当使用具有高数值孔径的平面复消色差或萤石物镜时,对薄切的固定组织切片和粘附在玻璃基板上的活细胞的显微镜研究通常会产生出色的高分辨率图像。但是,当前大量的生物学研究涉及活组织内部的细胞动力学研究,其中重要事件可能发生在标本的深处,远离盖玻片。尝试使用常规的油浸技术在距标本盖玻片一微米的距离处对细胞的细节和活动进行成像的过程中经常会出现伪影,包括严重的光学(球面)像差。使用水代替油作为浸入介质,是克服像差问题的有效方法,并且经过高度校正一些制造商已经将水浸物镜引入到涉及活细胞和组织的应用中。
仪器和软件系统的最新技术进展,再加上新的荧光染料探针的开发,相结合,大大促进了活细胞和组织研究领域的知识前沿。用于这些研究的主要光学和定量成像技术包括共聚焦和多光子显微镜,微分干涉对比(DIC)),以及传统的宽视野落射荧光方法。活细胞研究中的一个基本问题是,适当的维护需要将细胞用适当的营养生理溶液包裹在一个小室或容器中,并且感兴趣的区域或事件通常位于距盖玻片50至200微米以上的位置。几位研究人员讨论了采用高数值孔径油浸物镜来成像与平板玻璃不直接相邻的焦平面的局限性。识别出的最严重缺陷是分辨率降低和图像强度降低,并且这些伪像在距保护玻璃的距离超过约15微米时变得很明显。
利用浸没流体的主要原理是实现物镜的最大数值孔径,从而提供改进的衍射极限空间分辨率。然而,更实际的优点是使得不太可能发生球差。由于用于显微镜物镜的光学玻璃的典型折射率,目前油浸物镜可提供最高的最终光学性能。在理想的成像条件下,通过使用与物镜前透镜和保护玻璃的折射率完全匹配的浸油可以实现最佳的光学性能。用水或具有较高或较低折射率的另一种浸没介质代替会降低该性能。但是,在不理想的情况下,在其中球差成为图像质量的限制因素的情况下,使用低折射率浸没液通常可能是有利的。将水介质引入油浸系统的光路中会增加球面像差,而采用水浸物镜所获得的好处仅是通过在当前成像条件下降低最显着和极限像差而得出的。
在活细胞和组织研究中,应用最广泛的方法之一是常规的宽视野荧光显微镜,其中使用高数值孔径油浸物镜观察紧邻盖玻片的相对平坦的标本。固定的组织切片或细胞嵌入具有不同于盖玻片的(较低)折射率的水性介质中。离开物镜的光穿过浸没油和盖玻片(设计上具有相同的折射率),并在遇到与嵌入介质的界面时发生折射,而折射率不同。折射率界面处的光偏差的净效应取决于观察平面的深度。在玻璃盖附近的焦平面上,
共焦和多光子显微镜等技术的引入和发展,通过研究厚得多的标本,以及对大体积标本进行三维可视化(通常涉及某种形式的图像去卷积或重建),已改变了传统条件下的成像要求。对样品内较大深度的光学部分成像的功能,使之远离与盖玻璃的接触,改变了系统的光学性能,因为光线会穿过设计所不希望的介质。光学校正针对与盖玻片相邻的均匀介质中的光分布进行了优化,尽管实际上,观测体积可能相距一些距离,折射率差和焦平面与玻璃的距离会极大地影响光的分布。产生的偏差会导致分辨率和信号强度的损失,以及焦点偏移。在1980年代中期,Stefan W. Hell等人注意到,当观察平面从标本玻璃界面移至标本的较深区域时,分辨率和图像亮度会降低。旨在解释共聚焦荧光图像的大量研究。
在图2中是比较光学情况的量,油浸物镜函数理想地(图2(a)),以及用于该浸油和严重的图像像差的水性介质中的结果之间的折射率不匹配(图2(b ))。对通过水介质区域与盖玻片隔开的样品平面进行成像,代表了厚生物样品研究中普遍存在的光学条件,遇到的图像劣化是采用水浸物镜的主要诱因。请注意,水浸物镜是从不同的水浸物镜,不与玻璃罩一起使用,而是将前透镜直接浸入样品介质中。
当样品直接与盖玻片接触时,就可以确定使用理想的消色差平场油镜的理想光学环境,从而确保从样品表面焦点到整个光路的均匀折射率(标称值为1.515)通过盖玻片进入浸油,并继续进入物镜的前部元件。在这种配置下(图2(a)),不会发生光波的折射,并且会利用物镜的整个数值孔径。此外,可以很好地控制镜头像差,并且所产生的图像具有最大的分辨率和对比度。
