光学像差-焦点深度和球面像差-Java程序
显微镜中看到的每个点光源的图像是由光波的相长和相消干涉形成的,这些光会无限远地离开物镜在有限管显微镜或物镜中的后孔(而不是物镜后孔)。校正的显微镜。如我们的《轴向分辨率和景深》交互式Java程序中所述,无像差光学系统会在不同的焦点级别上产生点源的对称衍射图像。
本程序将初始化以显示无畸变的子午线截面,该子午线截面是从位于折射率为1.33(通常在水溶液中找到)的样品层中深度(d)处的点光源的计算出的点扩展函数(PSF)得出的),并用虚拟显微镜物镜成像。“样本层深度”滑块用于通过一系列样本深度来转换点扩展函数。
由点光源产生的艾里衍射图的横向分辨率是在光学显微镜中的中间图像位置的单个焦平面内定义的。当物镜的孔径函数不均匀时,或者在球差的情况下,离开透镜的波前不再是球面的,其中心位于图像平面中的焦点。相反,波前以取决于像差和/或图像滤波器的性质以及光学系统中存在的条件的方式失真并且偏离理想行为。在中间图像平面上,点扩散函数产生不对称分布,其中中心峰与周围环之间的强度比发生了移动,后者变得更加突出。显微镜物镜中的球差。
实际上,对于受球差影响的透镜,点源的衍射图像在中间像平面的上方和下方周期性地延伸成三维图案,该三维图案从中心沿光轴不对称地扩展和扩展。使用具有球面像差的高数值孔径物镜,沿着显微镜的光轴在焦平面附近截取的横截面如图1所示。很明显,衍射图像在准确焦点(近轴焦点;上下焦点)上方和下方均不对称。图1)。当点源的图像快速聚焦在近轴焦点的上方和下方时,可以特别清楚地看到截面衍射环的不对称性。
确定哪个是产生“最佳焦点”的级别不是一件容易的事,而且很容易误解焦点级别。该结果通常会导致关于实际标本结构的错误结论,从而产生图像,包括错误的高分辨率感。在存在球差和/或散光的情况下,最大对比度可能并不表示期望的聚焦,这种误差会与定期的标本混在一起。此外,由球差引起的畸变不仅会影响图像质量和保真度,从而影响标本的解释和测量,而且还会影响共焦和其他成像模式的效率,在这种模式下,显微镜光学器件用于缩小图像以获得衍射。 -有限的照明点。
对于安装在加拿大香脂或类似安装介质中且折射率接近盖玻片的标本,使用油浸物镜时盖玻片的厚度不是主要问题。但是,对于沐浴或固定在生理盐水溶液或其他水性介质中的标本,介质的折射率与盖玻片的折射率显着不同,并且球差会变得很明显。图2说明了通过图像点(在中间图像焦平面中)的大小和强度分布的变化,随着对具有浸入式油镜的安装在水性介质中的样品的渗透增加。
在图2中,强度分布的变化表示为中间像平面上的计算点扩展函数,随着平面复消色差油浸物镜对水介质的渗透增加,强度分布发生了变化。图2(a)显示了在零微米渗透深度处的点扩散函数,而图2(b)显示了在四微米深度处的分布。应该注意的是,这些功能中的峰值强度已经标准化。实际上,随着强度图的基础变宽,强度将急剧下降。在水-盖玻片的界面处,会产生球差,这会将外围光线的焦点移到近轴光线的最佳焦点上方。应该考虑这种感应球差对像点的影响,
为了补偿油性物镜在水性介质中的行为,制造商推出了经过校正的水浸物镜。尽管这些物镜无法提供与其油浸式对应物相比可用的高数值孔径,但它们确实克服了与浸入水性介质中的样品的折射率不匹配所引起的像差。有了好的物镜,现在可以聚焦在大约200微米的水性介质上,并且仍然保持出色的光学校正。
球面像差也会通过修改后的光圈功能而产生,尤其是在采用将其他光学组件放入显微镜光路中的对比度增强技术时。一个很好的例子是微分干涉对比(DIC)棱镜的意外失配,其中棱镜的预期剪切力和数值孔径与物镜的预期剪切力和数值孔径不匹配。次级聚光镜,显微镜载玻片(和/或其他标本容器)或物镜之一在应力双折射的情况下可能会引起其他问题。显微镜光路中的对准问题也可能会改变光圈性能,因为需要聚焦通过屈光组织层或偏振显微镜中不存在矫正功能。
通常对现代显微镜光学组件的像差进行校正,以满足特定类别光学器件的一组严格的规格要求。但是,这并不能避免在使用或以不合适的方式使用这些组件时损坏物镜或其他显微镜镜头。对于关键的显微照相术,显微镜学家必须特别注意所有显微镜组件的对准和完整性,包括物镜/聚光镜组合,光源,盖玻片厚度,浸没介质,管长以及玻璃表面的整体清洁度。浸入油中的微小水滴或油滴,污迹斑片或气泡,以及聚光镜或物镜孔径的不均匀照明,都可能使标本发出的光的波前畸变,甚至破坏最佳光,