观察的关键方面(适用于所有形式的光学显微镜)是标本照明的方法及其在揭示感兴趣特征方面的有效性。体视显微镜通常用于反射和反射照明模式下的标本,采用各种光源和配置,策略性地将它们放置在适当的位置。
在许多情况下,反射和透射的光源以有效地揭示感兴趣的特征的方式组合起来,以利用特定的样本特性。这篇综述着重于目前使用的各种各样的技术和设备,以照明用反射光技术观察到的大量样本。用体视显微镜检查的许多标本都是三维的,显微学家需要大量的创造力才能有效地阐明感兴趣的特定细节。图1所示为配备了几种常见反射光照明器的体视显微镜(Nikon SMZ1500),可用于此和新型尼康体视显微镜。该配置中包括环形灯,同轴照明器和分叉的光纤导光管,它们代表了三种用于体视显微镜的有用,用途广泛的反射光照明源。
在体视显微镜照明所面临的挑战与使用传统相机和镜头组合进行近摄或微距摄影时所遇到的挑战之间存在许多相似之处。体视显微镜使用的较低放大倍率与使用与扩展装置或专用微距镜头相连的传统相机镜头可能产生的再现率重叠,并且可以使用任何一种设备对许多物体进行有效成像。事实证明,许多在显微显微摄影中有用的照明技术都可以与体视显微镜配合使用,反之亦然。
体视显微镜技术通常与为常规光学显微镜中使用的“标准”复式显微镜开发的技术相差很大。对于许多照明策略来说尤其如此。对于复合显微镜使用的大多数图像对比度增强方法,基于科勒原理的主要光学配置和照明策略均保持不变。通过添加辅助滤镜和其他光学组件(例如用于差分干涉对比(DIC)的Nomarski或Wollaston棱镜,偏光镜和检偏镜(通常具有四分之一波长或全波延迟板)(用于偏振光技术),相板(用于相差),以及用于荧光激发和发射的干涉滤光片。在体视显微镜中,其工作距离更长,数值孔径更小,放大倍数更低,因此其中许多技术都不适用。
对于体视显微镜旨在容纳的各种标本,没有一个照明策略是正确的选择。可以通过各种不同的机制,并采用几乎无限数量的变体或技术组合,对每个受检样品进行照明。对于给定的标本或物体,尽管可能有几种可能的照明方案产生可接受的结果,但可能会发现一种方法,经过仔细改进后,会产生出众的结果。
在选择适合视觉观察,显微照相或数字成像需要的照明策略时,应仔细考虑样品的特性。通常,样品的不透明度是重要的特征,它将决定应使用的基本照明类型:反射型(反射型),透射型(透射型),或者在某些情况下,两者兼而有之。不透明标本通常从上方(用反射光)照亮,方向从同轴(平行于显微镜光学器件)到高度倾斜(与光轴成90度入射角)不等,以显示感兴趣的特征。一旦确定样品的不透明性建议使用特定的通用照明器类别,则应考虑许多其他因素,以进一步完善可能会产生所需结果的基本照明方案的特定变化。图2说明了使用反射光进行标本照明的各种潜在途径。一个简单的钨(或钨-卤素)照明器(显示为相对于样品表面的角度不同)以及一个安装在物镜主体上的环形灯提供了与显微镜光路无关的照明。在仪器的剖面图中显示了在显微镜光学系统中起作用的同轴照明器的照明路径。
不透明的标本常受益于反射照明,而半透明和透明的物体通常会产生结果,并且透射照明会有所不同(明场,偏振,倾斜或暗场)。但是,并非总是如此,半透明的物体可能会受益于至少一部分照明来自放置在其上方的光源。除了不透明度,在规划照明策略时还应考虑许多其他因素。这些包括标本的基本物理特征,检查所需的信息类型,数字或照相成像要求以及如何利用这些信息。
样品的几何轮廓,形貌和形态都是选择和配置照明方式的重要因素,这些方式可以揭示所需的信息。高度立体(具有高浮雕)的标本应与平面,平滑甚至高度抛光的标本以不同的方式照明。例如,高角度照明可能会在粗糙表面上产生阴影,从而掩盖了可能很重要的表面细节。直接从粗糙表面的样品上方发出的高度散射光可以均匀地照亮“峰”和“谷”,但是如果需要纹理信息来表征对象的光滑度,平坦度或其他地形变量,则此类照明可能不匹配。