当将焦平面调整到细胞或组织部分的较深区域时,或者如果标本位于生理介质层下方,则光路会穿过标本(含水生理盐水)之间的折射率界面或梯度(n = 1.35)。解决方案(n = 1.33)和浸没玻璃的油-物组合(n = 1.515)。光线的折射在每个折射率界面处发生,结果是无法实现物镜的完整数值孔径,并且当物镜偏离其设计标准时会引入光学像差。折射会导致光线从水性介质进入高折射率玻璃时朝向光轴弯曲,从而有效地限制了物镜的最大数值孔径(请参见图2(b))。例如,将水引入使用1.4数值孔径物镜的油浸系统的光路中,会将有效数值孔径减小到最大值1.33。当通过水或生理介质层观察样本时,油浸物镜无法满足其设计性能,并且引入的球差会在图像中产生严重的不利影响。随着焦点距离离防护玻璃的下表面越来越远,这些影响会随着样品的深度成比例地增加。
在涉及利用油浸对活细胞成像的研究中,球差成为图像质量的限制因素。在细胞材料或细胞周围的水性介质中,像差随成像深度的成比例增加表现为强度和对比度降低,从而阻止了较小样本细节的分辨。实验已经证明,这种变形的影响足以引起海洋生物中标本结构(例如纤毛)的误解。尽管可以对点扩展函数(PSF)进行精确的测量,但是使用反卷积方法来数学补偿这种性质的失真是一种可能的解决方案。)是必需的,并且当点扩展函数在轴向和横向上都变形时,实现此问题将变得很困难。
在所有用于活细胞和其他非嵌入式生物标本研究的三维显微镜方法中,由于标本的折射率相对较低,因此点扩散函数中的像差非常重要。点扩散函数畸变在共聚焦显微镜中可能具有特别重要的意义,因为所引起的球差会削弱共聚焦显微镜的主要优势:消除散焦信息以增加xy平面的对比度和有效分辨率,并创建高分辨率xyz光学部分。在一定程度上,折射率失配是图像像差的原因,采用水浸物镜应大大增强低折射率样品的高分辨率,深度依赖成像。
在三维样本的显微镜检查中,图像数据可以被认为是包含像差或已被三维点扩散函数模糊的样本的表示。如果要使用反卷积方法从异常图像数据中重建对象,则需要精确确定点扩散函数。直接测量和计算方法都被用来描述点扩展函数,并且每种技术都有优点和缺点。当对使用油浸系统和水浸获得的数据进行实验比较时,使用测量的或计算的三维点扩展函数,在水浸系统中与焦平面有关的球面像差会显着降低。
图3显示了样品和浸没物镜(油和水)之间发生的成像射线轨迹的比较,以及xz的几何模型预测在水性介质中界面下方100微米处的荧光珠的图像。在图3(a)中,左侧的球体代表荧光珠的实际形状,而右侧的细长形状是通过油浸物镜成像而获得的印象。从珠子到油浸物镜(图3(b))和水浸物镜(图3(c))的前透镜的光线轨迹(图3中的黄色箭头)揭示了折射率不匹配如何掩盖实际样品的细节几何。在水性介质中,如图3(b)所示,当用油浸物镜成像时,珠子会变形为明显的细长椭圆形,而在使用水浸物镜时则保持球形,如图3(c)所示。)。实际样本由蓝色球体表示,外观图像由红色椭圆形或红色球体表示。
为了使三维图像数据成为真实样本的可靠表示(通过点扩展函数进行卷积),必须知道点扩展函数不会随轴向或横向焦点移动而变化。实际上,如果不满足设计物镜的条件,则情况可能并非如此。物镜的设计标准取决于样品的折射率,浸没介质以及保护玻璃的厚度和折射率。当样本和浸没介质的折射率匹配时,对于任何样本厚度,像差都会最小化,因为聚焦到样本介质中更深的平面会结合该介质中增加的光程长度和补偿性减小的浸没介质中的路径长度。载物台位移的两种作用相互抵消,从而使透镜系统的物镜和图像共轭表面重合,这是无像差成像所需的。因此,油浸物镜在对嵌入式标本成像时可以满足设计要求,但在对低折射率生物标本成像时,沿光轴的点扩展函数会表现出明显的偏差。在点扩展函数轴向变化的系统中,必须为三维堆栈中的每个图像平面计算点扩展函数,这需要复杂的模型来计算方差,并且需要更多的图像处理算法比反卷积功能强大。
