显微镜物镜上发生经典的Seidel单色透镜像差是球差,会导致标本图像显得朦胧或模糊,并稍微失焦。理想情况下,无像差的物镜将平面波前转换为球面波前,将所有由透镜折射的光波导向球心的公共焦点,以产生高清的图像。
球面像差的影响以两种方式表现出来:图像的中心比边缘更集中在焦点上,边缘的强度相对于中心降低。此缺陷同时出现在轴上和轴外图像点上。
本程序使用小程序左侧窗口中出现的标本图像(通过显微镜观察)进行初始化。在图像窗口下方是一个标记为“选择一个标本”的下拉菜单,用于选择新标本。该透镜形状滑块旨在通过将越来越多的球差引入光学系统来控制程序。向右移动滑块还会引起相应的变化,这些变化与在小程序窗口的中心所示的艾里衍射图样中引入球差有关。同时,强度从点扩散函数的中心峰移到周围的环上,环变得更加突出。这些变化也与applet右侧显示的射线轨迹图相关。
当穿过未校正凸透镜外围的光波未与穿过中心的光束聚焦时,会遇到球差伪像。在透镜中心附近通过的光仅被折射,而在边缘附近通过的光被更大程度地折射,沿光轴产生各种不同的焦点。结果,与通过中心或轴向区域传播的光线相比,外围波的焦点更短(靠近镜头或物镜的后方)。这称为纵向或轴向球差。物镜本身产生的非球面波前或物镜使用不当会产生轴向像差。一些常见的原因是无法维持指定的显微镜试管长度,或者物镜和焦平面之间存在具有伪折射率的物质。
在显微镜下看到的是通过聚焦周围光线而形成的图像,该周围光线被穿过透镜中心部分的光线的未聚焦图像包围(反之亦然)。这是严重的分辨率伪影之一,因为标本的图像散开而不是清晰聚焦。在不或未矫正的镜片中,焦点将在周围光线和轴向光线的焦平面之间的某个位置,该区域称为最小混淆盘(在本程序图中以光轴上的一个点表示)。由透镜或瞳孔的边缘折射的光线(周边光线)具有最短的焦距并产生最小的图像,而在近轴焦点处相交的光线(轴向光线)已开始扩散,并不代表“最佳”重点。
只有正确确定样本和图像的距离,才能校正球差。由于将光学元件引入有限管长显微镜的会聚光束路径而导致的管长不合适,很容易引入该伪影。当使用不正确的“窗口”时,例如非标准厚度的保护玻璃(偏离0.17毫米)或物镜前透镜与保护玻璃之间质量较差的浸没油,也会发生球差。
本程序说明了三个假设的单色光线的放大视图,这些单色光线穿过凸透镜并会聚在沿光轴方向逐渐移动的一系列焦点上(请参见“光线跟踪图”)。可以通过使用“镜头形状”滑块来更改镜头形状并相应调整焦点位置。镜片边缘的外围光线折射最大,其次是中间的折射,然后是中央的光线。最外面的光线产生的较大折射会导致焦点(焦点1;见图1)出现在最小混淆度的光盘前光线产生的焦点越靠近透镜中心(焦点2位于中心,焦点3位于近轴焦平面;图1)。图1中还显示了横向球面像差的量度,定义为距光轴的距离,在该距离处外围光线与近轴焦点平面相交。如图所示,横向像差是在图像平面中测量的,可用作图像模糊的指标。
焦点上的大部分差异是由于球面折射表面的高斯透镜方程的正弦和正切值的等效值近似而产生的:
其中n和n'分别代表空气和构成透镜的玻璃的折射率,s和s'是物距和像距,r是透镜的曲率半径。该表达式确定由半径为r夹在折射率n和n'的介质之间的透镜曲面形成的图像的相对位置。通过将等式包含在孔径角的立方中,可以将该方程式的改进通常称为高阶校正,从而可以进行更精细的计算。与理想球面波的偏离以波的分数表示,其中单个波等于照明光的平均波长。将该偏差称为光程差,该差必须小于四分之一波长,然后才能将衍射受限的物镜视为无像差。