在影响适当照明方案选择的其他标本特征中,组成至关重要,并且直接影响表面和内部反射率。金属,塑料,陶瓷,玻璃和天然材料(例如矿物或宝石)在不同光照条件下的外观都表现不同。一些标本可能具有特定的环境要求,从而影响它们对各种光源类型进行照明的适用性。例如,在观察过程中,活的水生生物可能需要浸入水中。通常在覆盖有油或其他保护涂层的情况下研究金属物体,或者对其进行高度抛光。这样的样本可能通过将一个或多个光源的图像反射到显微镜物镜中而产生伪影。这些反射通常会产生眩光并模糊重要的细节,或者将注意力从正在观察和成像的重要元素上转移开。最困难的样品甚至可能需要特殊的照明技术才能使其可见。
在许多情况下,必须考虑的另一个重要因素是样品材料对热还是紫外线敏感,这两者都是某些照明源的重要发射成分。光敏性可能需要限制照射样品的时间。当可用于观察的时间受到限制时,可能的照明技术的选择就变得更加受限制。如果正在研究样本以观察或记录瞬态或短寿命现象或特性,则会发生类似的问题,在这种情况下,照明强度可能会成为选择照明策略的主要因素。
显微镜检查的目的或所研究样品所需的特定种类的信息通常会极大地影响为照明选择的策略。可能有必要采用各种方案来揭示细节,更大的功能或总体特征。取决于必须从给定样本获得的信息,所采用的照明技术可能非常简单,或者更加复杂,并且可能需要多种技术组合。例如,如果样本的唯一重要属性是其颜色,则所采用的照明在物理上可能非常简单,并且仅需提供准确的颜色再现即可。如果颜色确定和断裂图案分析都很重要
摄影或数字成像要求是选择样本照明时必须考虑的另一个重要因素。如果使用传统的胶片相机来记录图像,则光源的色温(以及可能的其他光谱特性)必须适合于所用的胶片,以便准确地显示样本。照明强度还必须足以确保所用相机/胶卷组合的曝光时间合理。这在制造,工业或临床实验室环境中尤其重要。数字图像捕获系统尽管在成像设备(数码相机)上进行白平衡调整可以使相机对各种光源的色彩特性做出响应时具有相当大的自由度,但它们需要与胶片系统有许多相同的考虑因素。如果要进行视频记录,照明强度可能会更大。
显微镜和标本与照明系统的有效匹配通常在很大程度上取决于将使用该系统的操作员的技能和培训,以及将使用该系统的环境或类型。具有灵活性以适应广泛应用的许多照明系统需要熟练的操作员,他们需要大量的培训和专业知识。在制造或工业环境中,相对不熟练的操作员可能会在长时间轮班期间利用显微镜进行组装或生产检查,因此将预设为固定配置的较简单的照明系统使用。这种简单性将提供较少的操作变量,并在操作员之间和每个班次之间提供更高的一致性。但是,这种策略是唯一可行的,在被检查的物体或样本具有相当均匀性的情况下。任何独特或不寻常的照明情况都可能需要更灵活的照明系统和更熟练的技术人员。
设计用于必须有效执行重复操作的任何环境中的照明系统的另一个需求是组合式显微镜和照明系统的人体工程学特性。舒适性和易用性无疑在显微镜的任何严肃应用中都非常重要,尽管可能证明这种担忧的工作环境是临床实验室。在临床实验室情况下,疲劳的或难以使用的照明配置可能会降低关键样本分析的准确性,即使是由熟练的显微镜专家进行的情况下。
指示透视照明的照明角度(或多个角度)极大地影响了所研究样品的外观。对于所有被照亮的物体,没有一个单一的角度是“正确的”,并且光源位置通常通过实验确定。相对于观察方向(或光轴),改变光线照射样品的角度,会在所强调的特征或特性上产生明显的差异。
被研究样品的性质将决定显示所需特性的照明角度。在对表面粗糙的样品进行照明时,从同轴(垂直)到略微倾斜的照明角度的小幅调整都会强烈增强表面纹理。相反,直到光源高度倾斜,接近平坦的表面(具有细小的细节,例如小划痕)可能不会显示出照明角度变化带来的明显影响。将光轴偏离近90度移动,以使波前仅掠过样品表面,这有时有利于揭示细微的表面细节或当光从更直接的角度照射样品时看不见的特征。如果使用多个光源,它们可以以不同的角度定位,以结合倾斜和直接照明的效果。没有规则可以预测所有样品的照明角度的影响,而受控实验可能是针对给定要求开发照明方案的方法。