任何浸没物镜的基本功能之一是增加系统的数值孔径,而该功能需要在其前透镜和标本之间添加除空气之外的其他流体。在使用油浸物镜时,起初看来盖玻片的厚度几乎没有什么意义,因为其折射率近似等于浸入流体的折射率。只要将标本安装在加拿大香脂或其他折射率与保护玻璃相似的介质中,这基本上是正确的。当将样品放置在诸如生理盐水之类的水性介质中时,其折射率与玻璃和浸油的折射率明显不同,光学性能会发生很大变化。所以,由于相对于焦平面的点扩散函数不对称,即使是通过10微米厚的水层进行聚焦,也会引入严重的像差(请参见图2和3)。除非所观察的样品区域与盖玻片直接接触,否则用于校正油浸物镜中透镜像差的光学假设是无效的。
随着研究人员更加清楚油浸物镜的这种行为,并且认识到在活细胞和组织研究中新兴的三维成像技术所受到的限制,一些显微镜制造商开始引入校正良好的高数值孔径水1990年代中期的沉浸式物镜。通过平面复消色差校正和大约1.2的数值孔径,水浸物镜的数值孔径值比同类油浸透镜要低一些,但是增加了至关重要的功能,可以通过200微米级别的水层进行高分辨率成像厚度。尽管水浸物镜的主要优点是在低折射率生物标本的厚制剂中提高了成像能力,使用水作为浸没液可带来其他实际好处。水没有固有的荧光使图像解释复杂化,几乎没有污染生理溶液的风险,水溶液不需要特殊的清洁方法,并且成本可以忽略不计。
高度校正的60倍平场消色差水尼康生产的浸没物镜是根据井上伸也首次提出的规格开发的,代表了其他制造商引入的类似物镜。物镜具有1.2的数值孔径和290微米的工作距离,使其有可能在水性样品中的此深度成像焦平面(见图1)。校正环可调节,以适应0.15到0.18毫米范围内的保护玻璃厚度,这是消除球差的一项重要功能。此外,该物镜还具有从近紫外光到红色可见光谱区域的高透射率和色差校正功能,DIC)技术。
如前所述,均匀浸没将确保光线在到达样品物镜的第一个透镜元件的后表面之前不会在通过样品和浸没介质的路径上发生偏转。如果消除了折射率界面,则可以设计一个物镜在整个聚焦范围内实现衍射极限性能。将低折射率样品浸入水中消除了浸入油具有较高折射率的问题,但是如果将水浸物镜与盖玻片一起使用,则会引入玻璃和水之间的折射率差异(图2( C))。防护玻璃的精确折射率和厚度对于实现最大分辨率至关重要,这也是许多水浸物镜都包括用于补偿防护玻璃变化特性的校正环的原因。光学塑料也可用于减少安装介质和浸入水之间的折射率失配。折射率在1.35到1.4之间的塑料盖“玻璃”应显着减小从水样通过水介质到物镜前透镜的成像光线的折射角。
许多研究人员已经对水浸物镜进行了实际评估,他们采用了不同的方法来评估这种系统在某些应用中的优势。基于对球面像差对点扩散函数的影响的理论考虑,可以预测水浸比油浸技术在生物学研究中的明显优势,尤其是对于距盖板玻璃一定距离的标本平面而言。实验结果在很大程度上支持了理论上的预测,与油浸物镜的结果相比,表明了对水样品深部成像的显着提高。
通过对测试物镜进行成像并进行高度详细的成像,如上所述,与60倍(1.4数值孔径)平面复消色差油浸物镜相比,对60倍于1.2数值孔径的水浸平面复消色差物镜的性能进行了一项实验评估。硅藻在防护玻璃下方的不同距离处(请参见图4)。结果与理论预测一致:仅当试样直接与盖玻片接触时,油浸物镜才能产生具有出色分辨率和高对比度的图像,而当物镜物通过84微米水层成像时,其对比度会严重下降。当物镜样品与盖玻片接触时,与油浸式物镜相比,水浸式物镜产生的分辨率和对比度稍低,但是当将水层添加到成像路径时,图像质量保持基本不变。