随着物镜数值孔径的增加,盖玻片厚度或折射率的变化变得至关重要,尤其是对于高倍率的干物镜而言,在这些物镜中,管长的微小变化会迅速导致图像质量下降。尽管可以通过各种物镜将球差校正到几乎无法检测到的极限,但必须满足任何给定透镜的光学规格。对于具有高数值孔径的油浸物镜,这通常意味着使用厚度为0.17毫米的盖玻片和波长为546和589纳米的折射率为1.5180(±0.0004)的浸油。使这些条件复杂化的事实是,几乎所有材料的折射率都是波长和温度的函数。
消除油浸物镜中球差的一种机制是,使用物镜前部的半球形和弯月形透镜设计特定共轭点对周围的光学元件。如图2所示,对于在位置P观察并被折射率n的浸油包围的样品,存在一个共轭点(P(1)),以消除前透镜(半球面透镜)中的球差。在这种情况下,从点P发出的光线就像从点P(1)发出一样,离开了半球形前透镜的表面。弯月形透镜的表面半径为P点形成第二个共轭对(P(1)和P(2))。因此,来自样本的光点P最终会像从点P(2)一样射出弯月形透镜,从而消除了透镜组合的球差。
安装在加拿大香脂或类似安装介质中的折射率接近防护玻璃的标本不易出现球差误差。但是,对于安装在生理盐水或其他水性介质中且折射率与防护玻璃明显不同的样品而言,情况并非如此。即使在仅几微米厚的薄水层中聚焦时,也会遇到明显的像差,这些像差会导致点扩散函数出现严重的不对称性,从而导致焦平面上方和下方的分布不均匀。在下面的交互式程序中探讨了这个概念。
就透镜的分辨率而言,球差重要,因为它们会影响沿光轴的点的重合成像并降低透镜的性能,这将严重影响样品的清晰度和清晰度。这些透镜缺陷可以通过限制透镜的外边缘免于使用光阑暴露于光以及通过利用系统内的非球面透镜表面来减少。然而,减小显微镜光学系统中的孔径尺寸的结果是同时减少了进入系统的光量。球面像差通常通过使用玻璃元件(双透镜或三重透镜)来校正)粘在一起。玻璃元件被设计成具有不同形状的凸面和/或凹面,以确保特别是在视野的外部区域处的外围光线和轴向光线成为共同的焦点。
直到最近几年,消色差透镜仅针对绿光进行了球面校正,尽管对两个波长进行了彩色校正。同样,对复消色差透镜进行了球形的蓝色和绿色两个波长的校正,但对三个波长的颜色进行了校正。高质量的现代显微镜物镜可以多种方式处理球差,包括特殊的透镜研磨技术,改进的玻璃配方以及通过使用多透镜元件更好地控制光路的功能。目前,高质量的物镜,平消色差透镜,和四氟化物(但不能接近公差)均已针对四个波长进行了球面校正。
用户也可能无意中将球差引入到校正良好的系统中。例如,当使用高倍率,高数值孔径的干物镜时,保护玻璃的正确厚度(建议为0.17毫米)至关重要。图3示出了强度分布曲线的半峰宽度随防护玻璃厚度的变化。即使使用公差为±10微米的高质量防护玻璃,其半角宽度变化也超过两倍。随着物镜数值孔径的增加(大于0.5的值),特别是对于干式和水浸式镜头,选择正确厚度的保护玻璃尤为重要。
高质量的油浸物镜仅在使用0.17毫米厚的盖玻片时才能发挥性能。为了帮助减轻盖玻片的变化,通常在干燥物镜上包括校正环,以能够调节中间镜片,以补偿盖玻片的厚度偏差。由于在校正项圈的调整过程中焦点可能会移动并且图像可能会产生疑问,因此校正项圈的使用要求显微医师保持警惕,以便使用适当的图像标准重置项圈。此外,在重新聚焦样品时,将附件插入有限管长物镜的光路中可能会引入像差,除非这些附件经过适当设计并带有附加的光学元件。