与被照亮的视野区域相比,光源的大小强烈影响整体照明效果。在一般意义上,较小的光源可以被认为是更具方向性,具有更高的相干性,并且可以产生具有高亮亮点,暗阴影和清晰锐利边缘的更高对比度图像。较大的光源通常将提供方向性较低的照明,从而导致图像在明暗区域之间的对比度较低。另外,这些图像将具有不是很暗的阴影区域,并且较柔和的边缘描绘了亮度不相等的区域。
光源通过其设计可以具有镜面反射或漫射特性,尽管此特性与照明器的尺寸及其与样品的距离相互关联。包括透镜的照明器可以聚焦到更连贯,更紧密的光束中,从而产生镜面(或更硬)的照明。其他光源(例如,荧光环形灯)产生的光均匀,扩散,柔和,部分是由于灯本身的特性,部分是由于显微镜物镜上的环形灯位置。图3给出了由小镜面光源(光纤光导管)和相对大的荧光环形灯照明产生的样品外观对比的示例。扩散配件可用于修改镜面光源的输出,但是,除非扩散器相对于被照亮的样本较大,否则它们不可能在小光源上产生理想的效果。关于这些变量在光源设计和实现中存在相当多的困惑,但是要考虑的重要因素是相对于样本的照明方向。方向性不仅取决于光源设计,还取决于其尺寸和与样品的距离。
如先前所讨论的,利用多个光源在为各种样本实现所需的照明效果方面提供了额外的灵活性。举例说明多光源策略的一种照明装置是将一个光源与样品表面成低角度放置(高度倾斜的照明)以强调地形和表面纹理,而另一种光源则更靠近光轴以部分照明阴影并揭示这些领域的一些细节。在一般摄影的术语中,这些照明源将被称为主(斜)和填充(同轴)光。平衡两种灯的相对强度(或照明比)通常需要进行一些实验才能获得效果。
在制定用于体视显微镜的反射照明策略时,另一个重要的考虑因素是显微镜物镜的工作距离,这会严重限制反射照明器定位的灵活性。该距离是在物镜和样品之间测量的,覆盖范围从几厘米(对于较低的光圈和放大物镜)到只有几毫米的数值孔径物镜。在普通摄影中熟悉的摄影棚环境中,摄影师在将灯光摆放在几乎达到所需照明效果所需的任何布置中的自由度很大。相比之下,体视显微镜物镜下“工作室”的大小只能测量几厘米或几毫米,
较小的工作空间不仅限制了可使用的照明器类型,而且限制了光线可以“到达”标本场的角度范围。物镜前透镜和样品之间的有限区域可能迫使照明器偏离所需的轴外距离,并经常防止消除粗糙表面样品上的阴影。图4示出了这样一种情况,其中短的目标工作距离将照明限制在一个高度倾斜的角度,并且阻碍了均匀照明的实现。在这种情况下,提供更有效照明的有效方法是在样品的与光源相对的一侧放置小镜子或其他反射面。图4中所示的简单照明器类型能够以比图中所示更长的工作距离提供足够的照明。但是,在较短的工作距离上,当光源以较小的角度(更靠近显微镜的光轴)放置时,显微镜的物镜会物理上阻碍标本的完整照明。根据仪器配置可用的工作距离,可以使用多个灯和反射器,并且它们的相对距离和角度位置会有所变化,以实现所需的直接和间接(反射)照明比例。当光源以较小的角度(更靠近显微镜的光轴)放置时,显微镜的物镜会从物理上阻碍样品的完全照明。根据仪器配置可用的工作距离,可以使用多个灯和反射器,并且它们的相对距离和角度位置会有所变化,以实现所需的直接和间接(反射)照明比例。当光源以较小的角度(更靠近显微镜的光轴)放置时,显微镜的物镜会从物理上阻碍样品的完全照明。根据仪器配置可用的工作距离,可以使用多个灯和反射器,并且它们的相对距离和角度位置会有所变化,以实现所需的直接和间接(反射)照明比例。