与使用60x复消色差1.2数值孔径水浸物镜的结果相比,图4中显示的是用标准60x复消色差1.4数值孔径油浸物镜成像的恒星测试物镜的中心部分(图4(a)和4(b))。 (图4(c)和4(d))。在盖玻璃(厚度为170微米)和测试物镜之间,用水(图 4(b)和4(d))或不用水(图4(a)和4(c))制备样品。在图4(a)中,用油浸物镜捕获物镜图像,并且在测试物镜和盖玻片之间没有水。对比度在距中心2.3微米的半径处消失,这相当于大约0.2微米的间距。中央黑盘的直径为1.2微米,以提供尺寸参考。当使用相同的物镜在测试物镜和盖玻片之间用84微米的水对物镜成像时,对比度会严重降低,低于0.4微米的间距将变得不可见(图4(b))。相比之下,当测试物镜由水浸物镜成像时,在物镜和防护玻璃之间没有水的情况下,如果间距小于0.24微米,则对比度消失(图4(c)))。当在物镜和盖玻片之间放置84微米的水层(类似于上面讨论的油浸物镜)时,对比度仍然很高(图4(d)),并且不会损害水浸物镜的性能覆盖玻璃和测试物镜之间的额外水层。
通过由不同空间频率的等间隔的亮条和暗条组成的测试物镜的对比度传递函数图,可以说明对两个物镜性能的定量评估(图5)。)。对比度转移图说明了光学系统能够从物镜(样本)转移到图像的物镜对比度(百分比)。在给定的空间频率下保持物镜的完整对比度的图像将在图形上绘制为100%,表示系统完美的对比度传递。由于对比度在较高的空间频率下会变差,因此最终会在特定的行距处降低到零,这可以视为要评估的光学系统的分辨率的绝对极限。每个图都说明了在几种条件下产生的对比度传递函数:在保护玻璃和测试光栅之间没有水层,并且添加了不同的水层厚度。此外,对于相应数值孔径的无像差物镜,绘制了理论上计算出的对比度传递函数。对于水浸物镜,给出了最多153微米水的数据,而对于油浸物镜,给出的最大水厚度为50微米。
如在示出的图5中,水浸物镜提供对比度和分辨率的值几乎等同于理论极限,并保持当物镜试样和盖玻片之间,追加的80和153微米的水层,在所遇到的情况的模拟它的性能在水性材料(例如活细胞或组织)内部进行深层成像。相反,当仅用50微米的水覆盖物镜物进行测试时,油浸物镜的分辨率极限降低了50%,并且对比度大大降低。性能随着空间频率的增加而急剧下降。
进一步的评估表明,高数值孔径复消色差水浸物镜能够在水中深度为220微米的情况下获得高质量的图像,这是使用油浸物镜无法实现的壮举。其他研究对水浸物镜点扩展函数进行了测量,这些函数支持了所报告的测试物镜性能,并进一步说明了改进焦平面上方和下方的函数对称性的好处。测量结果表明,可以对与深度有关的畸变进行建模和校正,从而可以将镜头用于沿z轴的精确测量。轴用于确定垂直分辨率。物镜的点扩展函数在焦平面的上方和下方是对称的(表示最小的球差),这使其可以与为其数值孔径的物镜计算的理论轴向分辨率相匹配。与利用油浸物镜的相同技术相比,这种光学性能的一个整体优势是对应用于三维样本的图像去卷积方法的显着改进。此外,当在水性介质或组织中以大于约20微米的深度成像时,基本消除了水浸物镜中的球差,从而改善了信号收集和图像亮度。
共焦方法的主要优点包括可控地限制焦平面厚度以进行光学切片,以及通过消除来自像平面外部的信号产生的眩光来提高分辨率和对比度。这两个因素结合起来允许xz扫描图像可提供厚样本的三维表示。球差限制了这些能力,并且当样品的折射率不同于浸没流体的折射率时,球差会随样品的深度成比例地增加。如果将油浸物镜与含水样本一起使用,则在保护玻璃下方的每一个微米聚焦深度处都会增加大约三分之一波的球差。少量的球差会引起点扩展函数的扩展和轴向分辨率的等效损失(请参见图6)。如果聚焦到低折射率样品上超过约10微米,则会累积大量像差,这会导致点扩散功能明显模糊,并降低图像的对比度。如果不能消除球差,则当在距防护玻璃约15微米以上的深度成像时,清晰度和对比度损失将超出共焦方法的任何优势。当对含水样本(例如活细胞)成像时,使用水浸物镜可为消除这些问题提供实质性的好处。最近,有机硅浸没物镜 在活细胞成像中也很流行,其折射率为n = 1.41,类似于活细胞和组织的成分。
