光染料进行光漂白，可以测量未漂白分子向该区域的扩散。相互作用研究可通过荧光能量转移（FRET）显微镜进行。激发的供体生色团可以将能量转移到受体荧光染料上并激发它。只有将两者紧密结合在一起才有可能。如果这些染料与不同的蛋白质偶联，则只有当蛋白质彼此相互作用时，它们才能传递能量并发出荧光。
允许亚分辨率图像的技术包括受激发射耗竭（STED）显微镜，基态耗竭（GSD）显微镜，单分子和基态耗竭显微镜，然后是单个分子返回（GSDIM），以及光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）。用于这些技术的亚分辨率显微镜也称为纳米显微镜，因为它们可以分辨纳米级的图像。
图5：Pukinje细胞，小鼠小脑皮层的三标记的矢状旁切面。红色：抗calbindin-D28k / Cy3，绿色：抗GFAP / Cy5，蓝色：Hoechst 33258
图6：小鼠组织切片，自发荧光，荧光寿命微染色体（FLIM）