在需要同轴照明的情况下,环形灯或同轴照明器可能是可行的解决方案,但是这些光源也具有的工作距离和角度。在极长的显微镜工作距离下,环形照明可能会变得过于分散,强度不足。相反,在非常短的工作距离下,标本将位于光锥的较暗的中心区域,并且照明不均匀。环形照明器的工作范围如图5所示。请注意,这种类型的照明源可以很好地定义照明锥。
在体视显微镜中,两只眼睛的视角略有不同,每只都相对于显微镜光轴成5至7度角。两只眼睛的视角差异是使大脑产生三维图像感知的主要因素。因为从样品表面反射的光的反射角等于照明光线的入射角,所以一只眼睛观察到的反射可能与另一只眼睛看起来有所不同。此外,重要的是要记住,在记录图像时,进入相机系统的光只能通过显微镜中的单个通道传播,从而产生样品的稍微偏轴的视图。可以控制照明器放置并进而影响为满足照明要求而选择的策略的另一个因素是,许多显微镜照明器中提供的钨丝灯或钨卤素灯会产生大量的红外辐射。这种不可见的辐射会在标本平面上产生大量的热量,这些热量可能无法被活生物体所吸收,并且可能会使某些材料变形甚至融化。在研究热敏感样品时,将灯放置在更远的位置是减少热量输入的一种策略。如果重新放置灯不是一个充分的解决方案,或者不是一个选择,则应考虑使用旨在减少红外辐射的照明组件。
由于灯本身的物理位置与光输出点相距一定距离,因此某些照明器设计(例如光纤设备)的性质可减少样品发热。但是,发光纤维端仍可能传递大量热量。作为减少此问题的进一步措施,许多照明器都具有红外截止滤镜(也称为热滤镜或热镜),以减弱红外透射。替代地,光源可以具有结合有双色反射器(称为冷镜)的投影仪型灯,该反射器反射可见光以进行照明,同时允许红外光穿过反射器并远离光路。
当在体视显微镜中使用非常低的放大倍率(1-3x)时,实验室中的环境光条件可能足以观察,并且可以认为是基本的照明系统。使用室内照明进行显微镜照明的主要缺点是缺乏对光的强度,位置和色温的控制,对于任何严肃的应用,依靠这种光源可能是不现实的。
大多数体视显微镜制造商提供至少一个基本的白炽灯(钨或卤素钨灯)照明器,这些照明器可以直接安装在聚焦支架上,或者通过可弯曲的臂固定,从而可以方便地固定在支架上。这些简单的照明器有几种变体,如图6所示。通常,小型白炽照明器采用10或20瓦的钨丝灯或石英卤素灯,可提供足够的光量以观察各种各样的样品。更高级的体视显微镜支架配备有用于内置反射光源的外壳,该外壳提供相似的照明,并具有更高的便利性。
白炽照明器通常很便宜,需要的空间很小,并且很容易配置。它们的主要缺点是低功率灯提供的光量有限,通常不足以正确地照亮标本的所有必需区域,尤其是在需要显微摄影,数字或视频成像时。第二个问题是这些照明器产生的光的定向性强,并在某种程度上呈镜面反射,这会导致不良的阴影。尽管不能完全克服强度限制和覆盖的小面积,但是白炽照明器可以与反射镜或漫射器结合使用,以在一定程度上改变光束的扩散特性。当此类光源靠近样品放置时,对于某些热敏材料,传递到照明区域的热能可能太大。但是,总的来说,简单的白炽灯光源耐用,实用,并且非常适合学生显微镜,现场运输和使用,或者简单的工业检查或组装。
在可用于体视显微镜的所有照明光源中,光纤照明器可能是用途广且受欢迎的光源。提供许多不同的光源设计,光纤类型和配置以及附件。可以配置光纤照明系统以满足几乎所有应用的严格要求。光纤照明器通常由高强度钨卤灯供电,是相对明亮的光源,通过使用适当的滤光片,可以对视频或静止图像进行色彩平衡。光纤系统配置为冷光源(通过添加红外滤镜),比起基本的白炽灯照明器,它更适合于研究热敏性样品。
光纤环形灯是基于光纤的照明器中使用广泛的配置之一。固定在显微镜物镜周围的固定装置消除了调整过程中的任何变量,并确保照明在每个样本之间均具有一致的质量并具有高可重复性。因为照明路径几乎与显微镜的光轴重合,所以观察区域被均匀照明并且几乎没有阴影。这些特征可能是有益的,但不适用于纹理研究,因为定向照明更有利。但是,环形灯非常普遍地用于电子装配和质量控制应用中,包括检查具有连接组件的印刷电路板上的焊点,可以在其他类型的照明中投射阴影。环形光提供的漫射照明几乎在同轴上,消除了阴影,同时仍提供了足够的对比度以进行视觉检查。