由不匹配的折射率引起的球差可将光学数据扭曲到一定程度,从而可能发生形态学错误解释和尺寸测量错误。三维显微镜中标本的众所周知的变形表现为沿光轴(z轴)的特征伸长。已经采用了多种技术来测量和模拟效果,但是在幅度和确切原因上都存在矛盾。但是,该伪像已通过实验验证,并且已知会产生物体的轴向伸长,从而使其看起来像是其实际大小的三倍(图3)。异常取决于浸入条件,并且被认为是由以下事实引起的:轴向平台移动不会导致焦点位置的直接等效位移。估计距离和体积时会出现错误,这对所有形式的三维定量显微镜都具有重大影响。已证明在畸变效应中起作用的因素包括嵌入或周围介质与浸没流体之间的折射率失配,样本大小,与盖玻片的距离以及物镜的数值孔径。对低指数样本(例如生物材料)进行成像时,使用水浸会减轻这种影响,尽管在某些条件下不会完全消除。
除了发生折射率不匹配时的尺寸缩放错误外,点扩展函数的相同失真也会引起对信号强度的显着影响。在许多共聚焦系统配置中,在整个样本中扫描的照明针孔也被用在检测路径中,通过相同的机制进行扫描,目的是排除来自检测器的所有散焦光。当使用油浸物镜对样品进行深层成像时,球面像差的严重程度会引起足够的焦点偏移,从而使样品中的荧光团发出的许多光无法通过针孔到达检测器。因此,在从共聚焦检测器之前,丢失了从标本从盖玻片上移出的样品区域的大部分发射信号。
已发表的理论和实验分析证实,当使用1.3数值孔径的油浸物镜时,在水性介质中深20微米的荧光平面成像会导致检测到的峰值强度比在10-千分尺深度。图6说明了此概念,该图显示了高数值孔径油浸物镜的共聚焦点扩散函数的轮廓图,以及它们在水中几个成像深度时的相应轴向响应。理想点扩散函数(无球差)显示在图6(a)中,而成像深度为5、10、15和20微米的水介质成像图6(b)-6(e), 分别。通过应用高数值孔径的水浸物镜来减少或消除球差是在高分辨率荧光显微镜中保持足够信号水平的有效方法。
在共聚焦技术中使用水浸物镜的一个经常被忽略的优点是,与大多数浸油相比,水的粘性要低得多,因此,当物镜和样品制备相对位移时,在聚焦过程中,盖玻片上的力(表面张力)较小。对彼此。因此,在获取共焦z系列期间改变焦点时,防护玻璃不太可能弯曲,也可能使样品移位。将光学切片过程中所需的重复重新聚焦过程中的标本移动减至最小,可以从图像堆栈中获得更清晰,更有意义的三维重构。尼康还释放了复消色差物镜,从而减少了用于共焦成像的平场计划校正的必要性带有多个高NA和长工作距离的水浸镜头。
最近,实验证明了水浸物镜适用于多物镜技术,例如4Pi共聚焦显微镜和theta显微镜。在4Pi共聚焦显微镜中获得的轴向分辨率类似于近场光学技术,并且是通过结合来自两个相对的高光圈物镜的相干聚焦球面波阵面来实现的。两个球面波阵面的相干相加导致沿光轴的孔径增加,并且点扩展函数最小值最小。该技术产生了迄今为止获得的最高的三维远场分辨率,结合图像重建,该分辨率约为100纳米。
在开发高数值孔径的水浸物镜之前,对油浸的依赖已将4Pi共聚焦显微镜局限于安装在甘油上的标本。甘油(1.47)的折射率足够接近浸油(1.51)的折射率,因此轴向扫描过程中相移所需的补偿最少。细胞研究的大部分涉及基于甘油的封固剂,并且至少一个制造商已经开发出高数值孔径的甘油浸没物镜,以最大程度地减少由油-甘油折射率不匹配导致的数据降解。该透镜设计用于石英保护玻璃(折射率1.46),并配有像差校正环,可容纳72%至88%的甘油浓度。该物镜已成功应用于三维荧光显微镜检查,并应简化甘油安装标本的4Pi显微镜检查。最近,尼康开发了甘油物镜,用于清晰的组织成像。
但是,如果在水或生理溶液中进行深度成像,则严重的球差和相移将不允许在油浸或甘油浸入物镜下进行4Pi显微镜检查。因此,油浸4Pi方法不适用于活细胞成像。为在常规共聚焦和多光子成像中由折射率不匹配畸变引起的球差最小化而开发的高孔径水浸物镜,在应用于活细胞研究的4Pi方法中具有相同的优势。尽管水浸物镜的数值孔径比同类油浸透镜低,但多项研究表明,它们具有良好的点扩散功能特性,