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尼康显微镜斜照明的结构图


2020/6/26 9:57:56 发布者:admin


当使用传统的透射(透射)明场照明技术在体视显微镜中观察时,几乎透明和无色的标本可能几乎看不见。发生这种情况的原因是,当微小的样品细节衍射的光在中间像面上重新组合时,与直接通过样品的直射光异相四分之一波长,这种经典现象严重降低了明场图像的对比度。


图1-尼康斜相干对比度照明场

但是,如果照明的方向使其来自单个方位角并从倾斜角度照射到样品,则与允许光线直接穿过样品特征时相比,样品中的细节可能具有更大的对比度和视觉清晰度。沿着显微镜的光轴。样品中的相位和折射率梯度会通过衍射,反射和折射来偏转光线,因此只有零阶(未衍射)和一到两个衍射光的边带才能在像平面上重组。这将产生类似于浮雕样的样本图案,该区域具有显示阴影和高光的区域,非常类似于在复合显微镜中使用差分干涉对比(DIC)技术观察到的那样。

图1中展示的是现代立体显微镜照明架(尼康斜相干对比(OCC)直径模型),其设计目的是通过从轴向明场到高度倾斜的偏轴光线的过渡机制照亮标本,从而使透明标本可见在一个非常类似于暗场的计划中该支架包含一个高和低数值孔径聚光镜,可利用整个立体显微镜的物镜放大倍率(通常为0.5x至2x)和数值孔径(0.07至0.21)范围。倾斜照明是通过滑动光阑来实现的,该滑动光阑遮挡光束的中心以产生部分相干的光源,该光源会倾斜地投射到样本上,从而产生高对比度的图像。

样品放置在尼康OCC透湿镜架的玻璃平台上,并且可以通过旋转光圈控制旋钮在明场,暗场或不同程度的倾斜照明下进行照明。在图2中显示了在连续倾斜照明水平上捕获的一系列数字图像,用于半透明的线虫(钩虫;犬小血管瘤)) 标本。如图2(a)所示,未染色的钩虫是半透明的,在明场轴向照明下几乎看不到任何细节。但是,当将滑动膜片旋转到光路中时,可以实现增加倾斜照明的程度(图2(b),2(c)和2(d)),其中最极端的位置与暗场照明非常接近从单个方位角。通过比较图2(a)和2(c)可以最明显地描绘出这种照明支架可能产生的样品对比度变化,图2(a)和2(c)分别是在明场和高度倾斜的相干对比度下产生的。


图2-OCC照明中的钩虫(犬小血管瘤)

尼康斜体显微镜照明支架的主要设计标准之一是能够增强图像对比度(例如使用虹膜光阑可以实现的对比度),同时保持能够与复消色差物镜所显示的相匹配的高聚光镜数值孔径。许多具有平行或公共主要物镜(CMO)设计的体视显微镜都与装有虹膜光阑的照明支架耦合,该虹膜隔板是内置的或作为附件提供的。当前与OCC透照支架兼容的尼康CMO设计立体显微镜包括SMZ25/SMZ18,SMZ1270/1270i和SMZ800N系列。为了增加景深,通常减小光圈孔径的尺寸,这也用于增加透照照明中的图像对比度。不幸的是,减小虹膜光圈的尺寸还使得成像光线更加连贯,并且通过减小物镜的工作数值孔径而损害了显微镜的分辨能力。

倾斜相干对比照明系统将倾斜照明的效果与通过减小聚光镜孔径光阑尺寸而获得的相干增强相结合,并在立体显微镜中创建外观类似于复合显微镜产生的差分干涉对比图像的图像。倾斜相干对比系统使用挡板作为滑动隔膜,而不是使用虹膜孔径隔膜。如果物镜保留了大部分分辨力,则线性光阑机构的行为就像在相同位置的光圈一样。这可以实现,因为照明锥的数值孔径减小了,而物镜的数值孔径没有减小。


交互式教程-倾斜相干对比照明

通过透射光增强立体显微镜的对比度。

尼康斜体立体显微镜系统的照明路径如图3所示,该图也显示了正常明场(透镜)条件下的光路。集光透镜系统将灯丝的图像聚焦到相对于灯和样品光轴成45度角的镜子上。滑动膜片是一个挡板,可以在反射镜的表面上平移,以阻挡通常直接穿过样品的光,从而确保仅使用倾斜光来照亮样品的细节。位于反射镜上方的聚光镜通过将挡板的锐利边缘聚焦在物镜的后焦平面上,从而保持照明的连贯性。

使用该系统,可以保持物镜的整个数值孔径。尼康倾斜系统的优势(相对于其他倾斜照明技术)之一是通过单个调节旋钮(可控制滑动挡板的位置)在明场,倾斜和暗场照明之间轻松转换。挡板移离镜子的情况下,样品的外观与正常明场照明下的外观相同。随着挡板向上移动到镜子的顶部,图像将类似于暗场,并且在这些极端之间,获得了真正的倾斜照明条件。倾斜度易于调整,以适合样本和所需的细节类型。


图3-斜相干对比光路

倾斜照明在许多方面与暗场技术相似,不同之处在于,不是从各个方向以倾斜角度照亮标本,而是仅从单个方位角投射光。已经采用了多种照明方案来提供倾斜的定向照明,以利用体视显微镜观察标本(示例如图4所示)。简单的透湿式底座通常配备有可调节的倾斜镜,以提供一定程度的倾斜照明,但光线不易控制且不能提供均匀的视野。更复杂的显微镜支架(或底座)具有更多的控制可能性,包括不限于单轴的倾斜镜和可以插入光路或从光路中移出的滑动镜组件。