环形光源的其他常见应用包括动物手术和解剖标本的研究。环形灯提供的照明足以适合大多数不透明的物体,但不是观察许多标本的首选技术,尤其是用于图像记录的目的。光纤束环单元有不同的尺寸,并带有各种附件,例如扩散器,偏振器和复曲面透镜,可用来改变光分布。图7中显示了一个光纤环形灯(带有局部剖开的部分装配结构细节),该环形灯安装在普通主物镜(CMO)体视显微镜的物镜上。
如果一个特定的样品在改变照明的角度和方向时需要更大的灵活性,或者与固定环形灯相比需要更多的图像对比度控制,则可能的解决方案是使用与卤素钨灯光源耦合的柔性光导。这些指南既可以是单个导光管,也可以是双重或三重组件,例如分叉导光管(一个光输入到两个输出;图8)。图8中显示了各种光导和附件,包括光纤环形灯。几种光导管设计提供了极大的灵活性,增强了它们在照亮难以到达的区域(例如某些机器安装中出现的区域)时的效用。必须将这些光导管夹紧或松动以保持在原位,但是,
半刚性的光导无需夹持即可保持其形状和位置,并且可以与光源底座一起作为独立单元使用。通常,由于光导管易于定位,因此可提供简单的照明控制,并且可以将滤光器添加到光源中,以实现色彩平衡,减少热量,偏振和其他目的。可以使用用于光导管的聚焦透镜,该聚焦透镜可将照明集中到一个较小的光束中,从而提高强度并导致图像记录期间的曝光时间缩短,或者视频记录时的噪声更少。
光纤光源是镜面的(特别是带有聚焦透镜的)和定向的,并且可能会产生不均匀的照明,这需要仔细放置它们,以避免在照明区域产生不良的阴影效果。通过添加一个或多个附加的光导管(例如双(分叉)导管系统),可以将两个光纤光源用作主光源和补光灯,以消除阴影并通常提供更均匀的照明。可替代地,为了强调期望的特征,可以独立地引导光导管以选择性地照亮不同的区域。使用多个光管提供了一种实现更均匀照明的技术,同时保留了有时需要的镜面,更高对比度的外观,而使用更漫射的光源无法获得这种效果。
为了提供无阴影的漫射照明,荧光环形光可能不相等。这些光源在许多方面与光纤环形灯类似,它们并入一个环形荧光灯管,作为大型,漫射,近轴光源,产生相对较低的对比度图像。荧光环形灯的主要应用是电子装配和工业检查任务,在这些应用中,易用性,低热量输出,均匀照明和一致的色温是理想的选择。荧光灯管的寿命很长,在需要更换之前可能会延长数年。然而,这些灯有几个缺点,使得荧光照明器比图像记录更适合于视觉检查。有些型号会出现高频闪烁,虽然肉眼看不见,但可以通过快速的强度波动在视频图像中产生伪像。另外,由荧光灯产生的发光光谱在绿色波长区域中表现出尖锐的峰值,并且在某些情况下,它们表现出光谱不连续性,这是使这些光源与彩色膜的响应匹配变得复杂的因素。
旨在使入射光路尽可能靠近光轴而不是同轴放置的光源被分类为近垂直照明器。在Greenough设计的体视显微镜中,镜子直接位于显微镜主体底部的两个眼睛路径之间,并将来自光源的光几乎垂直地向下引导到样品表面。目前,Greenough设计的尼康体视显微镜包括SMZ745/745T和SMZ445/460系列。
在通用主物镜(CMO)设计中,在物镜和变焦镜体之间放置了一个镜子(与两个眼睛路径的偏心距离相同),因此三个光学路径在标本平面重合。在这种设计中,物镜除具有图像形成功能外,还有助于聚光。当前的CMO设计的尼康体视显微镜包括SMZ25/SMZ18,SMZ1270/1270i和SMZ800N系列。图9说明了两种(Greenough和CMO)体视显微镜设计的照明和成像光学路径。
垂直照明器通过增加一个半反射表面来提供真正的同轴照明,该表面以与光轴成45度角的方式放置在显微镜物镜下方。反射镜将与光轴成直角的照明器发出的光向下引导至样品,同时允许从样品反射的光通过显微镜光学系统返回。在体视显微镜中,通常使用半反射镜来执行分束功能。为Greenough显微镜制造的照明器必须设计成适应每个眼睛的路径(彼此成特定角度),并且可以结合成角度的光学元件以满足这一要求。对于单光路,例如显微显微术中使用的光路,反射器可以只是一块玻璃。
垂直照明器可以在光源和半反射镜之间结合聚光镜或扩散器。在聚光系统中,来自光源的光线以类似于反射光科勒照明的方式聚焦。从分束镜反射后,照明光线会聚在物镜的出射光瞳(后孔径)处。这种类型的系统会最大化照明路径的有效数值孔径,从而产生具有相对较高的对比度,出色的分辨率和良好的微小表面细节再现效果的图像。
为垂直照明而设计的系统通常在反射镜之前的光路中放置一个扩散元件(而不是聚光镜),其照明数值孔径较小。但是,这些设计更易于对齐,并产生对比度较低的图像,且阴影较少。尽管聚光轴向照明对于需要评估镜面的许多任务非常理想,但细小的表面细节并没有像聚光镜系统那样好解决。除了研究生物和医学样本外,这些应用还包括CD-ROM表面和硅片的检查,小零件上的字符读取以及印刷电路板上的焊盘成像和组件检查。可以配置垂直照明器,以便可以将简单的照明器或光纤系统用作光源。定制照明器通常耦合到特定尺寸的光纤导管,或者耦合到设计为特定照明器的附件的多分支光纤导管。
同轴的照明器与同轴垂直照明器在概念上相似(在概念上),并在标本照明特性方面产生可比的结果。但是,主要区别在于同轴照明的照明路径位于显微镜的光学系统内,而不是显微镜和样本之间。可以将这种技术描述为通过透镜照明,因为体视显微镜的主要图像形成光学系统以其自身的聚光器的方式发挥作用,其方式类似于经典的金相显微镜的功能。该技术的主要优点是照明系统的数值孔径与物镜的数值孔径一致。随着体视显微镜的变焦镜中放大倍率的增加,数值孔径也随之增加,用于成像和照明途径。这种表现可以通过增加放大倍数来抵消图像强度的损失,这是其他照明技术(例如简单的垂直照明)的特征。因此,在整个变焦光学系统的放大倍率范围内,通过目镜的视场都同样明亮。
同轴照明器位于体视显微镜中(如图1所示)在变焦主体上方,双筒镜筒和摄影设备适配器所用的辅助分束器下方。图10是一个典型的同轴照明器和显微镜变焦镜体的剖视图,为清楚起见,其他组件已被移除。通过放置半反射镜,光线可通过两个独立的路径和变焦系统中的透镜系统(分别用于左右眼)。利用偏振组件来消除来自光学元件和其他眩光源的内部反射,这会降低图像对比度。主偏振片位于光源和反射镜之间,以偏振进入变焦主体的光。位于半反射镜上方的检偏镜(或辅助偏振片)可在到达目镜之前消除不良反射。为了使从标本反射的图像形成光通过上偏振镜到达目镜或相机附件,在公共镜头的前透镜上方安装了一个用作消偏振镜的四分之一波长延迟板。主要目标。在使用中,可以将相位差板旋转到一个角度位置,以确保针对正在研究的样本优化图像的亮度和对比度。用作去偏光镜的透镜安装在通用主物镜的前透镜上。在使用中,可以将相位差板旋转到一个角度位置,以确保针对正在研究的样本优化图像的亮度和对比度。用作去偏光镜的透镜安装在通用主物镜的前透镜上。在使用中,可以将相位差板旋转到一个角度位置,以确保针对正在研究的样本优化图像的亮度和对比度。
配备同轴照明器的显微镜的目标应用与垂直照明器的目标应用相同,包括集成电路和半导体晶片的检查,金属和材料分析,以及需要均匀照明抛光表面的任何任务。产生的同轴光对于粗糙表面或未与光轴成直角放置的表面不是理想的选择。与照明轴成直角的表面在图像中显得很亮,而其他方向则显得很暗,因为光被反射离开了成像路径。同轴照明技术的这一特性可以有益地应用于抛光或珩磨表面的缺陷分析。