这些技术中的任何一种都可以在各种标本上提供令人满意的出色结果,但是大多数技术都需要相当程度的操纵,涉及照明路径,这通常很难定量分析或复制。立体显微镜中倾斜照明涉及的艺术比科学更多,因此高度依赖于显微镜专家的技能,经验和耐心。已经开发了许多照明方案,这进一步使围绕该技术的问题复杂化,以增强样本对比度。


图4-倾斜/明场立体显微镜支架

考虑到经典复合显微镜通常所描述的倾斜照明技术,可以最好地理解倾斜照明增强原本几乎看不见的无色样品中细节的机理。来自子级聚光镜一个方位角的直射光从一侧照亮样品。倾斜照明通常是通过将狭缝或扇形光阑放置在聚光镜的下透镜和孔径光阑下方实现的,只允许倾斜光穿过光阑的狭窄开口照亮样品。倾斜照明的作用是将穿过样本的光的零阶偏移到物镜孔径的外围。零阶向一侧的移动使得衍射光的一个或多个另外的更高阶(边带)能够被包括在物镜的后焦平面处并且有助于成像。在许多情况下,其结果是光学分辨率的提高,因为第零阶和一些更高阶均有助于成像。另外,该技术还产生具有阴影的高浮雕特征的图像,该图像使样品在外观上为伪三维。

与暗场技术相比,在暗场技术中,所有方位角均以高度倾斜的光进行照明,而非对称倾斜照明所产生的图像的特征高度取决于照明的入射角。由倾斜照明产生的图像在使垂直于入射照明方向的边缘可见的意义上是不对称的,而与该方向平行(或接近)的边缘则不可见。对于相对于入射倾斜照明角度不同方向的两个样本,图5中说明了这一概念。图5(a)和5(b)中的样品由从铝酸镧的薄单晶晶片获得的相同视场组成,一种钙钛矿,通常用作高温超导陶瓷外延薄膜沉积的基质。这些晶体中的孪晶阻碍了薄膜的形成,并可能对所得薄膜的性能产生不利影响。图5(a)中显示的数字图像描绘了当晶体的纵向双轴平行于倾斜入射光线定向时,孪晶畴产生的伪浮雕。相反,当晶体(和孪晶)轴旋转90度时,使其垂直于入射光线(图5(b)),孪晶域变得很明显。这代表了在倾斜照明下观察到的样本取向限制对纹理效果的壮观显示。这些晶体中的孪晶阻碍了薄膜的形成,并可能对所得薄膜的性能产生不利影响。图5(a)中显示的数字图像描绘了当晶体的纵向双轴平行于倾斜入射光线定向时,孪晶畴产生的伪浮雕。相反,当晶体(和孪晶)轴旋转90度时,使其垂直于入射光线(图5(b)),孪晶域变得很明显。这代表了在倾斜照明下观察到的样本取向限制对纹理效果的壮观显示。这些晶体中的孪晶阻碍了薄膜的形成,并可能对所得薄膜的性能产生不利影响。图5(a)中显示的数字图像描绘了当晶体的纵向双轴平行于倾斜入射光线定向时,孪晶畴产生的伪浮雕。相反,当晶体(和孪晶)轴旋转90度时,使其垂直于入射光线(图5(b)),孪晶域变得很明显。这代表了在倾斜照明下观察到的样本取向限制对纹理效果的壮观显示。图5(a)中显示的数字图像描绘了当晶体的纵向双轴平行于倾斜入射光线定向时,孪晶畴产生的伪浮雕。相反,当晶体(和孪晶)轴旋转90度时,使其垂直于入射光线(图5(b)),孪晶域变得很明显。这代表了在倾斜照明下观察到的样本取向限制对纹理效果的壮观显示。图5(a)中显示的数字图像描绘了当晶体的纵向双轴平行于倾斜入射光线定向时,孪晶畴产生的伪浮雕。相反,当晶体(和孪晶)轴旋转90度时,使其垂直于入射光线(图5(b)),孪晶域变得很明显。这代表了在倾斜照明下观察到的样本取向限制对纹理效果的壮观显示。


图5-试样外观的取向角影响

当在几个方向角上倾斜照明观察半透明的山羊毛纤维时,可获得相似但不太生动的结果。当杆状发束的长轴平行于入射倾斜照明定向时(图5(c)),可以看到头发纤维的中央部分和边缘的结构细节。当毛发纤维垂直于照明轴定向时(图5(d)),没有这个细节,并且在两个定向角之间观察到的纤维表观厚度存在显着差异。平行于入射照明定向的纤维似乎比垂直于光源定向的纤维粗得多。

倾斜照明技术提供的明显的三维效果并不代表实际的样品几何形状或形貌,因此不应用于进行样品尺寸的测量。倾斜照明图像的真实值在于揭示样品内的折射率或其他光程差的过渡,从而可以更清楚地理解形态和内部结构。该技术可以应用于在明场照明下看起来几乎不可见或透明并且不能被染色或进行化学或热处理以增强对比度的各种材料。研究活生物体和过程,例如体外受精,玻璃或丙烯酸纤维,化学晶体

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