同轴照明器的显着局限性是对可以采用的低显微镜放大率的限制。对于视场大小接近有效物镜孔径直径的放大倍率,从视场边缘反射的照明可能无法进入变焦主体。结果,照明在图像边缘处的强度将显着降低(“下降”)。另外,可能会导致与该限制有关的其他图像问题,并且根据显微镜的特性,可能无法实现低于2x到3x的人体放大倍率。使用同轴照明器的另一个考虑因素是,照明器模块本身可能会添加一个放大倍数(可能是1.5倍),该倍数乘以基本显微镜的总放大倍数,
显微镜照明的新技术之一,尤其是体视显微镜的照明技术,是基于白色发光二极管(LED)的。相对较新的技术发展是,发出白光的二极管源已在机器视觉应用中得到认可,并且正越来越多地应用于显微镜。现在,有几家公司销售带有白光LED的环形灯,这些白光灯具有不同的变化,包括点聚焦,漫射和为短于或长于正常工作距离而优化的版本。还可以使用其他基于LED的照明器配置,包括聚光灯,背光板,线性阵列和漫射轴向照明器。图11示出了结合有发光二极管阵列的环形照明器的构造细节。
发光二极管具有作为冷光源的优势,并且大多数设计在其极长的使用寿命内具有恒定的光谱输出。照明设备的供应商对LED进行40,000小时或更长时间的评估,其使用寿命可能超过100,000小时(相比之下,卤素灯的典型寿命约为1000小时)。由于这些光源的使用寿命长,因此它们基本上不需要更换,制造商可以选择密封光源和相关的光学器件。这在许多应用中可能是一个显着的优势,因为在拆卸照明器以更换灯时节省了时间,而且在维护后显微镜部件的重新调整通常很繁琐。
当前的白光发光二极管的一个重要问题是它们的强度相对较低,如果需要直接的目视检查,这可能将其应用限制在体视显微镜中的较低放大倍数上。对于在胶卷上的记录或通过数字捕获,可以通过增加曝光时间在某种程度上补偿低强度。当前可用的白色二极管光源的另一个缺点是,输出色温不易过滤以改变光谱特性。之所以会出现这种效果,是因为许多LED不会产生真正的红绿蓝输出,该输出可以通过过滤以直接的方式进行整形。
发光二极管本质上是单色装置,其颜色由在其构造中使用的半导体材料的带隙确定。在早期的红色发光器件之后,开发了能够生产橙色,黄色和绿色LED的材料。但是,直到产生高亮度蓝色和紫外线波长的半导体材料的新发展,产生固态白光在技术上才变得可行。大多数白光LED由被磷光材料包围的发射氮化镓蓝光的半导体管芯制成,当被蓝光激发时,该磷光材料发出一系列更长的可见波长。磷光体的发射以黄光为主,通过添加剂混合与互补的蓝色结合,产生白色外观。用于产生表观白色输出的其他技术包括以适当的比例混合来自两个尖锐的单色互补光源(双色LED)或三个单色光源(三色LED)的颜色,以实现对白色的感知。波长的组合可以产生具有较高色温的“白”光,该色温在适合光学显微镜应用的范围内。
类似于荧光灯管的机制,另一种实现白光发射的方法是使用一种荧光粉,该荧光粉发出的可见光波长范围广,可产生宽光谱的白光输出。这种类型的LED通常依赖于半导体材料,该材料在紫外光中发光以激发磷光体,并且该器件的整个可见光输出是二次磷光体发射的结果。据报道,LED照明器具有日光色温(约5500 K),但其其他一些光谱特性可能不容易与胶卷的响应相匹配。结果,这些LED可能更适合与数码相机系统一起使用。对于二色和三色设备尤其如此,
固态照明源的众多优势之一是相对较低的功耗要求,从而使这些设备能够在合理的时间内用电池供电。这一优势极大地增强了LED供电显微镜在现场应用中的实用性。通常,LED照明器使用1至3伏的电源以10至100毫安的电流运行。利用LED的环形照明器应表现出与光纤和其他环形照明器相同的一般性能,并且它们的许多优点似乎在显微镜应用中具有很大的潜力,尤其是随着时间的推移而不断改进。随着LED的发展,使用LED的替代照明器配置在与体视显微镜配合使用方面的灵活性应具有几乎无限的潜力。